張綠茵，蘭為環(huán) ，劉朋 ，李爽，唐海

（1.江蘇天士力帝益藥業(yè)有限公司，天津 300400；2.天士力控股集團有限公司，天津 300400）

米諾膦酸（minodronic acid）化學名為1-羥基-2-{咪唑并［1，2-a］吡啶-3-基}亞乙基-1， 1-雙膦酸，為第三代含氮芳雜環(huán)雙膦酸鹽類藥物，米諾膦酸能夠抑制破骨細胞法尼焦磷酸合成酶（FPP）的活性，降低骨轉(zhuǎn)換，進而防治骨質(zhì)疏松，是由日本小野藥品工業(yè)株式會社和Astellas制藥株式會社共同開發(fā)，于2009年在日本上市[1-3]，臨床上常用的為其一水合物，結構式見圖1[4]。

圖1 米諾膦酸水合物Fig.1 Minodronic acid hydrate

根據(jù)米諾膦酸的合成路線[5-6]，米諾磷酸是以2-氨基吡啶和反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯為起始原料，經(jīng)過親核加成反應制得關鍵中間體2-（咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基）乙酸乙酯，然后再經(jīng)水解、磷酸化、精制獲得米諾膦酸成品。

圖2 中間體合成路線Fig.2 Intermediate synthesis route

反應過程中，2-氨基吡啶既是反應物，又具有一定的堿性，在乙腈回流的高溫下，隨著產(chǎn)物的生成，也產(chǎn)生了水，通過濃縮除溶劑得到該中間體，該中間體為油狀液體，工藝過程實際操作時，濃縮后就連續(xù)進行下一步反應，故最初該中間體沒有建立相應的質(zhì)量標準，僅通過反應過程TLC監(jiān)控，但由于TLC方法對起始原料的殘留不能準確定量，造成后續(xù)反應較難除去，影響最終產(chǎn)品質(zhì)量，故此文建立了一個更加有效監(jiān)測該中間體的GC的方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

7890A型氣相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；XS105型DU電子分析天平（梅特勒-托利多國際有限公司）；Agilent DB-624（30 m×0.320 mm，1.8 μm）毛細管柱，F(xiàn)ID檢測器；

甲醇（批號，109845077849，HPLC級），購自默克公司；乙腈（批號：JA076630，HPLC級），購自默克公司；2-氨基吡啶（批號：20190312，99.96%），購自安徽星宇化工有限公司；反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯（批號：MN-01-181201，97.31%），購自北京海步醫(yī)藥科技有限公司；中間體1（批號：MN1905241a、MN1905242a、MN1905243a），自制；

2 結果與討論

2.1 色譜條件

以6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷為固定相的毛細管為色譜柱，起始溫度為40 ℃，保持5 min，以25 ℃/min的速率升溫至180 ℃，再以40 ℃/min的速率升溫至240 ℃，保持10 min；檢測器為氫火焰離子化檢測器，檢測器溫度260 ℃，進樣口溫度180 ℃；以氮氣為載氣，流速為1.5 mL/min，分流比為10∶1；進樣體積1 μL。

2.2 溶液配制

2.2.1 空白溶液

甲醇作為空白溶液。

2.2.2 對照品溶液

取乙腈、反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯、2-氨基吡啶各適量，精密稱定，用甲醇定量稀釋制成每1 mL中分別約含0.5 mg、0.025 mg、0.25 mg的混合溶液。

2.2.3 供試品溶液

取中間體1適量，精密稱定至量瓶中，加入甲醇定量稀釋制成每1 mL中約含5 mg的溶液；

2.3 專屬性考察

取2-氨基吡啶對照品約25 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，用溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為2-氨基吡啶定位溶液；取反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯對照品約25 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，用溶劑溶解稀釋至刻度，搖勻，作為反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯定位溶液；取乙腈約20 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，用溶劑溶解稀釋至刻度，搖勻，作為乙腈定位溶液；取上述2-氨基吡啶定位溶液、反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯定位溶液、乙腈定位溶液及2.2項下空白溶劑、供試品溶液、對照品溶液按照2.1項下的色譜條件進行測定，記錄色譜圖，結果如圖3所示。結果表明空白溶液不干擾測定，各組分之間分離度均大于1.5，說明該檢測方法專屬性好。見圖3。

圖3 氣相色譜圖（1：乙腈； 2：反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯； 3：2-氨基吡啶）Fig.3 Gas chromatogram （1：acetonitrile； 2：ethyl trans-4-oxo-2-butenoate； 3：2-aminopyridine）

2.4 檢測限和定量限考察

取2.3項下的反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯定位溶液，逐步稀釋，按照2.1項下的色譜條件進行測定，其中檢測限溶液測定3次，定量限溶液測定6次，分別記錄反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯峰的信噪比（S/N）平均值。以信噪比大于3∶1時測得的濃度為檢測限，以信噪比大于10∶1時測得的濃度為定量限。方法考察的檢測限和定量限溶液濃度分別為為0.68 μg/ mL和2.72 μg/mL，分別相當于供試品溶液濃度水平0.01%和0.05% 。

2.5 線性關系考察

精密稱取反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯對照品、乙腈與2-氨基吡啶各適量，加甲醇稀釋制成系列濃度的混合線性溶液，依次進樣，各三針，按照2.1項下的色譜條件進行測定，記錄色譜圖，考察各組分濃度與峰面積的線性關系，并以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，用最小二乘法計算線性回歸圖，結果表明乙腈在0.25 ～ 1.52 mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關系良好，線性方程為y= 737.613 5x- 7.246 9，R2= 0.999 9；反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯在0.01 ～ 0.08 mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關系良好，線性方程為y= 296.105 9x+ 3.264 7，R2= 0.981 3；2-氨基吡啶在0.13 ～ 0.78 mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關系良好，線性方程為y= 1 065.328 8x- 1.541 3，R2= 0.999 9。說明該方法在規(guī)定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關系良好。

2.6 回收率考察

分別精密稱取乙腈、反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯與2-氨基吡啶各適量，加甲醇稀釋制成每1 mL約含乙腈2.5 mg、反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯0.125 mg、2-氨基吡啶1.25 mg的混合儲備液。

按2.2.3項下供試品溶液的配制方法平行配制供試品溶液2份，作為空白供試品溶液；

精密稱取供試品（中間體1）約250 mg，稱取9份，分成3組，每組分別精密加入混合儲備液適量，用溶劑稀釋至刻度，制成各限度濃度80%、100%和120%的供試品溶液各3份，共9份，搖勻即得，按照2.1項下的色譜條件進行測定，記錄色譜圖，計算回收率。結果如表1所示，結果表明該方法的準確度較高，適用于米諾膦酸中間體中乙腈、反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯及2-氨基吡啶的檢查。

表1 回收率試驗結果Tab.1 The results of recoveries（n=9）

（續(xù)表）

2.7 精密度

2.7.1 儀器精密度實驗

取2.2.1項下對照品溶液，連續(xù)進樣6針，按照2.1項下的色譜條件進行測定，記錄色譜圖，乙腈出峰時間RSD為0.028%，峰面積RSD為0.38%；反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯出峰時間RSD為0.004 5%，峰面積RSD為1.0%；2-氨基吡啶出峰時間RSD為0.004 6%，峰面積RSD為0.38%。儀器精密度良好。

2.7.2 方法精密度實驗

按2.2.3項下供試品溶液的配制方法平行配制供試品溶液6份，同時配制對照品溶液2份，按照2.1項下的色譜條件進行測定，記錄色譜圖，6份供試品溶液中乙腈含量RSD為2.8%，反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯含量RSD為2.8%，2-氨基吡啶含量RSD為3.0%，方法重復性好。

2.7.3 中間精密度實驗

按2.2.3項下供試品溶液的配制方法平行配制供試品溶液6份，同時配制對照品溶液2份，由不同的分析人員、不同時間、不同儀器、不同色譜柱，按照2.1項下的色譜條件進行測定，記錄色譜圖，結果中間體1供試品（MN1905242a），乙腈含量RSD為3.0%，反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯含量RSD為4.2%，2-氨基吡啶雜質(zhì)含量RSD為3.7%；結果表明，中間體1分析方法精密度良好。

2.8 耐用性

2.8.1 溶液穩(wěn)定性

按2.2項下配制空白溶劑、對照品溶液、供試品溶液，于室溫放置0 h、2 h、4 h、16 h，按照2.1項下的色譜條件進行測定，記錄色譜圖，室溫放置16 h，對照品溶液中乙腈峰面積RSD為0.40%，反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯峰面積RSD為3.8%，2-氨基吡啶雜質(zhì)峰面積的RSD為1.2%；供試品溶液中乙腈含量RSD為0.48%，反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯含量RSD為3.1%，2-氨基吡啶雜質(zhì)含量的RSD為2.1%；結果表明：中間體1對照品溶液、供試品溶液在室溫放置16 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8.2 改變色譜條件

按2.2項下配制空白溶劑、對照品溶液、供試品溶液，分別考察不同進樣口溫度、檢測器溫度、柱升溫程序，對照品溶液中乙腈峰面積RSD為0.91%，反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯峰面積RSD為3.6%，2-氨基吡啶雜質(zhì)峰面積的RSD為0.84%；供試品溶液中乙腈含量RSD為1.2%，反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯含量RSD為3.7%，2-氨基吡啶含量的RSD為1.4%；分離度均大于1.5。

2.9 樣品檢測

取3批樣品，按照2.2.3項下的供試品溶液的配制方法平行配制2份，同時取對照品溶液2份，按照2.1項下的色譜條件進行測定，記錄色譜圖。結果按外標法以峰面積計算，中間體供試品MN1905241a批乙腈含量為3.88%、反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯含量為0.36%、2-氨基吡啶含量為4.03%；供試品MN1905242a批乙腈含量為3.35%、反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯含量為0.32%、2-氨基吡啶含量為3.98%；供試品MN1905243a批乙腈含量為3.62%、反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯含量為0.29%、2-氨基吡啶含量為4.47%；均符合限度要求。

3 討論

3.1 限度的制定

米諾膦酸合成過程中，可能殘留未反應完全的2-氨基吡啶與反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯，反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯在后續(xù)反應中，在堿性條件下，能發(fā)生水解而產(chǎn)生新的雜質(zhì)，生成小分子有機物可溶于醇/水溶液而除去，而未除去的反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯由于在后邊的步驟中難以去除，因此設定限度0.5%以下；2-氨基吡啶易溶于水和醇，若有剩余可通過調(diào)節(jié)pH值而有效除去，依據(jù)多批次樣品檢測結果和雜質(zhì)清除實驗結果，設定限度5.0%以下；乙腈作為回流溶劑，后續(xù)會通過烘干除去，并且在終產(chǎn)品中作為殘留溶劑進行限度控制，因此該步驟中設定限度10.0%以下。

4 結束語

經(jīng)驗證，該方法可有效用于準確控制米諾膦酸關鍵中間體中雜質(zhì)的含量，從而保證最終的產(chǎn)品質(zhì) 量。