劉艷杰，邢振楠，王丹麗，馬珂，劉邦

(黑龍江省林業(yè)科學(xué)院伊春分院，黑龍江 伊春 153000)

藍(lán)靛果(LoniceraedulisTurcz.)落葉小灌木,忍冬科忍冬屬[2]。常生長(zhǎng)于寒帶地區(qū),植被越冬不需要抗寒,其果實(shí)中營(yíng)養(yǎng)豐富,擁有多種人們?nèi)粘Ｋ璧木S生素、礦物質(zhì)，另外它的花青素含量較高、普遍高于藍(lán)莓中的花青素含量，因此常用來開發(fā)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的保健品，在森林食品等方面廣泛應(yīng)用[3]。研究結(jié)果表明，藍(lán)靛果的果實(shí)富含多種酚類物質(zhì)，其中非花色苷酚類主要有綠原酸、新綠原酸、槲皮索-3-蕓香糖苷和槲皮素-3-葡萄糖苷等。綠原酸是一種重要的生物活性物質(zhì)，它又許多功效，其中抗腫瘤、降血壓、血脂、清除自由基等功效最為顯著[4]。因此,從藍(lán)靛果中提取綠原酸具有很高的應(yīng)用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，可以顯著提高藍(lán)靛果的經(jīng)濟(jì)附加值，實(shí)現(xiàn)藍(lán)靛果的綜合利用。超聲波輔助提取法具有明顯優(yōu)勢(shì)，可以明顯提高提取效率，并且易實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的工業(yè)化應(yīng)用。同時(shí)，用酶法提取可以加快細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)破壞的速度和程度，顯著改善提取效果[5]。然而，采用超聲波輔助酶法提取藍(lán)靛果中綠原酸活性成分的研究未見報(bào)道。以藍(lán)靛果為原料，利用超聲波輔助酶法提取綠原酸，并用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)其提取條件進(jìn)行了優(yōu)化。為藍(lán)靛果中綠原酸有效成分的提取探索一種新的途徑。

1 儀器與材料

藍(lán)靛果(產(chǎn)于小興安嶺伊春)，綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品、甲醇、中性蛋白酶，纖維素酶，果膠酶，淀粉酶均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，其他試劑均為分析純。

真空泵、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、電子天平、分液漏斗、酸度計(jì)、移液器、電子天平、紫外可見分光光度計(jì)、超聲波發(fā)生器、 恒溫水浴禍、離心機(jī)等。

2 方法與結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)方法

2.1.1 藍(lán)靛果中綠原酸酶法提取的單因素實(shí)驗(yàn)。將藍(lán)靛果完全破碎以破碎作為實(shí)驗(yàn)原料，按照1∶10的比例加入水(料液比，w/w)，加入酶，用恒溫酶解。經(jīng)過酶解處理完成的藍(lán)靛果用超聲波作用30 min。分別實(shí)驗(yàn)提取溫度、酶的種類、酶解的時(shí)間、酶的用量等對(duì)藍(lán)靛果中綠原酸提取率的影響。

2.1.2 超聲輔助酶法提取的顯著性作用實(shí)驗(yàn)。在其他實(shí)驗(yàn)條件相同的情況下，比較酶法處理藍(lán)靛果和超聲輔助酶法處理藍(lán)靛果對(duì)藍(lán)靛果中綠原酸提取率的影響。

2.1.3 超聲輔助酶法提取藍(lán)靛果中綠原酸條件的優(yōu)化。以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，設(shè)置不同的酶解反應(yīng)用量、酶解反應(yīng)溫度、酶解反應(yīng)時(shí)間為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)因素，通過L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，研究超聲輔助酶法提取藍(lán)靛果中綠原酸提取率的工藝，以優(yōu)化出藍(lán)靛果中綠原酸用酶法提取的最佳工藝參數(shù)。

2.1.4 分析方法[6]。參照朱松等的檢測(cè)方法，采用高效液相色譜法定量分析提取出的綠原酸。

2.2 結(jié)果分析

2.2.1 酶種類對(duì)提取效果的影響。取藍(lán)靛果處理后樣品5 g，按照1∶10的料水比例，加入50 mL水，分別添加酶制劑，水浴鍋中酶解溫度設(shè)定為40 ℃，反應(yīng)時(shí)間定時(shí)60 min，當(dāng)水浴鍋溫度升高至85 ℃時(shí)滅酶，冷卻至室溫，用HPLC法測(cè)定產(chǎn)物中綠原酸含量，并根據(jù)公式計(jì)算提取率，結(jié)果見圖1。由圖一可以看出，用1%的纖維素酶處理后，得到的藍(lán)靛果中綠原酸提取率最大，故藍(lán)靛果中綠原酸提取的最佳酶制劑為纖維素酶[7]。

圖1 酶種類對(duì)藍(lán)靛果中綠原酸提取的影響

2.2.2 酶的用量對(duì)提取效果的影響。從圖2可以看出，隨著酶用量的增加，綠原酸的提取率是不斷升高的，但當(dāng)酶的用量達(dá)到1.5% 時(shí)，盡管酶的添加量再增加，對(duì)綠原酸的提取效果的影響卻沒有明顯變化。分析原因可能當(dāng)酶添加量未達(dá)到最佳量時(shí)，酶解反應(yīng)進(jìn)行得不十分完全，釋放出的綠原酸量較少，當(dāng)酶的添加量達(dá)到最適宜量時(shí)，酶解反應(yīng)已經(jīng)進(jìn)行的較徹底，如果酶的用量再繼續(xù)加大，反應(yīng)進(jìn)程不會(huì)有顯著變化。

圖2 酶用量對(duì)提取物的影響

圖3 酶解時(shí)間對(duì)提取物的影響

由圖3可以看出，隨著酶解反應(yīng)時(shí)間的增加，藍(lán)靛果中綠原酸的提取率不斷升高。當(dāng)?shù)孜锏拿附鈺r(shí)間為1 h時(shí)，綠原酸提取率達(dá)到峰值。過了峰值后期反應(yīng)趨于平緩，綠原酸的提取率相對(duì)穩(wěn)定且緩慢下降。這可能是由于當(dāng)酶的活力得到充分發(fā)揮后，酶解反應(yīng)已進(jìn)行的較完全，即使反應(yīng)時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，綠原酸的提取率也不會(huì)增高。

2.2.3 酶解溫度對(duì)提取效果的影響。圖4表明，剛開始加入酶后，綠原酸的提取率是和酶解溫度成正比的，酶解溫度到達(dá)40 ℃時(shí)，提取率達(dá)到峰值。后期綠原酸的提取率隨著反應(yīng)溫度的升高反而下降。其中可能因?yàn)橐皇敲傅幕钚砸驕囟鹊倪^高而降低，抑制酶解反應(yīng)，因此綠原酸含量不再增加，甚至有降低的趨勢(shì)[8]。二是綠原酸的鄰苯二酚結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，酶解溫度越高，易氧化分解。所以，最適宜的酶解溫度為40 ℃[3]。

圖4 酶解溫度對(duì)綠原酸提取率的影響

2.2.4 超聲作用對(duì)酶法提取率的顯著性影響。超聲波輔助法對(duì)藍(lán)靛果中綠原酸有效成分提取的影響見表1。由表1可以看出，藍(lán)靛果中綠原酸有效成分的提取應(yīng)用超聲波輔助法有顯著影響，藍(lán)靛果經(jīng)超聲波輔助作用后，其中綠原酸的平均提取率從85.2%提高到89.6%，分析原因，可能是由于藍(lán)靛果的細(xì)胞結(jié)構(gòu)被超聲波作用后，進(jìn)一步破壞，從而有效的提升了綠原酸的提取率。

表1 超聲波處理對(duì)綠原酸提取的影響

2.3 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取工藝

在單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)L9(34)正交實(shí)驗(yàn)(見表2、表3)。

表2 因素水平表

表3 正交實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果

表4 正交實(shí)驗(yàn)極差分析

由表4可以看出，各單因素對(duì)綠原酸提取率的影響大小的順序?yàn)锳>B>C，由此可確定最佳的提取方案為A3B3C2，即酶解法提取藍(lán)靛果中綠原酸的最佳工藝及條件為：酶液量1%，40 ℃水浴中恒溫處理1.5 h；綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提取藍(lán)靛果中綠原酸的條件為1%的酶用量、1.5 h的酶解時(shí)間，50 ℃的酶解溫度。

3 結(jié)論

通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在植物有效活性成分的提取實(shí)驗(yàn)中，可將纖維素酶和超聲波兩種辦法結(jié)合起來。因?yàn)槔w維素酶不但能促進(jìn)植物體內(nèi)有效成分的釋放，而且是可將植物組織快速和徹底分解的一種有效酶制劑，其反應(yīng)條件簡(jiǎn)單且不破壞生物體的活性。超聲波輔助提取方法因其具有用時(shí)短、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于森林食品天然產(chǎn)物有效成分的提取中。因此可將兩種方法結(jié)合應(yīng)用到植物活性成分的提取實(shí)驗(yàn)中。

實(shí)驗(yàn)得出了藍(lán)靛果中綠原酸提取的最佳工藝條件為：1%酶的用量 、1.5 h酶解時(shí)間、40 ℃酶解溫度。優(yōu)化了超聲輔助酶法提取藍(lán)靛果中綠原酸的工藝，在最佳條件下，藍(lán)靛果中綠原酸的提取率為89.6%。因此，可以得出結(jié)論，超聲波輔助酶法提取藍(lán)靛果中綠原酸，可顯著提高提取率。