表亞囡，于曉娜，孫玉雙，王利杰，李敏，焦云飛，楊軒，任毅然

（1.華北制藥河北華民藥業(yè)有限責(zé)任公司，石家莊 052165；2.抗生素酶催化與結(jié)晶技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，石家莊 052165；3.河北省頭孢類藥物制備技術(shù)創(chuàng)新中心，石家莊 052165）

注射用頭孢噻肟鈉為賽諾菲萬(wàn)安特有限公司研究開發(fā)的第三代頭孢菌素，商品名為凱福隆，分別在德國(guó)、美國(guó)、法國(guó)、日本上市。中檢院姚蕾等發(fā)表的文獻(xiàn)《229批國(guó)產(chǎn)注射用頭孢噻肟鈉的質(zhì)量評(píng)價(jià)》[1]中提及本品注射液的原研為1980年首次在德國(guó)上市。注射用頭孢噻肟鈉抗菌譜廣，抗菌活性強(qiáng)，臨床應(yīng)用廣泛。頭孢菌素一般由微生物發(fā)酵、純化、精制以及化學(xué)修飾等過(guò)程制得，可能含有的雜質(zhì)情況較常規(guī)化學(xué)合成藥品更為復(fù)雜。

根據(jù)原料藥的合成路線分析，并經(jīng)專業(yè)的軟件評(píng)估，頭孢噻肟鈉原料藥中含有的致突變雜質(zhì)有2-巰基苯并噻唑和二硫化二苯并噻唑，前者主要產(chǎn)生途徑為合成頭孢噻肟酸時(shí)形成的副產(chǎn)物，后者主要來(lái)源為合成AE活性酯時(shí)殘留。因2-巰基苯并噻唑在溶液形態(tài)可與二硫化二苯并噻唑相互轉(zhuǎn)化，因此開發(fā)方法將二硫化二苯并噻唑轉(zhuǎn)化為2-巰基苯并噻唑進(jìn)行共同控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT高效液相色譜儀（島津公司）

YMC色譜柱（YMC -Pack Pro C18，4.6 mm×150 mm，3 μm）

1.2 藥品與試藥

乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，谷胱甘肽、磷酸、二甲基亞砜為分析純。

2-巰基苯并噻唑（純度：95.18%，批號(hào)：0831909，廠家：TCI）；二硫化二苯并噻唑（純度：97.6%，批號(hào)：5A7FG，廠家：TCI）。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法開發(fā)

文獻(xiàn)資料表明，2-巰基苯并噻唑在溶液形態(tài)及體內(nèi)可以自由轉(zhuǎn)化為其氧化形態(tài)，如圖1所示，即二硫化二苯并噻唑[2-3]，采用分別控制的策略對(duì)這兩個(gè)雜質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)難度極大且不甚合理。

圖1 2-巰基苯并噻唑與二硫化二苯并噻唑的相互轉(zhuǎn)化Fig.1 Mutual transformation of 2-Mercaptobenzothiazole and dibenzothiazole disulfide

二硫化二苯并噻唑不穩(wěn)定，與2-巰基苯并噻唑可相互轉(zhuǎn)化，使用谷胱甘肽試劑可將二硫化二苯并噻唑還原成2-巰基苯并噻唑，2-巰基苯并噻唑在319 nm處有較強(qiáng)紫外吸收，因此通過(guò)檢測(cè)2-巰基苯并噻唑從而對(duì)頭孢噻肟鈉中的2-巰基苯并噻唑和二硫化二苯并噻唑的含量進(jìn)行合并控制。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性

色譜條件用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充柱，流動(dòng)相為0.2%磷酸（量取磷酸0.2 mL至100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度）乙腈=80∶20混勻，過(guò)濾。流速為0.7 mL/min，柱溫為40 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為319 nm，進(jìn)樣量20 μL。

圖2 二硫化二苯并噻唑還原為2-巰基苯并噻唑原理Fig.2 Principle of dibenzothiazole disulfide reduction to 2-Mercaptobenzothiazole

測(cè)定法精密量取靈敏度溶液和系統(tǒng)適用性溶液注入液相色譜儀，記錄色譜圖，靈敏度溶液色譜圖中，目標(biāo)雜質(zhì)峰信噪比不小于10；系統(tǒng)適用性溶液色譜圖中，目標(biāo)雜質(zhì)峰與鄰近峰分離度不小于1.5。

精密量取2-巰基苯并噻唑?qū)φ掌啡芤鹤⑷胍合嗌V儀，記錄色譜圖，連續(xù)進(jìn)樣6次，目標(biāo)雜質(zhì)峰面積RSD≤10.0%；精密量取二硫化二苯并噻唑?qū)φ掌啡芤鹤⑷胍合嗌V儀，記錄色譜圖，二硫化二苯并噻唑?qū)φ掌分?-巰基苯并噻唑峰面積相對(duì)于2-巰基苯并噻唑?qū)φ掌分?-巰基苯并噻唑峰面積的回收率在90.0% ～ 110.0%。

精密量取供試品溶液注入液相色譜儀，記錄色譜圖，供試品溶液色譜圖中如有目標(biāo)雜質(zhì)峰，記錄目標(biāo)雜質(zhì)峰的峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算目標(biāo)雜質(zhì)含量，應(yīng)不大于0.002 8%。

2.3 樣品溶液的配制

稀釋劑 稱取谷胱甘肽約1 g，置100 mL容量瓶，先加水30 mL溶解，再加甲醇稀釋到刻度，混勻。

2-巰基苯并噻唑儲(chǔ)備液1 精密稱取2-巰基苯并噻唑適量，加二甲基亞砜溶解并定量稀釋制成每1 mL含560 μg的溶液。

2-巰基苯并噻唑儲(chǔ)備液2 精密移取1 mL 2-巰基苯并噻唑儲(chǔ)備液1至100 mL量瓶中，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻。

二硫化二苯并噻唑儲(chǔ)備液1 精密稱取二硫化二苯并噻唑適量，加二甲基亞砜溶解并定量稀釋制成每1 mL含541 μg的溶液。

二硫化二苯并噻唑儲(chǔ)備液2 精密移取1 mL二硫化二苯并噻唑儲(chǔ)備液1至100 mL量瓶中，加稀釋劑稀釋至刻度搖勻。

系統(tǒng)適用性溶液取頭孢噻肟鈉約200 mg，精密稱定至100 mL量瓶中，加適量稀釋劑超聲溶解，精密移取1 mL二硫化二苯并噻唑儲(chǔ)備液2至同一量瓶中，再加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，于45 ℃加熱反應(yīng)30 min，冷卻至室溫，即得。

靈敏度溶液精密移取1 mL 2-巰基苯并噻唑儲(chǔ)備液2至500 mL量瓶中，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，于45 ℃加熱反應(yīng)30 min，冷卻至室溫，即得。

2-巰基苯并噻唑?qū)φ掌啡芤?精密移取1 mL 2-巰基苯并噻唑儲(chǔ)備液2至100 mL量瓶中，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，于45 ℃加熱反應(yīng)30 min，冷卻至室溫，即得。

二硫化二苯并噻唑?qū)φ掌啡芤?精密移取1 mL二硫化二苯并噻唑儲(chǔ)備液2至100 mL量瓶中，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，于45 ℃加熱反應(yīng)30 min，冷卻至室溫，即得。

供試品溶液取本品，精密稱定，加稀釋劑超聲溶解并定量稀釋制成每1 mL中含2.0 mg的溶液，于45 ℃加熱反應(yīng)30 min，冷卻至室溫。

2.4 有關(guān)物質(zhì)方法驗(yàn)證

2.4.1 專屬性

按照項(xiàng)下色譜條件，取稀釋劑、2-巰基苯并噻唑溶液、頭孢噻肟鈉溶液、含有二硫化二苯并噻唑的頭孢噻肟鈉溶液分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果見圖3，空白溶液在二硫化二苯并噻唑保留時(shí)間處無(wú)色譜峰，頭孢噻肟及其他雜質(zhì)峰不干擾二硫化二苯并噻唑測(cè) 定。

圖3 液相色譜圖Fig.3 Liquid chromatogram

2.4.2 檢測(cè)限與定量限

按照項(xiàng)下色譜條件，取2-巰基苯并噻唑儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，信噪比約為3時(shí)作為檢測(cè)限溶液，并計(jì)算檢測(cè)限；信噪比約為10時(shí)作為定量限溶液，并計(jì)算定量限，結(jié)果見表1、表2。

表1 檢測(cè)限試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 The detection limit

表2 定量限試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 The quantitative limit

結(jié)論：檢測(cè)限濃度為5.338 6 ng/mL（相當(dāng)于頭孢噻肟鈉濃度為2.7ppm），S/N 均大于3∶1；均符合要求。定量限濃度為10.677 2 ng/mL（相當(dāng)于頭孢噻肟鈉濃度為5.3 ppm），S/N均大于10∶1，峰面積RSD為3.3%。

2.4.3 線性與范圍

取2-巰基苯并噻唑用稀釋劑溶解并定量稀釋制成濃度為5.6 μg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別取儲(chǔ)備液20 μL、50 μL、100 μL、200 μL、300 μL于10 mL量瓶，用稀釋劑稀釋到刻度搖勻，于45 ℃加熱反應(yīng)30 min，冷卻至室溫，作為線性溶液。

取各線性溶液進(jìn)樣，記錄色譜圖及峰面積。線性與范圍試驗(yàn)結(jié)果見表3，線性方程見圖4。

圖4 2-巰基苯并噻唑的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of 2-Mercaptobenzothiazole

表3 線性與范圍試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Linearity and range

結(jié)論：2-巰基苯并噻唑在10.677 2 ～160.158 2 ng/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R2為0.999 8，Y軸偏差與100%響應(yīng)值比值為4.6%，小于25%，均符合要求。

2.4.4 準(zhǔn)確度

配制定量限濃度準(zhǔn)確度溶液3份；分別配制50%、100%、150%限度的準(zhǔn)確度溶液各三份，12份準(zhǔn)確度溶液的加標(biāo)回收率值在95.0% ～ 113.5%之間；12份準(zhǔn)確度溶液加標(biāo)回收率的RSD為5.8%，均符合要求。

2.4.5 重復(fù)性

配制6份重復(fù)性樣品，按照限度量加入2-巰基苯并噻唑，6份重復(fù)性加標(biāo)樣品中2-巰基苯并噻唑含量的RSD為0.8%。

2.4.7 耐用性

改變流速、柱溫、色譜柱等，不同條件下系統(tǒng)適用性均符合要求，各條件下測(cè)定值RSD為1.8%，均符合要求。

3 結(jié)論

（1） 根據(jù)致癌性數(shù)據(jù)庫(kù)（CPDB數(shù)據(jù)庫(kù)），雜質(zhì)2-巰基苯并噻唑TD50數(shù)據(jù)為344 mg/ （kg·d）；根據(jù)ICH M7，按照一類致突變雜質(zhì)計(jì)算2-巰基苯并噻唑的AI（可接受攝入量）= TD50 / 50 000×50 kg =344 μg/d；根據(jù)頭孢噻肟鈉最大日劑量為12 g，因此濃度限度為C=AI（μg/d）/劑量（g/d）=344/12（μg/g）=2.867×10-5（計(jì)算公式參見ICH Q3C）。根據(jù)LCDB數(shù)據(jù)庫(kù)，二硫化二苯并噻唑TD50值為401 mg/ （kg·d），AI（可接受攝入量）為0.401 mg/ d，濃度限度為3.34×10-5。因2-巰基苯并噻唑在溶液形態(tài)可與二硫化二苯并噻唑相互轉(zhuǎn)化，因此開發(fā)方法將二硫化二苯并噻唑轉(zhuǎn)化為2-巰基苯并噻唑，為減少用藥風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)行嚴(yán)格控制，將2-巰基苯并噻唑和二硫化二苯并噻唑之和的控制限度定為2.8×10-5（以2-巰基苯并噻唑計(jì)）。按照限度2.8×10-5對(duì)上述兩個(gè)雜質(zhì)進(jìn)行分析方法開發(fā)及驗(yàn)證工作。

（2）本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC（紫外檢測(cè)器）檢測(cè)頭孢噻肟鈉中2-巰基苯并噻唑（M）和二硫化二苯并噻唑（DM）殘留量的方法，以外標(biāo)法進(jìn)行計(jì)算，該方法具有檢測(cè)限低（10-6級(jí)），準(zhǔn)確度及精密度高，樣品檢測(cè)時(shí)間短（約11 min出峰）的優(yōu)勢(shì)。

（3）對(duì)照品及供試品均需要于45 ℃加熱反應(yīng)30 min，冷卻至室溫后進(jìn)樣。加熱溫度要控制好，保證每個(gè)樣品都得到均勻加熱，加熱不均勻或時(shí)間不夠可能會(huì)影響雜質(zhì)出峰面積。