韋 吉, 欒宏瑛, 王薈潔, 劉 晶, 王洪洋*, 陳愛娥

(1. 云南省馬鈴薯生物學重點實驗室, 云南省高校馬鈴薯生物學重點實驗室, 云南師范大學, 昆明 650500; 2. 云南師范大學教務處, 昆明 650500)

馬鈴薯Solanumtuberosum起源于南美洲安第斯山山脈一帶,是解決全球糧食短缺和消除貧困的重要作物。然而在生長過程中,馬鈴薯會受到各種各樣病蟲的危害,其中由卵菌中致病疫霉Phytophthorainfestans引起的晚疫病是馬鈴薯生產上最具毀滅性的病害。全球每年因馬鈴薯晚疫病造成的經濟損失高達數十億歐元,馬鈴薯晚疫病已對世界糧食安全構成了嚴重威脅[1]。

為了成功侵染寄主植物,病原菌會分泌大量效應蛋白到植物細胞內以干擾植物免疫系統(tǒng)。與大豆疫霉Phytophthorasojae、橡樹疫霉P.ramorum基因組相比,致病疫霉不僅基因組大(約 240 Mb),而且還含有更多的分泌型效應子基因,RxLR胞質效應子(R:精氨酸;x: 任意氨基酸;L:亮氨酸)就是其中一類。通過對致病疫霉的基因組分析,發(fā)現有563個RxLR效應子基因。這些 RxLR 效應蛋白大多扮演著毒性因子的角色,致病疫霉通過吸器組織將其分泌到寄主細胞內干擾植物免疫反應,從而使致病疫霉能夠快速侵染并在寄主植物中繁衍[2]。當寄主植物細胞內有抗病蛋白(resistance protein, R)時,R蛋白會特異性識別對應的RxLR類效應蛋白,從而激發(fā)ETI免疫反應(effector-triggered immunity)。然而,RxLR效應蛋白除激發(fā)植物 ETI免疫反應外,更多的功能是抑制病原相關分子模式激發(fā)的 PTI(PAMP-triggered immunity)或 ETI免疫反應信號傳導,從而大大減弱植物的抗性反應[3-8]。

酵母雙雜交(yeast two-hybrid)技術是一種直接于酵母細胞內檢測蛋白質-蛋白質相互作用且靈敏度很高的分子生物學方法。其原理是利用真核生物轉錄因子(GAL4等)的DNA結合功能域(DNA binding domain, DNA-BD)和轉錄激活結構域(activation domain, DNA-AD),將待研究的病原菌效應蛋白和寄主靶標蛋白分別與BD和AD結構域連接并共轉化進入酵母菌中,若效應蛋白和寄主靶標蛋白存在互作,則轉錄因子的BD和AD結構域相互靠近,即可轉錄激活下游報告基因的表達,以此來檢測這2種蛋白互作的發(fā)生[9]。Du等[10]通過酵母雙雜交證實致病疫霉無毒蛋白AVR1與囊泡運輸相關蛋白Sec5互作進而促進致病疫霉侵染寄主。Boevink等[11]利用酵母雙雜交發(fā)現效應蛋白PITG_04314與植物蛋白磷酸酶 PP1c 催化亞基互作,并促進 PP1c從核仁轉運到核質,但是 PITG_04314 并沒有影響 PP1c 的磷酸酶活性。研究者推測 PITG_04314 是通過與 PP1c 發(fā)生互作形成PITG_04314-PP1c復合體全酶形式負調控植物防御反應。Turnbull等[12]利用酵母雙雜交發(fā)現致病疫霉無毒蛋白AVR2靶向3個BSL家族成員(BSL1,BSL2,BSL3),通過調控油菜素內酯信號傳導促進致病疫霉侵染。同年,He等[13]通過酵母雙雜交證實致病疫霉效應蛋白PiSFI3/Pi06087/PexRD16與U-box激酶 StUBK發(fā)生互作以抑制植物PTI免疫?？梢?酵母雙雜交在致病疫霉效應蛋白與寄主靶標蛋白研究方面有廣泛應用。

PiAVR3b是一個典型的RxLR類效應蛋白。當寄主植物含有對應抗病蛋白R3b時,PiAVR3b可作為無毒蛋白被R3b識別并激發(fā)ETI免疫反應[14]。Zheng等[4]報道PiAVR3b可以抑制Flg22介導的早期PTI免疫反應。Wang等[15]發(fā)現 PiAVR3b能夠抑制致病疫霉效應蛋白 PITG_22798 介導的細胞死亡反應。實驗室前期證實,瞬時表達PiAVR3b顯著促進致病疫霉侵染本氏煙。上述研究表明,PiAVR3b在調控植物免疫反應方面發(fā)揮著重要作用。但是,PiAVR3b如何參與調控植物免疫及寄主靶標蛋白尚不清楚。本研究構建了受致病疫霉誘導的馬鈴薯葉片cDNA文庫,并以PiAVR3b為誘餌篩選獲得4個寄主靶標蛋白,為進一步揭示PiAVR3b調控植物免疫分子機理提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

馬鈴薯栽培種‘合作88’種植于云南師范大學馬鈴薯科學研究院溫室。致病疫霉菌株88069(1.3.4.7)、PIC99183(1.3.4.5.7.8.10.11)由華中農業(yè)大學馬鈴薯課題組饋贈。對‘合作88’,PIC99183是毒性菌株;88069是無毒菌株,將兩菌株混合后接種‘合作88’用于構建馬鈴薯酵母雙雜交cDNA文庫。PIC99183用于PiAVR3b基因克隆。根據候選互作靶標基因編碼序列(coding sequence,CDS),利用Primer 3在線軟件(https:∥bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)進行引物設計。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

酵母Y2HGold菌株、酵母Y187菌株、pGADT7、pGBKT7、pDONR222、pGADT7-DEST、大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α、DH10B、“pGADT7-T+pGBKT7-53”(1對強互作蛋白,后文簡稱53+T)、“pGADT7-T+pGBKT7-Lam”(1對不互作蛋白,后文簡稱Lam+T)購自上海歐易生物科技有限公司。具體載體信息、用途及構建方法見酵母雙雜交使用手冊(Clontech,PT4084-1)。高保真酶、反轉錄試劑盒、無縫克隆試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。DNA純化回收試劑盒、植物總RNA提取試劑盒、酵母質粒提取試劑盒購自北京天根生物技術有限公司。酵母缺陷培養(yǎng)基SD/-Leu、SD/-Trp、SD/-Leu/-Trp、SD/-Leu/-Trp/-His、SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade、SD/-Trp/-His/-Ade、YPD Plus液體培養(yǎng)基、X-α-Gal、鮭魚精DNA購自TaKaRa公司。CloneMiner Ⅱ cDNA 構建試劑盒、FastTrack MAG mRNA分離試劑盒、反轉錄試劑盒等購自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1致病疫霉誘導的馬鈴薯葉片cDNA文庫構建

致病疫霉88069菌株和PIC99183菌株在黑麥固體培養(yǎng)基(每升含有黑麥60 g,蔗糖20 g,CaCO31.2 g,瓊脂15 g)上生長15 d左右,往長滿白色菌絲及孢子囊的培養(yǎng)皿里加入無菌水(3 mL/皿),用玻璃棒輕刮培養(yǎng)基表面菌絲,調整孢子囊濃度至104個/mL。將2個菌株孢子囊懸浮液等體積混合后接種‘合作88’離體葉片,取接種后24 h和48 h的葉片各20片,分別采用TRIzol 法提取兩個時間點總RNA并進行等量混合,用DNaseⅠ消化酶去除殘留DNA后檢測總RNA濃度和純度,利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。參照FastTrack MAG mRNA分離試劑盒和CloneMinerⅡcDNA合成試劑盒說明書,分離mRNA反轉錄成cDNA第一鏈,并合成cDNA第二鏈。將雙鏈cDNA與attB1和attB2重組接頭連接(attB1-cDNA insert-attB2)后進行分離與濃縮純化,利用 BP重組反應(25℃連接16～20 h)將純化的cDNA和含有 attP1和attP2的載體pDONR222連接。將重組產物電轉化大腸桿菌DH10B(1 500 V,200 Ω,25 μF),在轉化體系中加入 4 mL SOC培養(yǎng)基225～250 r/min振蕩培養(yǎng)1 h,涂布平板,次日用SOC培養(yǎng)基洗板3次,100 mL無菌離心管收集菌液,往離心管中加甘油至終濃度20%并保存于-80℃,即為初級文庫菌液。從初級文庫菌液中提取質粒,將質粒與pGADT7-DEST進行 LR 重組反應(25℃連接16～20 h),將重組產物純化后電激轉化大腸桿菌DH10B,在轉化體系中加入4 mL SOC培養(yǎng)基225～250 r/min振蕩培養(yǎng)1 h,取樣涂布平板確定庫容量;剩余培養(yǎng)物加入甘油至終濃度 20%存于-80℃,即為次級文庫菌液。隨后從次級文庫菌液中提取質粒,將5 μg次級文庫質粒轉化進入Y187酵母菌株中,用于后續(xù)酵母雙雜交。

1.2.2cDNA文庫容量、重組率及插入片段長度的鑒定

取初級、次級文庫細菌原液10 μL稀釋100倍,分別取50 μL初級、次級文庫稀釋液涂布于含50 mg/L Kan和50 mg/L Amp的LB固體培養(yǎng)基平板上,第2天計數鑒定庫容量。文庫菌液庫容量(cfu/mL)=平板上的克隆數/50 μL×100倍×1 000 μL。文庫總庫容量=文庫菌液庫容量×文庫菌液總體積(mL)。從各級文庫中隨機挑取24個克隆進行菌落PCR鑒定。初級文庫菌落PCR鑒定引物為M13(F: 5′-GTAAAACGACGGCCAG-3′; R:5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′);次級文庫菌落PCR鑒定引物為pGADT7-DEST (F: 5′-TAATACGACTCACTATAGGGCGAGCGCCGCCATG-3′; R: 5′-GTG-AACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGATT-3′)。引物序列詳見酵母雙雜交使用手冊(Clontech,PT4084-1)。PCR 反應條件為:95℃預變性 5 min;95℃ 30 s,58℃ 30 s,72℃ 3 min,35個循環(huán);72℃ 5 min;16℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物,統(tǒng)計重組率及插入片段長度。

1.2.3誘餌載體構建

參照無縫克隆試劑盒說明書,根據無毒基因PiAVR3b的核酸序列和pGBKT7載體酶切位點(EcoRⅠ和BamHⅠ),設計基因特異引物BD-PiAVR3b(表1),以致病疫霉菌株PIC99183的DNA為模板,利用DNA高保真聚合酶進行PCR擴增,將擴增產物回收純化后與pGBKT7進行同源重組,轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,篩選陽性克隆轉化子,提取質粒,采用T7測序引物(表1)測序后獲得誘餌載體pGBKT7-PiAVR3b?；驕y序委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

表1 酵母雙雜交點對點驗證試驗引物1)Table 1 Primer sequences used in yeast two-hybrid peer to peer verification

續(xù)表1 Table 1(Continued)

1.2.4誘餌載體自激活和毒性檢測

挑取酵母菌株Y2HGold劃線于YPDA 平板上,30℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3 d左右,挑取單克隆酵母制備成感受態(tài)細胞,采用PEG/LiAc法將誘餌載體pGBKT7-PiAVR3b和pGBKT7空載體分別轉化Y2HGold酵母感受態(tài)細胞,酵母菌液涂布于SD/-Trp營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基,置于30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng),3～5 d后觀察平板上酵母克隆的生長狀態(tài),若轉化誘餌載體與轉化空載體的克隆大小相近,生長數量近似,則證明pGBKT7-PiAVR3b對酵母菌株無毒性。將含有誘餌載體pGBKT7-PiAVR3b、空載體pGBKT7、53+T (陽性對照)、Lam+T (陰性對照)的Y2HGold酵母菌,分別接種于SD/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal平板上,30℃倒置培養(yǎng)3～5 d 后統(tǒng)計酵母生長情況。若pGBKT7-PiAVR3b在SD/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal平板上不能生長,則表明誘餌載體pGBKT7-PiAVR3b不存在自激活現象。若生長且變藍色則說明誘餌載體存在自激活。

1.2.5PiAVR3b互作蛋白篩選

參照酵母雙雜交使用手冊(Clontech,PT4084-1),挑取直徑2～3 mm含有誘餌載體pGBKT7-PiAVR3b的單克隆酵母菌株Y2HGold接種到50 mL SD/-Trp液體培養(yǎng)基中,30℃ 250～270 r/min過夜培養(yǎng)至OD600達到0.8;1 000 g離心濃縮去上清液,用4～5 mL SD/-Trp液體培養(yǎng)基重懸酵母菌并轉移到2 L無菌三角瓶中;往三角瓶中加入1 mL含次級文庫質粒的Y187酵母菌液和45 mL 2×YPDA液體培養(yǎng)基(含50 μg/mL Kan);30℃ 30～50 r/min共培養(yǎng)20～24 h。顯微鏡下觀察雜交液是否出現米奇頭或三葉草形狀的結合子,有則繼續(xù)下面的操作:1 000 g 離心10 min,用10 mL 0.5×YPDA(含有 50 μg/mL Kan) 重懸細胞,按每皿200 μL量涂布在SD/-Leu/-Trp/-His/X-α-Gal培養(yǎng)基上,培養(yǎng)5 d后,若出現藍色酵母克隆,則說明可能存在與PiAVR3b互作的蛋白。挑選藍色陽性克隆劃線于SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal培養(yǎng)基上擴大培養(yǎng)。同時,將陽性對照和陰性對照酵母菌也劃線于SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)5 d后,提取正常生長酵母質粒,并以其質粒為模板,利用pGADT7載體測序引物(T7, 表1)進行PCR擴增,擴增產物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。測序結果在馬鈴薯基因組數據庫(PGSC: http:∥solanaceae.plantbiology.msu.edu/)和NCBI數據庫中進行BLAST比對分析。

1.2.6酵母雙雜交點對點分析

為了驗證酵母雙雜交初篩的互作蛋白是否真的與PiAVR3b發(fā)生互作,用設計的10個候選互作基因特異引物AD系列(表1) 對‘合作88’的cDNA進行PCR擴增,以EcoRⅠ和BamHⅠ為酶切位點,將擴增產物通過無縫克隆試劑盒克隆到pGADT7載體中。將pGADT7-AD1至pGADT7-AD10分別與誘餌載體pGBKT7-PiAVR3b質粒共轉化到Y2HGold酵母感受態(tài)細胞中。以53+T為陽性對照,Lam+T為陰性對照,涂布在SD/-Leu/-Trp和SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal培養(yǎng)基上。30℃倒置培養(yǎng)3～5 d左右,若酵母正常生長且變藍色則可判斷初篩的互作蛋白與PiAVR3b發(fā)生互作。

2 結果與分析

2.1 致病疫霉誘導的馬鈴薯葉片cDNA文庫構建和質量鑒定

將10 μL初級文庫細菌原液稀釋100倍后取50 μL稀釋液涂布于LB平板(含50 mg/L Kan)上,次日統(tǒng)計,平板上共有單克隆1 600個,計算得出初級文庫總庫容量為1.28×107cfu/mL。隨機挑取24個單克隆進行菌落PCR鑒定,24個單克隆均成功擴增,擴增片段平均長度在1 000 bp左右,說明初級文庫中馬鈴薯cDNA插入率為100%(圖1a和1b)。將10 μL次級文庫細菌原液稀釋100倍后進行次級文庫庫容量鑒定。取50 μL稀釋液涂布LB平板(50 mg/L Amp)上,次日統(tǒng)計,平板上共有單克隆2 000個,計算得出次級文庫總庫容量為1.6×107cfu/mL。隨機挑取24個單克隆進行菌落PCR鑒定,24個單克隆均成功擴增,擴增片段平均長度在1 000 bp左右,說明次級文庫中馬鈴薯cDNA插入率為100%(圖1c和1d)。結果表明,構建的馬鈴薯葉片cDNA文庫容量足夠大,可以滿足篩選互作蛋白的文庫要求。

圖1 致病疫霉誘導的馬鈴薯酵母雙雜交初級、次級文庫構建及質量檢測Fig.1 Construction and evaluation of the primary and secondary yeast two-hybrid cDNA library in potato induced by Phytophthora infestans

2.2 誘餌載體pGBKT7-PiAVR3b構建

以致病疫霉菌株PIC99183的DNA為模板,BD-PiAVR3b為基因特異引物(表1),PCR擴增得到片段大小與預期目標片段大小一致(387 bp)(圖2a)。利用膠回收試劑盒對擴增產物進行回收、純化,通過同源重組方式將基因片段插入pGBKT7載體,轉化大腸桿菌,菌落PCR篩選陽性克隆,提取陽性克隆的質粒,經酶切和測序驗證確定誘餌載體pGBKT7-PiAVR3b構建成功(圖2b)。

圖2 pGBKT7-PiAVR3b誘餌載體構建Fig.2 Construction of bait vector pGBKT7-PiAVR3b

2.3 PiAVR3b自激活和毒性檢測

以質粒組合53+T為陽性對照,質粒組合Lam+T為陰性對照,將構建好的pGBKT7-PiAVR3b和pGBKT7空載體按照Clontech酵母轉化方案進行酵母細胞毒性和自激活驗證。轉化pGBKT7-PiAVR3b的酵母單克隆和轉化pGBKT7空載體的克隆相比,大小和數量較一致,說明其對酵母細胞不產生毒性,可用于后續(xù)的馬鈴薯酵母雙雜交文庫篩選(圖3a)。質粒pGBKT7-PiAVR3b和pGBKT7空載體均可在SD/-Trp培養(yǎng)基中正常生長,而不能在SD/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal培養(yǎng)基上生長,而陽性對照單克隆酵母可正常生長且顯藍色,陰性對照則不生長,表明構建的誘餌載體pGBKT7-PiAVR3b無自激活(圖3b)。

圖3 pGBKT7-PiAVR3b誘餌載體自激活驗證Fig.3 Validation of self-activation of bait vector pGBKT7-PiAVR3b

2.4 PiAVR3b互作蛋白的篩選

將含有誘餌載體pGBKT7-PiAVR3b的Y2HGold酵母菌株與含有經致病疫霉誘導的馬鈴薯酵母文庫的Y187酵母菌株進行雜交,雜交24 h后涂布在SD/-Leu/-Trp/-His/X-α-Gal培養(yǎng)基上進行初篩,培養(yǎng)5 d后將初篩藍色陽性克隆轉移至SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal平板上,經篩選后共獲得28個陽性克隆(圖4)。提取28個陽性酵母克隆的質粒,以質粒為模板,T7為引物進行PCR擴增,擴增產物直接進行純化、回收、測序。測序序列經BLAST比對分析,去除相同序列的陽性克隆,初步獲得10個候選靶標(表2)。

圖4 無毒蛋白PiAVR3b互作蛋白的篩選Fig.4 Screening of candidate interaction protein for avirulence protein PiAVR3b

表2 無毒蛋白PiAVR3b的互作蛋白Table 2 Candidate interaction proteins of avirulence protein PiAVR3b

2.5 酵母雙雜交點對點驗證候選PiAVR3b靶標蛋白

為了進一步驗證候選靶標與無毒蛋白PiAVR3b存在互作,將上述10個候選靶標基因的CDS序列分別重組連接到pGADT7載體上,將構建好的10個pGADT7-候選靶標質粒分別與pGBKT7-PiAVR3b共同轉化Y2HGold酵母感受態(tài)細胞進行點對點驗證,以53+T為陽性對照,Lam+T為陰性對照。結果發(fā)現在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal平板上只有4個候選靶標蛋白與PiAVR3b存在互作(圖5),分別是馬鈴薯線粒體外膜孔蛋白(AD-6)、MYB-like蛋白(AD-7)、碳分解代謝抑制蛋白(AD-9)、肽基脯氨酰異構酶(AD-10)。

圖5 酵母雙雜交點對點驗證無毒蛋白PiAVR3b 靶標蛋白Fig.5 Validation of the target proteins for avirulence protein PiAVR3b by using yeast two-hybrid peer to peer verification

3 討論

高質量cDNA文庫是酵母雙雜交系統(tǒng)篩選互作蛋白的有力保證,而cDNA文庫質量主要取決于RNA完整性、文庫容量[16]。本研究構建的經致病疫霉誘導的馬鈴薯酵母雙雜交次級文庫庫容量為1.6×107cfu/mL,插入片段平均在1 000 bp以上,重組插入率為100%,可以滿足低豐度表達蛋白的互作篩選。對文庫中10個互作蛋白的CDS序列分析結果顯示，其中4個互作蛋白是全長CDS。上述結果說明構建的馬鈴薯酵母雙雜交文庫質量較好,能夠用于致病疫霉效應蛋白的寄主靶標蛋白篩選。

RxLR效應蛋白通過調控植物轉錄因子、蛋白降解、泛素化、RNA 剪切等方面干擾植物免疫信號傳導,從而促進致病疫霉侵染。然而,目前只發(fā)現了少數RxLR效應蛋白的寄主靶標[17]。篩選與鑒定效應蛋白的寄主互作靶標對進一步揭示效應子毒性功能和致病疫霉的致病機理至關重要。酵母雙雜交系統(tǒng)是在真核酵母細胞內研究蛋白之間是否存在互作的一種方法,具有高靈敏度、廣泛應用等特點。本研究構建了致病疫霉誘導的馬鈴薯酵母雙雜交cDNA文庫,并以無毒蛋白PiAVR3b為誘餌,篩選到4個候選靶標蛋白。經序列比對分析發(fā)現,這4個候選靶標蛋白分別是馬鈴薯MYB-like蛋白、線粒體外膜孔蛋白、碳分解代謝抑制蛋白、肽基脯氨酰異構酶。其中,碳分解代謝抑制蛋白在植物和微生物中功能保守,與植物免疫無關。推測其為假陽性互作蛋白。

MYB轉錄因子家族在植物生長發(fā)育的多個方面起著重要的作用,是植物中較大的轉錄因子家族之一[18]。木質素是植物細胞壁重要成分,在增強植物ETI免疫方面發(fā)揮著重要功能。研究發(fā)現擬南芥ArabidopsisthalianaMYB15突變體細胞壁中木質素含量降低,接種丁香假單胞菌Pseudomonassyringae無毒菌株后抗性下降,有病斑形成,而對照野生型則表現明顯的過敏反應[19]。另外,擬南芥MYB20、MYB42、MYB43和MYB85轉錄因子均有促進次生細胞壁中的木質素和苯丙氨酸生物合成功能[20]。植物細胞表皮蠟質對抵抗生物脅迫具有重要功能。蘋果MaluspumilaMdMYB30通過調控蠟質合成基因MdKCS1表達促使細胞表皮蠟質合成,從而增加對蘋果輪紋病的抗性[21]。蘋果MdMYB73通過調控體內水楊酸合成進而增強其對潰瘍病的抗性[22]。超量表達番茄LycopersiconesculentumMYB49可以顯著增強番茄植株對致病疫霉的抗性以及對干旱、鹽脅迫等的耐受性[23]。另外,MYB轉錄因子在調控植物黃酮醇、花青素等次生代謝產物合成方面也發(fā)揮著重要作用[24]。課題組前期分析馬鈴薯MYB轉錄因子家族共有217個基因,其中1R-MYB類有90個,R2R3-MYB類有124個,R1R2R3-MYB類有3個[24]。本研究篩選獲得的候選靶標蛋白MYB-like屬于1R-MYB類,推測PiAVR3b靶向調控該轉錄因子影響寄主木質素,蠟質或水楊酸等合成,從而導致馬鈴薯抗病性降低。

線粒體外膜孔蛋白負責線粒體與細胞質之間的信息傳遞,對細胞功能的正常發(fā)揮具有重要作用。在植物受到病原菌侵染時,部分線粒體外膜孔蛋白被誘導表達,促使活性氧從線粒體向細胞質釋放從而增強植物抗病免疫[25]。研究發(fā)現線粒體外膜孔蛋白VpVDAC3通過與病程相關蛋白VpPR10.1互作增強葡萄對霜霉病菌的抗性[26]。擬南芥受丁香假單胞菌侵染時,體內4個線粒體外膜孔蛋白均上調表達[27]。通過蛋白質組學技術,研究人員發(fā)現線粒體外膜孔蛋白在油菜抗黑腐病品種中表達豐度明顯高于感病品種[28]。候選靶標線粒體外膜孔蛋白有可能參與馬鈴薯抗晚疫病,同時與PiAVR3b發(fā)生互作,兩者之間如何調控馬鈴薯對晚疫病的抗性有待深入研究。

肽基脯氨酰異構酶廣泛參與植物響應生物與非生物脅迫反應[29]。研究發(fā)現丁香假單胞菌侵染擬南芥時,肽基脯氨酰異構酶類AtCYP19-1和AtCYP57基因被誘導表達。當抑制AtCYP19-1和AtCYP57基因表達時,植株表現感病,超量表達則增強植株抗病性。進一步研究發(fā)現,AtCYP19-1和AtCYP57超量表達植株促進類活性氧爆發(fā)和胼胝質積累從而增強植株抗病性[30-31]。肽基脯氨酰異構酶FKBP15在擬南芥內質網脅迫感知和介導植物免疫方面發(fā)揮重要功能,研究發(fā)現辣椒疫霉Phytophthoracapsici無毒蛋白PcAvr3a12可以抑制FKBP15酶活從而促進辣椒疫霉侵染擬南芥[32]。另外,肽基脯氨酰異構酶類AtCYP20-3以茉莉酸合成途徑中對12-氧-植物二烯酸的受體形式調控擬南芥對腐生真菌的抗性[33]。本研究中,候選靶標肽基脯氨酰異構酶是否影響致病疫霉侵染及PiAVR3b是否依賴其發(fā)揮毒性有待進一步研究。

4個候選靶標蛋白均與PiAVR3b互作,一方面可能由于PiAVR3b通過靶向寄主不同蛋白來調控植物免疫,類似PiAVR-blb2[34-35]。因此需要對4個候選靶標是否參與寄主抗病免疫反應進行鑒定。另一方面由于酵母雙雜交技術存在一定的假陽性[17],需要進一步通過其他蛋白質互作技術對候選靶標與PiAVR3b的互作真實性進行鑒定,例如蛋白質免疫共沉淀、雙分子熒光互補、蛋白體外pull-down技術等。通過上述兩個方面進行PiAVR3b靶標蛋白鑒定,將為進一步揭示PiAVR3b的作用機制提供依據。

綜上,本研究構建了經致病疫霉誘導的馬鈴薯酵母雙雜交cDNA文庫,文庫具有較高轉化效率和重組效率,并以致病疫霉無毒蛋白PiAVR3b為誘餌,經酵母雙雜交篩選到4個候選PiAVR3b靶標蛋白,為后續(xù)研究PiAVR3b如何調控植物免疫及致病疫霉與馬鈴薯互作奠定基礎。