趙 業(yè)，張凱聞，梁 麗，熊 焰，李 挺

結(jié)核病是結(jié)核桿菌感染導(dǎo)致的慢性傳染病，我國結(jié)核病病例數(shù)居全球前列，其防治工作是醫(yī)療人員的重要任務(wù)[1]。結(jié)核病的治愈率和疫情的有效控制需具有及時(shí)和準(zhǔn)確的診斷，檢測結(jié)核桿菌的手段多種多樣，其中抗酸染色又稱為Ziehl-Neelsen染色[2]。長期以來抗酸染色的操作和診斷均為人工完成，染色質(zhì)量難以保證，診斷不僅費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，且陽性率低。近年隨著全自動染色機(jī)在病理科的應(yīng)用，抗酸染色切片質(zhì)量明顯提高，在一定程度上提高了病理醫(yī)師檢測陽性桿菌的工作效率，但其費(fèi)時(shí)、費(fèi)力的瓶頸仍未能得到突破。本實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)CNN平臺的結(jié)核桿菌識別人工智能(tuberculosis bacillus finder, TB-Finder)，作為抗酸染色病理檢測的初篩手段，在臨床試驗(yàn)中具有高度敏感性和較高的特異性，為徹底解決結(jié)核桿菌抗酸染色病理診斷的難題提供強(qiáng)有力的工具[3]。本文將Benchmark全自動染色和TB-Finder應(yīng)用于抗酸染色的病理診斷，創(chuàng)建智能化抗酸桿菌檢測模式，對比其與傳統(tǒng)抗酸桿菌檢測模式(手工染色+人工閱片)的實(shí)驗(yàn)效率、染色質(zhì)量和診斷準(zhǔn)確率，探討智能化抗酸桿菌檢測在結(jié)核病理診斷中的價(jià)值及流程優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料收集2019年7月～2020年7月北京大學(xué)第一醫(yī)院病理科診斷肉芽腫性病變的石蠟包埋標(biāo)本150例，常規(guī)4.5 μm厚切片。每例均帶已確定抗酸陽性的對照組織，70 ℃烤片40 min。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.2 儀器與試劑

1.2.1儀器 Benchmark自動染色機(jī)，Sukura封片機(jī)，標(biāo)簽打印機(jī)，Leica切片機(jī)，Leica水浴，Leica烤片臺，3DHISTECH掃描儀。

1.2.2試劑 堿性復(fù)紅，無水乙醇，石碳酸，亞甲基藍(lán)，1%鹽酸乙醇，蘇木精，Depar脫蠟液，LCS液，Wash清洗液，蒸餾水等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1手工染色 操作步驟：(1)切片脫蠟至水；(2)入石碳酸復(fù)紅液1 h，入37 ℃或56 ℃溫箱孵育30 min；(3)蒸餾水洗凈；(4)0.5%鹽酸乙醇分化；(5)蒸餾水洗，用0.1%亞甲基藍(lán)水溶液復(fù)染10 min；(6)蒸餾水洗，經(jīng)95%乙醇分化；(7)100%乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固[3]。

1.3.2Benchmark全自動染色 (1)檢查：開機(jī)后檢查機(jī)器是否運(yùn)轉(zhuǎn)正常，查看緩沖試劑桶內(nèi)的試劑及廢液桶，確保有能夠完成當(dāng)次染色的液位；(2)備片：在電腦中選擇需要的染色項(xiàng)目方案，打印標(biāo)簽，貼于切片，制片并烘干；(3)運(yùn)行：將玻片平放在染色托上，標(biāo)簽側(cè)朝外，組織朝上，確定四角鎖定好后關(guān)閉載片倉，將染色項(xiàng)目試劑放入試劑臺，打開試劑蓋，點(diǎn)擊“運(yùn)行”，機(jī)器自動掃描每張玻片和試劑，電腦顯示工作狀態(tài)圖為黃色并出現(xiàn)倒計(jì)時(shí)，染色自動開始；(4)完成：工作狀態(tài)圖為綠色，取下玻片，運(yùn)行清洗項(xiàng)目(圖1)。

圖1 自動染色機(jī)基本結(jié)構(gòu)

1.4 病理診斷

1.4.1人工診斷 由兩位病理醫(yī)師分別閱片、作出病理診斷；診斷一致的病例，記錄為最終診斷；診斷不一致的病例，共同閱片、討論、達(dá)成一致，作為該病例的最終診斷。

1.4.2智能化診斷 采用TB-Finder初篩+病理醫(yī)師復(fù)核的模式。(1)采用3DHISTECH掃描儀掃描抗酸染色切片，數(shù)字切片提交TB-Finder。(2)TB-Finder初篩采用兩階段模型設(shè)計(jì)，第一階段為目標(biāo)檢測階段，目的為識全切片圖像上的所有桿菌候選物，采用具備State-of-the-art性能的目標(biāo)檢測神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)RetinaNet基礎(chǔ)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，并加入可變卷積、Swish激活函數(shù)、半精度訓(xùn)練等優(yōu)化設(shè)計(jì)。采用包圍框標(biāo)注記錄桿菌在截圖上的頂點(diǎn)位置，最終模型在測試集上達(dá)到mAP@0.5=0.88。第二階段為分類階段，根據(jù)第一階段的檢測結(jié)果將整張切片分為陰性、陽性。從第一階段的檢測結(jié)果中選出置信度最高的10個(gè)桿菌候選物，將檢測框置信度、檢測框大小作為特征值輸入SVM模型。根據(jù)500例具有活檢診斷記錄的抗酸桿菌切片，其中200例原始診斷為桿菌陽性、300例診斷為陰性，采用6 ∶2 ∶2的數(shù)據(jù)拆分比例，模型在測試集上達(dá)敏感性100%和特異性76%。(3)病理醫(yī)師復(fù)核：TB-Finder標(biāo)注的陽性桿菌，病理醫(yī)師對數(shù)字圖片進(jìn)行復(fù)核，有疑問的病例在光鏡下進(jìn)行驗(yàn)證。(4)最終病理診斷：TB-Finder初篩為陰性者為抗酸陰性；TB-Finder初篩為陽性者，需經(jīng)病理醫(yī)師在數(shù)字切片或光鏡下確認(rèn)，仍為陽性者為抗酸陽性(圖2)，反之為抗酸陰性[4]。

圖2 結(jié)核病-人工智能+人工復(fù)核陽性病例數(shù)字圖像，抗酸染色

1.5 染色切片質(zhì)量評估由兩位病理醫(yī)師分別對手工和自動染色切片進(jìn)行質(zhì)量評分。評分標(biāo)椎：(1)整體顏色：顏色不一致1分，一致性好2分；(2)菌體顏色：淺紅色1分，紫紅色2分(陰性病例的評分參考陽性對照組織)；(3)背景顏色：不著色1分，藍(lán)色2分；(4)脫片：部分脫片1分，無脫片2分；(5)污染：有雜質(zhì)1分，無雜質(zhì)2分。上述各項(xiàng)評分相加為總評分：5分為差，6～8分為良，9～10分為優(yōu)[5]，取兩位醫(yī)師評分的平均值作為該切片的最終評分。

2 結(jié)果

2.1 抗酸檢測陽性率150例樣本經(jīng)智能化檢測模式的陽性率為29.3%(44/150)，傳統(tǒng)檢測模式的陽性率為6.6%(10/150)。

2.2 切片質(zhì)量評分手工染色150例，切片質(zhì)量評分5～10分，平均7.8分，優(yōu)98張，良45張，差7張，優(yōu)良率95.3%(優(yōu)65.3%、良30%)。自動染色150例，切片質(zhì)量評分7～10分，平均8.9分，優(yōu)112張，良38張，差0張，優(yōu)良率100%(優(yōu)74.7%、良25.3%)；兩者差異有顯著性(P<0.05)。

2.3 效率(1)染色：手工染色全流程耗時(shí)約110 min(含脫蠟)，自動染色約48 min，自動染色節(jié)約時(shí)間62 min。手工染色，一次最多染4～8張，自動染色一次通量為20張。(2)診斷：人工閱片每張切片平均耗時(shí)30 min，TB-Finder則只需2 min，另行切片掃描和人工復(fù)核，智能化系統(tǒng)每張切片平均耗時(shí)10 min。(3)染色+診斷全流程：智能化平臺每張切片耗時(shí)12 min，傳統(tǒng)模式每張切片耗時(shí)57 min，智能化平臺節(jié)約時(shí)間成本約78%。

2.4 人工閱片和TB-Finder閱片的比較150例機(jī)染切片，醫(yī)師人工閱片陽性21例。TB-Finder閱片陽性54例，不一致病例33例，均為人工閱片陰性，TB-Finder閱片陽性。

3 討論

長期以來抗酸染色均為手工完成，存在不穩(wěn)定因素較多，對操作者的技術(shù)要求高，導(dǎo)致染色質(zhì)量難以控制。結(jié)核桿菌長度僅約4 μm，直徑不足1 μm，是影響結(jié)核病理診斷的主要因素[5-6]。因此，提高抗酸染色切片質(zhì)量，降低尋找陽性桿菌的難度，是提升抗酸染色在結(jié)核病理診斷中應(yīng)用價(jià)值的兩大要素。

人工智能源于1956年美國召開的人工智能達(dá)特茅斯夏季研討會[7]，CNN是近年發(fā)展的一種非常高效的人工智能，尤其在圖像識別領(lǐng)域取得驚人的突破，同時(shí)具備高效率、客觀穩(wěn)定、長時(shí)間高負(fù)荷工作等優(yōu)點(diǎn)。與復(fù)雜的組織細(xì)胞形態(tài)相比，結(jié)核桿菌形態(tài)簡單，識別難度小，將人工智能引入抗酸染色切片的初篩可提高檢出率。本課題組根據(jù)CNN平臺自主研發(fā)的結(jié)核桿菌識別人工智能TB-Finder，作為抗酸染色病理檢測的初篩手段，具有高度敏感性和較高的特異性[4]。

盡管人工智能在尋找抗酸桿菌的工作中具有顯著優(yōu)勢，但其適應(yīng)能力遠(yuǎn)不如病理醫(yī)師，因此一致性好、色彩鮮亮、對比度好的染色切片是其發(fā)揮強(qiáng)大工作能力的基礎(chǔ)。手工染色切片受多種不確定因素的影響，嚴(yán)重影響了人工智能的工作效率。Benchmark全自動染色機(jī)是由染色模塊、緩沖液模塊、廢液收集模塊于一體的統(tǒng)一機(jī)械化運(yùn)行，從而確保染色環(huán)境的相對封閉，減少了人為和外界環(huán)境變化的干擾，同時(shí)恒量的液體滴加和標(biāo)準(zhǔn)化的機(jī)械操作，使每一次染色的濃度均能保持一致，最終保證了切片顏色的均勻性和一致性。本組150例石蠟樣本，每個(gè)樣本連續(xù)切片2張，平行進(jìn)行手工抗酸染色和自動抗酸染色，自動染色組(平均分8.9分、優(yōu)良率100%)切片染色質(zhì)量評分高于手工染色組(平均7.8分、優(yōu)良率95.3%)。因此，與手工染色相比，自動染色更能匹配人工智能的應(yīng)用，順應(yīng)了人工智能時(shí)代病理發(fā)展的潮流。

本組將Benchmark全自動染色和TB-Finder整合應(yīng)用于抗酸染色的病理診斷，創(chuàng)建智能化抗酸桿菌檢測平臺，對比傳統(tǒng)抗酸桿菌檢測模式(手工染色+人工閱片)，病理診斷陽性率明顯提高(智能化模式29.3%vs傳統(tǒng)模式6.60%)，且染色過程節(jié)約了時(shí)間成本，TB-Finder初篩又為病理醫(yī)師節(jié)約了大量閱片時(shí)間。本組結(jié)果顯示，染色加診斷全流程，智能化平臺比傳統(tǒng)模式節(jié)約時(shí)間成本約78%。

先進(jìn)技術(shù)的應(yīng)用極大提升了生產(chǎn)力，但卻并非完全替代人的作用。首先，在染色環(huán)節(jié)，由于機(jī)器的工作是連續(xù)不間斷的，出現(xiàn)錯(cuò)誤需從新開始，降低效率。因此，應(yīng)做好前期的準(zhǔn)備工作，尤其是標(biāo)簽準(zhǔn)備、廢液桶及試劑瓶液位、染色試劑的剩余完成次數(shù)等關(guān)鍵環(huán)節(jié)需操作人員重點(diǎn)關(guān)注。為保證機(jī)器穩(wěn)定、高效的運(yùn)行，經(jīng)常維護(hù)，定期清洗，注意試劑pH值的把控，嚴(yán)格規(guī)范操作等細(xì)節(jié)都是必不可少的。其次，自動化雖然降低了人的勞動強(qiáng)度，提高了工作效率，但制作優(yōu)質(zhì)的抗酸染色切片仍需實(shí)驗(yàn)人員具備高度的責(zé)任心和精益求精的工作作風(fēng)。最后，病理診斷必須由病理醫(yī)師完成。本實(shí)驗(yàn)人工閱片和TB-Finder判讀結(jié)果不一致者33例(22%)，將其病例的TB-Finder標(biāo)注圖像由病理醫(yī)師復(fù)核，其中23例為真陽性，不一致的原因是人工閱片漏診所致；其中10例TB-Finder找到的陽性菌不在肉芽組織和壞死中，被醫(yī)師判為非致病菌，屬于假陽性。由此可見，在實(shí)際應(yīng)用中病理醫(yī)師應(yīng)認(rèn)識到TB-Finder的局限性，尤其是無法鑒別致病菌和非致病菌。因此，TB-Finder的檢測結(jié)果必須經(jīng)病理醫(yī)師復(fù)核確認(rèn)后，才能作出抗酸染色陽性的診斷。

綜上所述，由自動染色、人工智能組成的智能化抗酸桿菌檢測平臺，不僅提高了工作效率，降低勞動強(qiáng)度，減少漏診率，提高結(jié)核的檢出率，還有助于規(guī)范質(zhì)量控制和減少環(huán)境污染，使抗酸染色在結(jié)核診斷中發(fā)揮重要作用，值得臨床推廣。