曾雅婷, 熊 桃, 柏自琴, 譚振華, 李紅葉*

(1. 浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所, 杭州 310058; 2. 貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)科學(xué)研究所, 貴陽(yáng) 550006; 3. 湖南省宜章縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局, 郴州 424200)

柑橘黑點(diǎn)病又名砂皮病和樹(shù)脂病,主要由柑橘間座殼Diaporthecitri引起,是危害柑橘的主要真菌性病害之一,對(duì)果實(shí)外觀品質(zhì)和銷(xiāo)售價(jià)格影響很大。目前柑橘黑點(diǎn)病的主要防治措施是剪除銷(xiāo)毀枯枝,以減少侵染來(lái)源,和噴藥保護(hù)。但由于果園可源源不斷產(chǎn)生枯枝,而勞動(dòng)力成本有限,很難通過(guò)徹底剪除銷(xiāo)毀枯枝,實(shí)現(xiàn)病害控制。因此，針對(duì)目前我國(guó)柑橘的栽培現(xiàn)狀以及黑點(diǎn)病的發(fā)生規(guī)律,噴藥保護(hù)仍然是當(dāng)前控制柑橘黑點(diǎn)病的必要手段。代森錳鋅是防治柑橘黑點(diǎn)病的有效藥劑,具有價(jià)格便宜、使用方便、防治效果好等優(yōu)點(diǎn),在柑橘生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用[1]。但有研究指出長(zhǎng)期接觸代森錳鋅會(huì)導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元功能受損,如使用6 μmol/L Mn-EBDC(代森錳鋅主要活性成分乙基二硫代氨基甲酸錳)處理多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞,7 d后不僅產(chǎn)生明顯的神經(jīng)毒性,還抑制了胰凝乳蛋白酶和谷氨酰肽酶的活性,Mn-EBDC也能夠引起鼠類(lèi)的選擇性黑紋狀體神經(jīng)變性,可能與帕金森等神經(jīng)性退化疾病有關(guān)[2]。

以作物為“柑橘”,防治對(duì)象為“樹(shù)脂病/砂皮病/黑點(diǎn)病”在中國(guó)農(nóng)藥信息網(wǎng)(http:∥www.icama.org.cn/)上搜索可知,除代森錳鋅以及代森錳鋅的復(fù)配劑外,目前在我國(guó)登記用于柑橘黑點(diǎn)病防治的藥劑有氟啶胺、氟硅唑、克菌丹、咪鮮胺和吡唑醚菌酯,以及一些復(fù)配劑如苯甲·克菌丹、唑醚·戊唑醇和肟菌·戊唑醇等。防效對(duì)比試驗(yàn)表明,克菌丹、氟硅唑、咪鮮胺的田間防治效果均不及代森錳鋅[1,3-4]。雖然離體條件下氟啶胺對(duì)黑點(diǎn)病菌具有強(qiáng)烈的抑制效果,但田間防治效果不及代森錳鋅,而且成本遠(yuǎn)高于代森錳鋅[5]。因此必需篩選和引入一些低毒高效殺菌劑,取代代森錳鋅或與代森錳鋅交替使用。

嘧菌酯(azoxystrobin)是近年發(fā)展起來(lái)的一種新型的甲氧基丙烯酸酯(QoI)類(lèi)殺菌劑,通過(guò)作用于病原真菌線粒體電子傳遞鏈的復(fù)合體Ⅲ,與細(xì)胞色素b(cytb)的Qo位點(diǎn)結(jié)合,阻礙細(xì)胞色素b和c1間的電子傳遞,干擾細(xì)胞能量形成而起到殺菌作用[6]。嘧菌酯的殺菌譜廣,不但能夠抑制菌絲生長(zhǎng),還具有抑制產(chǎn)孢的作用,安全低毒,而且與三唑類(lèi)、苯并咪唑類(lèi)、二甲酰亞胺類(lèi)、苯酰胺類(lèi)等殺菌劑沒(méi)有交互抗性[7]。嘧菌酯在美國(guó)被登記用于柑橘黑點(diǎn)病的防治[8],在我國(guó)已被登記用于柑橘瘡痂病(致病菌為Elsino?fawcettii)和炭疽病(致病菌為Colletotrichumgloeosporioides)的防治,與之作用機(jī)制相同的吡唑醚菌酯最近登記用于柑橘黑點(diǎn)病的防治(中國(guó)農(nóng)藥信息網(wǎng)http:∥www.icama.org.cn/),農(nóng)藥廠家也開(kāi)始推薦嘧菌酯在柑橘黑點(diǎn)病防治中使用。

然而,嘧菌酯和吡唑醚菌酯都是單作用位點(diǎn)殺菌劑,靶標(biāo)位點(diǎn)發(fā)生自發(fā)性突變的頻率較高,在高選擇壓力下,容易誘導(dǎo)抗性群體頻率上升[9]。自1996年QoI類(lèi)殺菌劑用于禾谷類(lèi)作物后,2年內(nèi)就發(fā)現(xiàn)了抗QoI的小麥白粉病菌菌系[10],之后其他病菌也出現(xiàn)了抗藥性問(wèn)題。如孟潤(rùn)杰等報(bào)道了河北黃瓜霜霉病菌Pseudoperonosporacubensis對(duì)嘧菌酯的抗性頻率達(dá)到了100%[11]。因此,在應(yīng)用此類(lèi)殺菌劑之前,測(cè)定黑點(diǎn)病菌種群對(duì)嘧菌酯的敏感基線對(duì)今后監(jiān)測(cè)病菌種群抗藥性的發(fā)展和科學(xué)用藥具有現(xiàn)實(shí)意義。為此,本研究對(duì)來(lái)自浙江、湖南、江西、貴州4個(gè)柑橘產(chǎn)區(qū)黑點(diǎn)病菌群體對(duì)嘧菌酯的敏感性展開(kāi)研究,確定其敏感基線,以期為嘧菌酯的科學(xué)使用及抗藥性控制方法提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

2019年從湖南、江西和貴州柑橘種植區(qū)采集柑橘葉片、果實(shí)和枝干的黑點(diǎn)病樣本，經(jīng)組織分離獲得43株柑橘黑點(diǎn)病菌菌株，其中17株來(lái)自湖南湘西(11株來(lái)自 ‘椪柑’， 6株來(lái)自 ‘紐荷爾臍橙’)，14株來(lái)自貴州從江(10株來(lái)自 ‘椪柑’， 4株來(lái)自 ‘紐荷爾臍橙’)，12株來(lái)自江西宜春(9株來(lái)自 ‘椪柑’， 3株來(lái)自 ‘紐荷爾臍橙’)。浙江產(chǎn)區(qū)的23個(gè)菌株為本實(shí)驗(yàn)室保存，其中的12個(gè)菌株來(lái)源于浙江衢州的‘椪柑’，11個(gè)菌株來(lái)源于浙江臺(tái)州的‘本地早’和‘溫州蜜柑’。

1.2 供試藥劑與培養(yǎng)基

98%嘧菌酯原藥由江蘇如東眾意化工有限公司提供,99%水楊肟酸(salicylhydroxamic acid,SHAM)購(gòu)自江蘇艾康生物醫(yī)藥研發(fā)有限公司。試驗(yàn)用的培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)和水瓊脂培養(yǎng)基(WA)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1柑橘黑點(diǎn)病菌的分離和鑒定

取采自湖南、江西、貴州的‘紐荷爾臍橙’和‘椪柑’帶典型黑點(diǎn)病的葉片、果實(shí)或枝干樣品,采用常規(guī)的組織分離法分離菌株[12]。所有菌株經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察初步鑒定為Diaporthe屬后,進(jìn)一步使用柑橘黑點(diǎn)病菌特異性引物Dc-F(5′-CCCTCGAGGCATCATTAC-3′)和Dc-R(5′-ATGTTGCAGATGGTCAAATGG-3′)(待發(fā)表)進(jìn)行菌株的鑒定。所有經(jīng)鑒定為柑橘黑點(diǎn)病菌的菌株保存于4℃條件下備用。

1.3.2含藥培養(yǎng)基的制備

將嘧菌酯溶于無(wú)水乙醇,配制成100 μg/mL母液,再用無(wú)水乙醇稀釋成不同濃度梯度藥液,取適量藥液加入約50℃的PDA培養(yǎng)基中,充分混勻,配成系列濃度梯度的含藥培養(yǎng)基,以未加藥培養(yǎng)基作為對(duì)照。在配制含藥培養(yǎng)基時(shí),還需要在各濃度(包括空白對(duì)照)PDA培養(yǎng)基中加入100 μL SHAM(使用甲醇溶解配制使其終深度為100 μg/mL),以抑制病原真菌的旁路氧化作用[13]。

1.3.3菌絲生長(zhǎng)對(duì)嘧菌酯的敏感性

使用菌絲生長(zhǎng)抑制法測(cè)定不同地區(qū)柑橘黑點(diǎn)病菌對(duì)嘧菌酯的敏感性,嘧菌酯的質(zhì)量濃度分別設(shè)為0、0.156 25、0.312 5、0.625、1.25、2.5、5、10、25 μg/mL。菌株在PDA中培養(yǎng)7 d左右,在菌落邊緣打取0.5 cm菌碟,接種到含不同濃度嘧菌酯及100 μg/mL SHAM的PDA中,每個(gè)濃度重復(fù)3次,25℃培養(yǎng)7 d后使用十字交叉法測(cè)量菌落直徑,按公式(1)計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率。

1.3.4孢子萌發(fā)對(duì)嘧菌酯的敏感性

待黑點(diǎn)病菌在PDA上培養(yǎng)30 d,產(chǎn)孢后收集分生孢子,用無(wú)菌水配制成1×105個(gè)/mL的孢子懸浮液,在含有100 μg/mL SHAM的WA培養(yǎng)基中分別加入濃度為0、0.012 5、0.025、0.05、0.1、0.2 μg/mL的嘧菌酯,配制成系列濃度梯度的水瓊脂平板。取80 μL孢子懸浮液分別均勻涂布在平板上,于25℃培養(yǎng)12 h后,在顯微鏡下觀察并記錄孢子萌發(fā)情況,芽管長(zhǎng)度超過(guò)孢子寬度者視為萌發(fā)。每個(gè)藥劑濃度取5個(gè)不同視野,每個(gè)視野隨機(jī)檢測(cè)至少20個(gè)孢子,每個(gè)處理3次重復(fù)。按公式(3)計(jì)算孢子萌發(fā)抑制率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

將藥劑濃度換算成濃度對(duì)數(shù)(X),抑制率換算成抑制幾率值(Y),使用DPS 9.01統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算嘧菌酯對(duì)柑橘黑點(diǎn)病菌的毒力回歸方程Y=a+bX、相關(guān)系數(shù)及有效中濃度EC50。

通過(guò)Excel軟件對(duì)測(cè)定的各菌株EC50進(jìn)行分組。采用公式(4)確定組距,以a為下限,統(tǒng)計(jì)各組的菌株數(shù);同時(shí)以EC50為X軸,菌株數(shù)為Y軸,得到柑橘黑點(diǎn)病菌種群對(duì)嘧菌酯的敏感性分布圖。使用Excel進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn),當(dāng)EC50處于正態(tài)分布時(shí),菌絲生長(zhǎng)抑制法和孢子萌發(fā)抑制法測(cè)得的EC50平均值即可分別作為它們對(duì)嘧菌酯的敏感性基線。

菌絲生長(zhǎng)抑制率=

(1)

(2)

孢子萌發(fā)抑制率=

(3)

組距=(b-a)/m

(4)

(4)式中,a:略小于樣本數(shù)據(jù)的最小值,b:略大于樣本數(shù)據(jù)的最大值,m:分組數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 柑橘黑點(diǎn)病菌菌株的分離

分離純化并使用特異性引物Dc-F和Dc-R對(duì)菌株進(jìn)行鑒定后,共獲得柑橘黑點(diǎn)病菌菌株43株,其中湖南17株,江西12株,貴州14株,由本實(shí)驗(yàn)室保存的來(lái)自浙江柑橘產(chǎn)區(qū)的柑橘黑點(diǎn)病菌菌株23株。所有菌株將用于后續(xù)對(duì)殺菌劑的敏感性測(cè)定。

2.2 不同地區(qū)柑橘黑點(diǎn)病病菌種群菌絲生長(zhǎng)對(duì)嘧菌酯的敏感性

使用菌絲生長(zhǎng)抑制法測(cè)定柑橘黑點(diǎn)病菌對(duì)嘧菌酯的敏感性,發(fā)現(xiàn)4個(gè)省份的菌株敏感性存在一定差異,EC50在0.057 6～0.709 μg/mL(表1)。其中,浙江的菌株敏感性最高,EC50平均值為0.197 9 μg/mL;湖南的菌株敏感性最低,EC50平均值為0.279 μg/mL,約為浙江的1.41倍。

表1 不同省份柑橘黑點(diǎn)病病菌種群菌絲生長(zhǎng)對(duì)嘧菌酯的敏感性1)Table 1 Sensitivity of Diaporthe citri population from different provinces to azoxystrobin in terms of mycelial growth

2.3 黑點(diǎn)病菌種群菌絲生長(zhǎng)對(duì)嘧菌酯的敏感性頻次分布

通過(guò)采用菌絲生長(zhǎng)抑制法對(duì)4個(gè)省份的66個(gè)柑橘黑點(diǎn)病菌菌株進(jìn)行敏感性測(cè)定發(fā)現(xiàn),EC50最高為0.709 μg/mL(Y=0.752 5X+5.112 4,R2=0.974 1),最低為0.057 6 μg/mL(Y=2.354 3X+7.918 2,R2=0.860 7),最高值比最低值高11.31倍,平均EC50為(0.228 5±0.113 8)μg/mL。將EC50劃分為10組,設(shè)0.05 μg/mL為下限,0.75 μg/mL為上限,從而求得組距為0.07 μg/mL。統(tǒng)計(jì)各組的菌株數(shù),得到菌株敏感性頻次分布圖(圖1),發(fā)現(xiàn)在測(cè)定的菌株中,EC50主要集中分布在0.12～0.33 μg/mL,小于0.5 μg/mL,表明嘧菌酯對(duì)柑橘黑點(diǎn)病菌的菌絲生長(zhǎng)有明顯的抑制活性。敏感性頻次分布曲線為單峰連續(xù)曲線,符合正態(tài)分布。因此可將其平均EC50作為柑橘黑點(diǎn)病菌菌絲生長(zhǎng)對(duì)嘧菌酯的敏感性基線。

圖1 柑橘黑點(diǎn)病菌種群菌絲生長(zhǎng)對(duì)嘧菌酯的敏感性頻次分布Fig.1 Sensitivity frequency distribution of Diaporthe citri population to azoxystrobin in terms of mycelial growth

根據(jù)FAO[14]標(biāo)準(zhǔn),抗性突變體的EC50比敏感菌株高5～10倍,可以將柑橘黑點(diǎn)病菌菌絲生長(zhǎng)對(duì)嘧菌酯的抗性水平按以下標(biāo)準(zhǔn)劃分:1.142 5≤EC50<5.712 5 μg/mL為低抗(LR);5.712 5≤EC50<28.562 5 μg/mL為中抗(MR);EC50≥28.562 5 μg/mL為高抗(HR)。根據(jù)抗性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn),在菌絲生長(zhǎng)速率的測(cè)定中,未出現(xiàn)抗嘧菌酯的柑橘黑點(diǎn)病菌菌株。

2.4 不同省份柑橘黑點(diǎn)病菌種群孢子萌發(fā)對(duì)嘧菌酯的敏感性

由表2可知,不同柑橘產(chǎn)區(qū)菌株孢子萌發(fā)對(duì)嘧菌酯的敏感性存在一定差異。其中,江西菌株敏感性最高,EC50平均值為0.023 μg/mL;貴州菌株敏感性最低,EC50平均值為0.028 9 μg/mL,約為江西的1.26倍。

表2 不同省份柑橘黑點(diǎn)病菌種群孢子萌發(fā)對(duì)嘧菌酯的敏感性Table 2 Sensitivity of Diaporthe citri population from different provinces to azoxystrobin in terms of conidial germination

2.5 黑點(diǎn)病菌種群孢子萌發(fā)對(duì)嘧菌酯的敏感性頻次分布

采用孢子萌發(fā)抑制法對(duì)66株柑橘黑點(diǎn)病菌進(jìn)行敏感性測(cè)定發(fā)現(xiàn),嘧菌酯對(duì)柑橘黑點(diǎn)病菌孢子萌發(fā)的EC50均低于0.1 μg/mL,最高為0.052 7 μg/mL(Y=1.207X+6.542 6,R2=0.984 2),最低為0.011 4 μg/mL(Y=4.895 3X+14.517,R2=0.894 2),平均EC50為(0.025 6±0.006 9)μg/mL,最高值比最低值高3.63倍。將EC50劃分為10組,設(shè)0.01 μg/mL為下限,0.06 μg/mL為上限,從而求得組距為0.005 μg/mL。統(tǒng)計(jì)各組的菌株數(shù),制作黑點(diǎn)病菌菌株敏感性頻次分布圖(圖2)。測(cè)定的菌株中,EC50分布主要集中在0.025～0.03 μg/mL,可見(jiàn)嘧菌酯對(duì)柑橘黑點(diǎn)病菌的孢子萌發(fā)也有很強(qiáng)的抑制活性。敏感性頻次分布曲線為連續(xù)單峰曲線,符合正態(tài)分布。因此可將其平均EC50[(0.025 6±0.006 9) μg/mL]作為柑橘黑點(diǎn)病菌孢子萌發(fā)對(duì)嘧菌酯的敏感性基線。

圖2 柑橘黑點(diǎn)病菌種群孢子萌發(fā)對(duì)嘧菌酯的敏感性頻次分布Fig.2 Sensitivity frequency distribution of Diaporthe citri population to azoxystrobin in terms of conidial germination

同理,根據(jù)FAO[14]標(biāo)準(zhǔn),可將柑橘黑點(diǎn)病菌孢子萌發(fā)對(duì)嘧菌酯的抗性水平按以下標(biāo)準(zhǔn)劃分: 0.128≤EC50<0.64 μg/mL為低抗(LR),0.64≤EC50<3.2 μg/mL為中抗(MR),EC50≥3.2 μg/mL為高抗(HR)。根據(jù)抗性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn),在孢子萌發(fā)的測(cè)定中,未出現(xiàn)抗嘧菌酯的柑橘黑點(diǎn)病菌菌株。

3 結(jié)論與討論

使用藥劑防治植物病害具有使用方便、見(jiàn)效快等優(yōu)點(diǎn),但是頻繁使用同一作用機(jī)制的殺菌劑容易誘導(dǎo)病原菌對(duì)該類(lèi)殺菌劑產(chǎn)生抗性,從而使得防治效果大為降低甚至喪失。及時(shí)監(jiān)測(cè)病菌種群抗性發(fā)展動(dòng)態(tài),調(diào)整用藥方案,是病害得以有效控制的前提,而建立病原菌種群對(duì)殺菌劑的敏感性基線是進(jìn)行抗藥性監(jiān)測(cè)的基礎(chǔ)[15]。Mondal等[16]采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定了美國(guó)柑橘黑點(diǎn)病菌對(duì)嘧菌酯的敏感性,發(fā)現(xiàn)嘧菌酯對(duì)柑橘黑點(diǎn)病菌有很強(qiáng)的抑制作用,并建立了病菌種群對(duì)嘧菌酯的敏感性基線,其ED50為0.08 μg/mL。本研究分別采用菌絲生長(zhǎng)抑制和孢子萌發(fā)抑制法測(cè)定了來(lái)自湖南、江西、貴州和浙江的柑橘黑點(diǎn)病菌種群對(duì)嘧菌酯的敏感性,建立了我國(guó)黑點(diǎn)病菌種群對(duì)嘧菌酯的敏感性基線,發(fā)現(xiàn)中國(guó)柑橘黑點(diǎn)病菌種群對(duì)嘧菌酯也具有很高的敏感性,其抑制菌絲生長(zhǎng)和分生孢子萌發(fā)的敏感性基線(EC50)分別為0.228 5 μg/mL和0.025 6 μg/mL,可見(jiàn)不同地理種群菌株對(duì)嘧菌酯的敏感性存在差異[16]。敏感基線的建立為將來(lái)監(jiān)測(cè)我國(guó)柑橘黑點(diǎn)病菌種群對(duì)嘧菌酯等QoI類(lèi)殺菌劑的抗性奠定了基礎(chǔ)。

黑點(diǎn)病菌侵入柑橘果實(shí)、葉片和枝梢后很快誘導(dǎo)寄主的防衛(wèi)反應(yīng),分泌植保素6,7-二甲氧基香豆素(6,7-dimethoxy coumarin),受侵染細(xì)胞及其周?chē)倭考?xì)胞快速死亡,外圍細(xì)胞增生,在病健組織間形成周皮,限制病菌的擴(kuò)展,保護(hù)健康組織的正常生理活動(dòng)[17]。研究發(fā)現(xiàn)一些內(nèi)吸性殺菌劑,如苯菌靈和腈苯唑在病菌侵染后施用很難發(fā)揮其治療作用,因此黑點(diǎn)病的防治應(yīng)注重預(yù)防,選擇在病菌侵染前能抑制病原菌孢子萌發(fā)的藥劑其防治效果更佳[18]。嘧菌酯是一種兼具保護(hù)和治療作用的QoI類(lèi)殺菌劑,殺菌譜廣,在美國(guó)已被登記用于柑橘黑點(diǎn)病的防治[8],本研究結(jié)果表明,我國(guó)柑橘黑點(diǎn)病菌種群對(duì)嘧菌酯敏感,可登記用于黑點(diǎn)病的防治。

雖然QoI殺菌劑的殺菌譜廣,與環(huán)境相容良好[7],但因其作用位點(diǎn)單一,病菌極易對(duì)該類(lèi)藥劑產(chǎn)生抗性[9-11]。因此,本研究所建立的敏感基線可為將來(lái)監(jiān)測(cè)柑橘黑點(diǎn)病菌種群對(duì)嘧菌酯敏感性的變化動(dòng)態(tài),及時(shí)調(diào)整用藥方案奠定基礎(chǔ),同時(shí)建議使用嘧菌酯防治柑橘黑點(diǎn)病時(shí)和其他不同作用機(jī)制的殺菌劑輪換使用。