尚爾雨，馬曉乾，孫 爽，申國濤

(1.黑龍江省森林保護研究所，哈爾濱 150040； 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040)

人參(PanaxginsengC.A.Meyer)是五加科、人參屬多年生草本植物?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》將人參列為藥中上品。齊墩果酸、熊果酸、人參皂苷Rg3等是人參中的主要抗腫瘤成分，但由于這些成分的水溶性及生物利用度等性質(zhì)的局限，使得人參的藥效受到局限[1-4]。近年來，對于難溶性成分的腫瘤靶向性的納米制劑的研究受到越來越多的關(guān)注[5-6]。

納米脂質(zhì)載體(nanostructured lipid carriers，NLC)是一種將固體和液體的脂質(zhì)在高溫條件下熔融，再經(jīng)過低溫固化而形成的給藥體系[7]。NLC給藥體系中包載中藥中的難溶活性成分，用以提高靶向性及生物利用度等性能[8]，其優(yōu)勢是納米載體將難溶性成分的溶解度提高。NLC還具有良好的生物相容性，可生物降解，控制藥物釋放，提高疏水藥物非口服給藥途徑的傳遞效率[9-11]。

星點設(shè)計-效應(yīng)面法 (The central design-effect surface method，CCD-RSM)是一種多元非線性擬合，具有實驗次數(shù)少、預(yù)測值接近真實值、精度高等優(yōu)點，是集數(shù)學(xué)與統(tǒng)計為一體的實驗方法，應(yīng)用廣泛。本實驗擬通過CCD-RSM 來優(yōu)化載人參多成分納米脂質(zhì)載體的處方，可相對減少實驗次數(shù)，精度高，預(yù)測性好[12-13]。

1 儀器與材料

沃特斯2695高效液相色譜儀(美國Waters公司生產(chǎn))，超聲波細(xì)胞破碎儀(美國Sonics公司生產(chǎn))，電子分析天平(上海良平儀表有限公司生產(chǎn))，Nano-ZS90激光粒度分析儀(馬爾文儀器有限公司生產(chǎn))，透射電子顯微鏡(TEM)(荷蘭飛利浦公司生產(chǎn))，恒溫加熱磁力攪拌器(鄭州長城科工貿(mào)有限公司生產(chǎn))，C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)(DIKMA公司生產(chǎn))。

齊墩果酸(批號 130826)、熊果酸(批號 131107)、人參皂苷Rg3(批號 131029)均購于成都瑾哲生物有限公司。甲醇(色譜級)(DIKMA公司生產(chǎn))，CTAB(天津市大茂化學(xué)試劑廠生產(chǎn))。

2 方法

2.1 OUR-NLC的制備方法

精密稱定處方量的OA、UA和Rg3，選擇固定比例的固態(tài)脂質(zhì)和液態(tài)脂質(zhì)，水浴溶解于無水乙醇中，利用細(xì)胞超聲破碎儀，使油相分散在含有表面活性劑的水溶液中，采用減壓蒸發(fā)除去有機溶劑后，得到OUR-NLC。

2.2 制備工藝的優(yōu)化及設(shè)計

采用單因素法對藥物用量比、油酸用量、表面活性劑濃度等因素進(jìn)行考察， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以上三個因素對制備OUR-NLC均有顯著影響，可進(jìn)一步對制備工藝進(jìn)行優(yōu)化。采用CCD-RSM(三因素二水平)，將藥物用量比(X1，X2)、表面活性劑濃度(X3)、油酸的用量(X4)設(shè)為獨立因素，設(shè)中心點、析因設(shè)計點、極值點(即0，+1，-1)，得到真實值、代碼值見表1。以Y1(總包封率，%)，Y2(總載藥量，%)為響應(yīng)參數(shù)安排試驗，見表2。

表1 實驗真實值和代碼值Tab.1 Experiment real and code value

表2 中心組合設(shè)計安排和結(jié)果Tab.2 Central combination design arrangement and results

2.3 優(yōu)化工藝的處方驗證

依據(jù)最優(yōu)條件制備OUR-NLC三批樣品，以總包封率及總載藥量實際值和估計值進(jìn)行比較，計算其相對偏差。

2.4 穩(wěn)定性考察

將三批次納米粒分別于4℃和25℃冰箱冷藏保存，分別在第1 d、3 d、7 d、15 d后對樣品的外觀、粒徑、包封率和載藥量進(jìn)行觀察。

3 結(jié)果

3.1 模型擬合及方差分析

以Y1(總包封率，%)，Y2(總載藥量，%)分別對X1、X2、X3、X4進(jìn)行模型擬合，得到回歸模型為：

(F:29.72;p-value:<0.000 1)

(F:48.38;p-value:<0.000 2)

由方程可知，擬合效果較好的為二項式方程。繪制三維效應(yīng)面及二維等高圖，優(yōu)化納米粒處方。結(jié)果見表3和表4。

表3 Y1響應(yīng)面模型方差分析Tab.3 Variance analysis of Y1 response surface model

表4 Y2響應(yīng)面模型方差分析Tab.4 Variance analysis of Y2 response surface model

續(xù)表4

結(jié)果表明，表3中，F(xiàn)值為8.84，說明模型顯著，導(dǎo)致產(chǎn)生噪音的幾率只有0.01%；P值<0.05模型顯著。模型顯著項為A2，B2，D2；P>0.1模型不顯著。

結(jié)果表明，表4中，F(xiàn)值為12.18說明模型顯著，P<0.05模型為顯著。從而得知模型的顯著項是AB、B2、D2，對于載藥量來說，投藥量、油酸用量是主要影響因素。

通過Oringin8.0統(tǒng)計軟件繪制三維效應(yīng)面圖，見圖1和圖2。

圖1 Y1的三維圖和二維圖：自變量X1X2(A)，X1X4(B)和X2X4(C)Fig.1 3D and 2D of Y1: independent variable X1X2(A), X1X4(B) and X2X4(C)

圖2 Y2的三維圖和二維圖：自變量X1X2(A)，X1X4(B)和X2X4(C)Fig.2 3D and 2D of Y2: independent variable X1X2(A), X1X4(B) and X2X4(C)

結(jié)果顯示，圖1中， Y1(總包封率) 與X1(藥物用量)、X2(藥物用量)和X4(油酸用量)密切相關(guān)，當(dāng)藥物和油酸用量增加時，總包封率表現(xiàn)為先升高后下降，總包封率為45.66%達(dá)到最高點。圖2中， Y2(總載藥量)與X1(藥物用量)、X2(藥物用量)和X4(油酸用量)密切相關(guān)。結(jié)果顯示各因素在中心點的水平值效果較優(yōu)。

3.2 驗證優(yōu)化處方

依據(jù)上述實驗指標(biāo)的結(jié)果，最終確認(rèn)X1=1.04、X2=1.03、X3=0.11%、X4=0.99 mL為最佳參數(shù)值。制備OUR-NLC三批樣品，計算其相對偏差，Y1(總包封率)和Y2(總載藥量)的實際值和估計值見表5，PS和ZP、PDI見表6和圖3。

圖3 粒徑和電位圖Fig.3 Particle size and potential diagram

表5 預(yù)測值和觀察值的比較 (n=3)Tab.5 Comparison of predicted and observed values (n=3)

表6 驗證結(jié)果 (n=3)Tab.6 Verification results (n=3)

由表可知，實測值與預(yù)測值各項指標(biāo)的偏差均小于±5%，較小，說明經(jīng)過處方優(yōu)化后的二者相吻合，說明CCD-RSM預(yù)測效果較好，作為描述效應(yīng)面與影響因素之間的密切關(guān)系是一種全面的分析方法。

由表6、圖3可知，選取最有處方制備三批樣品，觀測外觀均為乳白色液體。三批樣品之間的各項指標(biāo)變化差異較小，表明方法重現(xiàn)性良好。

3.3 穩(wěn)定性考察

結(jié)果表明，OUR-NLC在4℃條件下存放7 d，外觀均勻，無絮凝、沉淀，DL和Zeta電位稍下降，粒徑略增加，PDI與EE幾乎無變化。但是在25℃時，當(dāng)粒徑逐漸增加，Zeta電位與載藥量、包封率呈現(xiàn)逐漸下降趨勢；在存放至3 d后，產(chǎn)生絮凝現(xiàn)象；存放15 d后，出現(xiàn)沉降狀態(tài)且為不可逆，此時包封率呈現(xiàn)明顯下降趨勢。由此得出，溫度是納米粒穩(wěn)定性的較大影響因素[14-15]。

4 討論

NLC是一種在一定溫度下將固體脂質(zhì)和空間上不相容的液體脂質(zhì)混合制備從而得到的納米粒給藥載體，將與之化學(xué)性質(zhì)差異很大的液態(tài)脂質(zhì)加入到固態(tài)脂質(zhì)中，使納米粒以結(jié)晶缺陷型或無定型的結(jié)構(gòu)存在。在體溫條件下，NLC持續(xù)保持固體骨架結(jié)構(gòu)，在引入適量的液體脂質(zhì)后，其納米粒固體內(nèi)部骨架性質(zhì)并未改變，推測可能是由于加入液態(tài)脂質(zhì)既能夠延緩固態(tài)脂質(zhì)由α晶形轉(zhuǎn)化為β晶形，還有可能延緩藥物在儲存過程中的泄漏，增加其對藥物分子的包容性，提高藥物的包封率及載藥量，在儲存過程中避免藥物外排、包封率降低現(xiàn)象。

在納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體基質(zhì)中，固、液脂質(zhì)的性質(zhì)與其差異程度是NLC載藥系統(tǒng)成型的關(guān)鍵。Jenning等人[16]用高壓乳勻機制備甘油三酯SLN和蠟類SLN，發(fā)現(xiàn)甘油酯SLN具有較好的包封率，蠟類SLN顯現(xiàn)的粒度分布和長期的物理穩(wěn)定性則要優(yōu)于甘油酯SLN。NLC作為一種新興的脂質(zhì)納米微粒載體系統(tǒng)，具備生產(chǎn)成本較低、工藝單一、耐受性良好等優(yōu)點，應(yīng)用較為廣泛，包括注射、口服、經(jīng)皮等給藥方式。

中藥是一個綜合復(fù)雜的化學(xué)組成系統(tǒng)，是在多種活性成分協(xié)同作用下產(chǎn)生療效的綜合體。但目前中藥納米劑型的研究大多集中于單一有效成分，由于單體化合物物理化學(xué)性質(zhì)明確，所以其制備工藝也相對簡單，而多成分的共同存在會使納米載藥體系在包封過程中出現(xiàn)均衡包封較為困難的問題，因此選擇合適的處方顯得十分重要。

在OA、UA和Rg3三種藥物被包載于納米脂質(zhì)載體中時，由于載體材料包載藥物的能力的有限性，三者之間可能存在一定競爭，其中藥物用量及三者比例對3個成分的包封率及載藥量均有一定程度的影響。通過對CTAB的濃度、投藥比、油酸比例、有機相與水相體積比等單因素的考察，選擇出適宜的指標(biāo)和水平，為進(jìn)一步進(jìn)行處方篩選奠定了基礎(chǔ)。以三因素五水平的星點設(shè)計-效應(yīng)面法展開實驗，優(yōu)化的最佳制備處方為：水油體積比1.9∶1(mL/mL)，藥物用量14.5 mg，C乳化劑0.1%。按照優(yōu)化的最佳制備處方制備OUR-NLC三批樣品，發(fā)現(xiàn)各項指標(biāo)變化差異較小，顯示重現(xiàn)性良好。

人參多成分納米脂質(zhì)載體的處方能夠有效包載OA、UA和Rg3三種成分，為包載化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)差異較大的中藥成分納米遞藥系統(tǒng)研究提供了方法和技術(shù)。