周思宇， 蘇航 ，楊文建， 萬祥旭 ，于成文， 金志民

(牡丹江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011)

大林姬鼠是一種小型鼠類,屬于脊索動物門，哺乳綱，嚙齒目，鼠科，姬鼠屬，又叫林姬鼠。廣泛棲息于多種野外林區(qū)生境，在林區(qū)和農(nóng)田中都比較多見[1]。吻部圓鈍，耳朵外露，頭部和背部毛色一致[2]。多在夜間活動，日間活動較少。以食用植物種子果實為主，對食物資源有掩埋行為[3-4]。

大林姬鼠屬哺乳動物，其腸道內(nèi)有數(shù)百種有益于健康的微生物[5]。鑒于腸道菌群對動物健康的重要作用，它被認(rèn)為是哺乳動物的一個新“器官”[6-7]。腸道微生物在營養(yǎng)消化吸收、腸道健康和免疫等諸多方面發(fā)揮著重要作用，是動物生存和適應(yīng)環(huán)境的關(guān)鍵[8]。大量研究表明，哺乳動物腸道疾病的發(fā)生與腸道微生物的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[9-11]。本研究通過微生物測序技術(shù)對，為嚙齒動物在復(fù)雜的林區(qū)中共存的適應(yīng)機制提供數(shù)據(jù)，為農(nóng)林有害微生物的防治、嚙齒動物消化系統(tǒng)功能、實驗室飼養(yǎng)野生動物的深入研究提供了基礎(chǔ)的微生物數(shù)據(jù)，對鼠害防控有著重要意義。

1 材料和方法

1.1 樣品的采集與保存

采用籠捕法，在牡丹江市三道關(guān)林場(地理位置位于黑龍江省牡丹江市的西北部，張廣才嶺安紡山脈之末，具有豐富的動植物資源，林場中心坐標(biāo)為129°41′E,44°20′N)內(nèi)采集，篩選優(yōu)良活躍成年大林姬鼠個體雌雄各5只(表1)。樣本帶回實驗室靜止放置 30 min 讓其情緒穩(wěn)定后，在無菌條件下，迅速將鼠脫頸處死，小心地將鼠的腸道取出，立即放入裝有液氮的研缽中速凍，裝入2 mL無菌凍存管中，標(biāo)記好后保存在-80℃冰箱，每只樣本全部操作流程控制在2 min內(nèi)完成。

表1 雌、雄樣品編號

1.2 樣本總DNA的提取

采用CTAB/SDS方法，對腸道組織進行總DNA的提取，經(jīng)過1.8 %瓊脂糖電泳20 min檢測有明亮條帶為提取成功。用無菌水把DNA稀釋為1 ng/μL。使用通用引物對16SrRNA基因V3-V4區(qū)進行擴增(通用引物為：上游引物515F：5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3',下游引物806R:5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')。在HiSeq 2500 PE 250 平臺對純化的產(chǎn)物進行雙端測序。將所得到的樣本數(shù)據(jù)進行處理，確定嵌合體部分并篩除該部分序列。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品中有效序列和OTU數(shù)目

此次研究通過高通量測序技術(shù)對10份樣品便進行 16S rRNA 測序。共獲得有效序列508 269條，平均每個樣品中含有50 827條有效序列，其中雌性具有245 311條，雄性含有262 958條?；谙嗨贫?97%的原則，將獲得的有效tags序列進行聚類，共獲得693個OTUs，平均每個樣品含有69個OTUs。其中，有效序列數(shù)量最高的是SDGDL2有58 752條有效序列，最低的是SDGDL1有43 398條有效序列，二者相差15 354條。韋恩圖中重疊部分為所有樣品共有的OUT數(shù)目，由圖1可知10個樣品中共有581個OTUs。

圖1 雌性和雄性大林姬鼠OTUs韋恩圖

2.2 Alpha多樣性分析

根據(jù)OTU數(shù)據(jù)繪制了稀疏性曲線如圖2，當(dāng)測序深度增加曲線達到平緩，說明增加測序深度不能發(fā)現(xiàn)新的特征序列，測序具有合理性。有效反映了大林姬鼠腸道微生物菌群的多樣性。Alpha多樣性指數(shù)如表2所示，Ace指數(shù)范圍408.74～556.71，Chao1指數(shù)范圍441.58～560.07，Shannon指數(shù)范圍4.45～6.35，Simpson指數(shù)范圍0.87～0.97。

表2 雌、雄大林姬鼠腸道微生物Alpha多樣性指數(shù)

圖2 雌、雄大林姬鼠樣本的稀釋性曲線

2.3 物種相對分布

2.3.1 門分類水平上的組成。各樣品在門水平的豐富度見圖3，雌、雄大林姬鼠的腸道菌群Top5的優(yōu)勢門類分別為，厚壁菌門Firmicutes(雌55.264%，雄43.321%)、擬桿菌門Bacteroidetes(雌23.231%，雄19.920%)、Epsilonbacteraeota(雌8.608%，雄15.166%)、變形菌門Proteobacteria(雌6.641%，雄7.189%)，但雌性大林姬鼠第五大優(yōu)勢門類為Patescibacteria所占比例為1.740%，而雄性大林姬鼠第五大優(yōu)勢門類為柔膜菌門Tenericutes，占比6.475%。通過對比發(fā)現(xiàn)，雌、雄大林姬鼠前四大優(yōu)勢門類種類相同但所占比例各不相同，且第五大優(yōu)勢門類雌性為Patescibacteria，雄性為Tenericutes。由此可見，不同性別大林姬鼠腸道內(nèi)的各類菌群在門水平上存在比例上的差異。

圖3 雌、雄大林姬鼠腸道菌群門水平上豐度圖

2.3.2 屬分類水平上的組成。各樣品自屬水平上的豐富度見圖4，在雌性大林姬鼠腸道菌群Top5中第一大優(yōu)勢菌群為Lactobacillus占比18.955%、第二大優(yōu)勢菌群為unidentified_Lachnospiraceae占比9.931%、第三大優(yōu)勢菌群為螺桿菌屬Helicobacter占比8.608%，第四大優(yōu)勢菌群為unidentified_Muribaculaceae占比8.246%，第五大優(yōu)勢菌群為毛螺菌科NK4A136組(Lachnospiraceae_NK4A136_group)占比7.940%；在雄性大林姬鼠腸道菌Top5中第一大優(yōu)勢菌群為螺桿菌屬Helicobacter占比15.166%、第二大優(yōu)勢菌群為毛螺菌科NK4A136組(Lachnospiraceae_NK4A136_group)占比13.562%、第三大優(yōu)勢菌群為unidentified_Muribaculaceae占比10.656%、第四大優(yōu)勢菌群為unidentified_Lachnospiraceae占比9.674%、第五大優(yōu)勢菌群為乳酸菌屬Lactobacillus占比5.845%。由此可見，不同性別的大林姬鼠腸道內(nèi)的各菌群在屬水平上存在比例上的差異。

圖4 雌、雄大林技術(shù)腸道菌群屬水平上豐度圖

2.4 雌、雄大林姬鼠heatmap圖分析

圖5是基于weighted-UniFrac 的樣品距離heatmap 圖。從圖中可以看出，大林姬鼠的雌性和雄性腸道內(nèi)的微生物菌群沒有明顯的差異。

圖5 雌、雄大林姬鼠腸道菌群豐度熱圖

2.5 功能預(yù)測

PICRUSt軟件中比對16S測序數(shù)據(jù)獲得的物種組成信息，推測樣本中的功能基因組成，從而分析不同樣本或分組之間在功能上的差異。KEGG通路分析預(yù)測出很多基本代謝功能基因，主要涉及的在一層功能層級上的6類代謝通路為：有機系統(tǒng)、代謝、人類疾病、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、細(xì)胞過程，其中代謝、遺傳信息和環(huán)境信息處理為主要的3類通路。在二功能層水平共注釋到43個代謝功能，功能豐度見圖6，豐度高于1%的前3個代謝功能是Global and overview maps(雌41.099%,雄41.820%)、碳水化合物代謝Carbohydrate metabolism(雌9.800%，雄9.190%)、氨基酸代謝Amino acid metabolism(雌6.108%，雄6.368%)。在雌性大林姬鼠中第四位功能為膜轉(zhuǎn)運能量代謝Membrane transport占比4.088%，第五功能為核苷酸代謝Nucleotide metabolism占比4.037%；在雄性大林姬鼠中第四功能為能量代謝Energy metabolism占比4.125%，第五功能為輔助因子和維生素的代謝Metabolism of cofactors and vitamins占比4.034%。

圖6 雌、雄大林姬鼠KEGG功能預(yù)測

3 討論

腸道菌群主要的作用是幫助宿主分解食物和獲取營養(yǎng)，特別是體內(nèi)有益菌幫助宿主提高蛋白質(zhì)、糖及維生素等的獲得量，增強宿主對食物的利用，在動物的不斷進化中，食物資源、動物、微生物的生存相互影響，在食物不足時，不適應(yīng)環(huán)境的個體會被淘汰。在林區(qū)復(fù)雜環(huán)境下，食物資源會隨著季節(jié)而發(fā)生改變，動物的腸道菌群也會伴隨著改變，本實驗為了排除季節(jié)的影響，所以只研究食物資源較豐富的秋季，在鼠類的腸道菌中常見的有益菌為厚壁菌門中的乳桿菌和擬桿菌門中的雙歧桿菌，在本次調(diào)查中，大林姬鼠的腸道菌群中包括潛在益生菌有乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、片球菌屬(Pediococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、乳球菌屬(Lactococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)等乳酸菌，但是在本次調(diào)查中沒有檢測到雙歧桿菌的存在，這可能是嚙齒動物在秋季主要食用植物種子的原因，體內(nèi)其他菌占據(jù)優(yōu)勢或食物組成的菌群對雙歧桿菌有抑制作用，也有可能是地理環(huán)境的原因，具體的影響機制仍需研究。