顧陽陽，譚曉輝，宋文鵬，方 冬，宋衛(wèi)東，袁亦銘，馮寧翰，關(guān)瑞禮△

(1. 北京大學(xué)第一醫(yī)院泌尿外科，北京大學(xué)泌尿外科研究所， 北京 100034； 2. 南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫第二醫(yī)院泌尿外科， 江蘇無錫 214002)

勃起功能障礙(erectile dysfunction，ED)指的是男性無法獲得或維持勃起以獲得滿意的性交[1]。近年來，眾多研究人員一直致力于研究ED的發(fā)病機制，并認(rèn)為ED主要是一種血管起源的疾病。在患有糖尿病、高膽固醇血癥和心血管疾病的男性中，ED的發(fā)病率顯著增加。內(nèi)皮功能完整性的喪失和內(nèi)皮功能障礙在此類ED的發(fā)生、發(fā)展中起著不可或缺的作用。心血管疾病和內(nèi)皮功能障礙通過減少血液流入、動脈功能不全或動脈狹窄導(dǎo)致ED[2]。事實上，ED和心血管疾病密切相關(guān)，有相關(guān)癥狀的男性可能需要進行系統(tǒng)性的心臟評估。外部刺激可以改變正常的內(nèi)皮功能并導(dǎo)致ED發(fā)作，例如氧化應(yīng)激和炎癥[3]。內(nèi)皮功能障礙是ED的關(guān)鍵病理特征之一。勃起過程中血管舒張受損主要是由于內(nèi)皮細(xì)胞最重要的血管舒張劑一氧化氮(nitric oxide，NO)釋放減少所致。NO主要由海綿體內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)產(chǎn)生釋放，因此eNOS的活化調(diào)控對恢復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞損傷及修復(fù)勃起功能不可缺少且極其重要[4]。

游離脂肪酸是常見的心血管疾病危險因素，且與肥胖和2型糖尿病等代謝性疾病密切相關(guān)[5-6]。最近的研究表明，游離脂肪酸不僅是導(dǎo)致胰島素抵抗的主要原因，而且還會在內(nèi)皮、肝和骨骼肌等組織中靶向胰島素誘導(dǎo)炎癥[5,7]。因此，目前認(rèn)為血液中升高的游離脂肪酸和胰島素抵抗、炎癥、肥胖、2型糖尿病、高血壓之間存在重要聯(lián)系。此外，越來越多的證據(jù)表明，游離脂肪酸在內(nèi)皮功能障礙中也具有重要作用。具體來說，胰島素抵抗、氧化應(yīng)激和炎癥是游離脂肪酸誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能障礙的主要原因[8]。糖尿病和其他代謝狀態(tài)會導(dǎo)致游離脂肪酸升高，進而引發(fā)內(nèi)皮組織炎癥和產(chǎn)生氧化應(yīng)激的轉(zhuǎn)錄因子。此外，游離脂肪酸，尤其是棕櫚酸(palmitic acid，PA)，還會促進內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡并對內(nèi)皮祖細(xì)胞產(chǎn)生諸多負(fù)面影響[9-10]。

本課題組先前的研究結(jié)果證實，單黃酮類藥物淫羊藿次苷Ⅱ(icariside Ⅱ，ICA Ⅱ)在多種ED模型中能顯著促進內(nèi)皮細(xì)胞增殖，恢復(fù)內(nèi)皮功能障礙[11-12]，然而ICA Ⅱ面臨著生物利用度低、溶解度低等臨床轉(zhuǎn)化困境。當(dāng)前關(guān)于雙黃酮類藥物在ED中的研究甚少。本研究使用雙黃酮類化合物4′-甲基醚金連木黃酮(4′-O-methylochnaflavone，MF)，以PA高脂模型為切入點，比較MF和ICA Ⅱ?qū)Υ藯l件下大鼠陰莖海綿體內(nèi)皮細(xì)胞(rat cavernous endothelial cells，RCECs)增殖和內(nèi)皮功能的影響，并探索蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/AKT)及eNOS信號通路的作用機制。

1 資料與方法

1.1 試劑與材料

RCECs購自武漢普諾賽生命科技有限公司，PA粉末、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)購自北京索萊寶科技有限公司，MF和ICA Ⅱ購自北京倍特仁康生物醫(yī)藥科技有限公司，MF和ICA Ⅱ的化學(xué)結(jié)構(gòu)示意圖見圖1。內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素溶液、內(nèi)皮細(xì)胞生長補充劑均購自美國ScienCell公司，胰蛋白酶購自美國Gibco公司，總蛋白提取試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司，BCA蛋白定量試劑盒購自愛必信生物技術(shù)有限公司，PAGE凝膠快速制備試劑盒購自大連美侖生物技術(shù)有限公司，Western blot所涉及的一抗和二抗分別購自美國Cell Signaling Technology公司和北京中山金橋生物技術(shù)有限公司，NO熒光探針購自碧云天生物技術(shù)有限公司，CCK-8試劑盒購自凱基生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 PA溶液的配置

配置10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的無脂肪酸BSA溶液，用渦旋法將512.8 mg粉末狀PA完全溶解在10 mL無水乙醇中，55 ℃條件下將PA溶液和10%的BSA按1 ∶19的比例混合，制得10 mmol/L的PA工作液，分別用0.45 μm、0.22 μm微孔濾膜無菌過濾，分裝儲存于-20 ℃。

圖1 4′-甲基醚金連木黃酮和淫羊藿次苷Ⅱ的化學(xué)結(jié)構(gòu)示意圖Figure 1 Chemical structure of 4′-O-methylochnaflavone and icariside Ⅱ

1.3 RCECs的體外培養(yǎng)和模型構(gòu)建

RCECs的培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2的常規(guī)濕度無菌環(huán)境。每2天更換培養(yǎng)液1次，當(dāng)細(xì)胞生長至融合度80%～90%時，按1 ∶3比例傳代。細(xì)胞干預(yù)前將一定數(shù)量的細(xì)胞接種至10 cm培養(yǎng)皿內(nèi)，24 h后(融合度約為70%～80%)實驗組更換為含有不同濃度藥物的完全培養(yǎng)基，然后加入適量PA工作液(終濃度150 μmol/L)模擬高脂環(huán)境。具體分組如下：第一組用MF(終濃度0.1 μmol/L)預(yù)處理0.5～1.0 h，然后以PA刺激細(xì)胞；第二組用ICA Ⅱ(終濃度0.1 μmol/L)預(yù)處理0.5～1.0 h，然后以PA刺激細(xì)胞；對照組則換為含等量二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)預(yù)處理0.5～1.0 h，然后加入等量BSA。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收獲細(xì)胞進行后續(xù)實驗。

1.4 Western blot

蛋白的提取和濃度測定均按照試劑盒說明書進行。配制10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))SDS-PAGE分離膠，制備步驟參照PAGE凝膠快速制備試劑盒說明書。電泳條件：80 V恒壓電泳30 min后，改為120 V恒壓分離60～90 min。電轉(zhuǎn)條件：300 mA恒流轉(zhuǎn)膜0.5～1.5 h。用TBST配置5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂牛奶，室溫封閉1 h。按1 ∶1 000～1 ∶3 000比例(參考抗體說明書)，使用TBST稀釋目的蛋白一抗工作液，4 ℃孵育過夜，TBST緩沖液洗3遍，配置對應(yīng)種屬的二抗工作液，放置搖床室溫1 h，TBST緩沖液洗3遍。經(jīng)增強化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence,ECL)后由Syngene G:BOX系列智能成像系統(tǒng)采集圖像。采用ImageJ軟件測定膠片電泳條帶灰度值，分析蛋白水平變化。

1.5 細(xì)胞增殖檢測

使用CCK-8試劑盒檢測MF和ICA Ⅱ?qū)CECs的增殖作用，參考試劑盒說明書進行實驗操作：將RCECs細(xì)胞懸液以每孔3×103/mL密度接種于96孔板(100 μL/孔)。根據(jù)組別設(shè)置，不同孔內(nèi)分別加入含不同濃度藥物的培養(yǎng)基，處理24 h。暗光條件下每個孔內(nèi)加入10 μL CCK-8原液，37 ℃條件下孵育1 h；使用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測量各孔光密度值(D450 nm值)，計算細(xì)胞存活率，細(xì)胞活力=[(實驗組D值-空白組D值)/(對照組D值-空白組D值)]×100%。

1.6 NO熒光探針檢測

按試劑盒說明書貼壁培養(yǎng)細(xì)胞，按照1 ∶1 000比例，用DAF-FM DA稀釋液稀釋DAF-FM DA原液制備工作液，終濃度為5 μmol/L。去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入適當(dāng)體積稀釋好的DAF-FM DA工作液以充分蓋住細(xì)胞為宜，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，用無菌磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌3次，以充分去除未進入細(xì)胞內(nèi)的DAF-FM DA。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。統(tǒng)計分析及作圖采用GraphPad Prism 8.0軟件，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組間兩兩比較采用Tukey’s多重檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MF和ICA Ⅱ?qū)?xì)胞內(nèi)NO含量的影響

與NC組相比，0.1 μmol/L的MF和0.1 μmol/L的ICA Ⅱ干預(yù)后能夠顯著增加細(xì)胞內(nèi)NO的含量(P<0.05)，且MF刺激NO生成的效果優(yōu)于ICA Ⅱ (P<0.05，圖2)。

2.2 PA刺激對eNOS和AKT蛋白表達(dá)的影響

使用PA刺激RCECs構(gòu)建體外內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙模型，與NC組相比，PA組的eNOS和AKT蛋白水平明顯降低，呈劑量依賴關(guān)系(P<0.05，圖3)，說明經(jīng)PA處理過的RCECs發(fā)生AKT/eNOS信號通路的下調(diào)，RCECs出現(xiàn)了一定程度的細(xì)胞功能障礙，提示利用PA成功構(gòu)建出內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙模型。

NC, normal control; MF, 4′-O-methylochnaflavone; ICA Ⅱ, icariside Ⅱ; NO, nitric oxide; a.u., arbitrary unit. *P<0.05; ***P<0.001.圖2 MF和ICA Ⅱ處理后細(xì)胞內(nèi)NO含量的變化Figure 2 The evaluation of intracellular NO following the treatment of MF and ICA Ⅱ

PA, palmitic acid; AKT, protein kinase B; eNOS, endothelial nitric oxide synthase. *P<0.05.圖3 PA處理后內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)eNOS和AKT蛋白的變化Figure 3 The protein level of eNOS and AKT following the treatment of PA

2.3 PA刺激下MF和ICA Ⅱ?qū)NOS和AKT蛋白表達(dá)的影響

利用PA誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，在PA刺激后給予MF(終濃度為0.1 μmol/L)治療能夠有效提高eNOS和AKT的蛋白表達(dá)水平(圖4)，提示MF可促進內(nèi)皮細(xì)胞損傷的恢復(fù)(P<0.05)；給予同等濃度的ICA Ⅱ未表現(xiàn)出顯著的治療效果(P>0.05)，可見MF的內(nèi)皮細(xì)胞保護作用優(yōu)于ICA Ⅱ。

NC, normal control; PA, palmitic acid; MF, 4′-O-methylochnaflavone; ICA Ⅱ, icariside Ⅱ; AKT, protein kinase B; eNOS, endothelial nitric oxide synthase. *P<0.05.圖4 MF和ICA Ⅱ治療后PA刺激下內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)eNOS和AKT蛋白的變化Figure 4 The protein level of eNOS and AKT in the PA-stimulated cells following the treatment of MF and ICA Ⅱ

2.4 MF、ICA Ⅱ?qū)A刺激的RCECs增殖的影響

CCK-8增殖實驗發(fā)現(xiàn)，MF和ICA Ⅱ濃度為0.1 μmol/L和1.0 μmol/L時沒有顯著的細(xì)胞毒性(P>0.05，圖5A)。PA會顯著降低RCECs的細(xì)胞增殖能力(P<0.05)，但使用0.1 μmol/L的MF和ICA Ⅱ治療后細(xì)胞增殖能力得到顯著恢復(fù)(P<0.05，圖5B)。

A, the RCECs were treated with different concentrations of MF and ICA Ⅱ for 24 h with cell viability measured via the CCK-8 assay; B, the RCECs were treated with 150 μmol/L PA in the presence or absence of MF and ICA Ⅱ for 24 h with cell viability measured via the CCK-8 assay. CCK, cell counting kit; NC, normal control; PA, palmitic acid; MF, 4′-O-methylochnaflavone; ICA Ⅱ, icariside Ⅱ; RCECs, rat cavernous endothelial cells; NS, no significant; μM, μmol/L; ***P<0.001.圖5 MF和ICA Ⅱ治療后PA刺激下RCECs增殖能力的變化Figure 5 The RCECs proliferation ability of the PA-stimulated cells following the treatment of MF and ICA Ⅱ

3 討論

作為血管內(nèi)膜的重要組成部分，血管中的內(nèi)皮組織由單層內(nèi)皮細(xì)胞組成，排列在流動的血液和血管平滑肌細(xì)胞之間的血管腔內(nèi)表面。內(nèi)皮細(xì)胞具有廣泛的重要功能，包括維持血管張力、血液流動性和通透性[3]。內(nèi)皮細(xì)胞還負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，對凝血級聯(lián)激活、血栓形成、纖維蛋白溶解和血管生成有一定影響[13-14]。

內(nèi)皮功能障礙是血管中內(nèi)皮來源的NO的產(chǎn)生或生物利用度發(fā)生了失衡，損害了血管擴張等正常生理過程。正常情況下，NO作用于陰莖海綿體的血管平滑肌細(xì)胞，使血管均處于舒張狀態(tài)。舒張的動脈平滑肌提高了海綿體的血流量，又促進內(nèi)皮細(xì)胞合成釋放NO，陰莖海綿體竇狀間隙因血流量快速增加而脹大，最終啟動勃起過程[4]。

目前認(rèn)為，AKT/eNOS/NO信號通路對血管中NO的調(diào)控起著主要作用[15]。采用不同治療手段激活該信號通路對恢復(fù)內(nèi)皮功能障礙有促進作用，例如他汀類藥物、輔酶Q10、n-3多不飽和脂肪酸等[16]。此外，很多中藥單體也表現(xiàn)出對內(nèi)皮功能障礙的改善作用，大部分為黃酮類藥物，包括姜黃素、槲皮素、熊果酸[17-18]。本研究檢測了雙黃酮類藥物MF對PA誘導(dǎo)的RCECs障礙后AKT/eNOS蛋白表達(dá)的影響，并與ICA Ⅱ進行比較。

內(nèi)皮功能障礙可由多種危險因素誘發(fā)，如飲食、藥物和衰老。高脂飲食會誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞中AKT/eNOS信號通路下調(diào)，進而導(dǎo)致ED。AKT/eNOS信號通路的下調(diào)與血漿游離脂肪酸和甘油三酯水平升高以及葡萄糖利用受損相關(guān)[19]。脂肪酸是具有長脂肪鏈的羧酸，其一端含有甲基，而另一端含有羧基。根據(jù)是否含有雙鍵，它們分為沒有雙鍵的飽和脂肪酸、只有一個雙鍵的單不飽和脂肪酸以及至少有兩個雙鍵的多不飽和脂肪酸[20]。PA是血液中含量最多的飽和游離脂肪酸，會在多種細(xì)胞類型中誘導(dǎo)細(xì)胞功能障礙和細(xì)胞死亡。PA的脂毒性作用主要體現(xiàn)在非脂肪組織的細(xì)胞暴露于高水平的飽和脂肪酸中時，會導(dǎo)致脂質(zhì)超載，這與肥胖和2型糖尿病的病理學(xué)相關(guān)[21]。導(dǎo)致ED的典型危險因素包括糖尿病、心血管疾病、衰老、肥胖，這些都與脂肪代謝異常相關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)PA會下調(diào)AKT/eNOS信號通路，且依賴于濃度梯度。Khan等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中PA過載會導(dǎo)致Ca2+依賴性自噬的發(fā)展，最終導(dǎo)致程序性細(xì)胞死亡。因此，PA對內(nèi)皮細(xì)胞造成的損傷會導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，而其中AKT/eNOS信號通路起到重要作用。

我國具有豐富的中草藥資源，提取純化的天然小分子藥物多達(dá)幾十萬，為人類提供了寶貴的財富。ICA Ⅱ是一種從傳統(tǒng)中草藥淫羊藿中提取的活性黃酮類化合物，具有多種生物學(xué)和藥理學(xué)特性，包括抗癌、抗氧化、抗骨質(zhì)疏松、抗炎、抗衰老等[22]。近些年的研究發(fā)現(xiàn)，ICA Ⅱ在修復(fù)內(nèi)皮損傷中具有重要作用，為其在ED、心血管疾病等治療領(lǐng)域的應(yīng)用提供了機會。ICA Ⅱ在RCECs中能通過AKT/eNOS信號通路恢復(fù)高糖誘導(dǎo)和神經(jīng)損傷的人海綿狀血管內(nèi)皮功能障礙[12,23]。但是，許多黃酮類藥物(包括ICA Ⅱ)的天然結(jié)構(gòu)決定了其可溶性差、生物利用度低，臨床轉(zhuǎn)化前景困難重重，因此，尋找效價更好的小分子藥物勢在必行。

雙黃酮類化合物具有許多不同的單體結(jié)構(gòu)和連接方式，具有廣泛的開發(fā)前景，而且當(dāng)前關(guān)于雙黃酮類藥物在ED中的研究尚屬罕見。MF是一種從金銀花中分離得到的雙黃酮類化合物，可抑制小鼠淋巴細(xì)胞增殖[24]。此外，雙黃酮還可能用于開發(fā)針對新型冠狀病毒木瓜樣蛋白酶的抗病毒藥物[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，MF能夠通過AKT/eNOS信號通路恢復(fù)PA刺激導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，且所需劑量比ICA Ⅱ少，顯示出較高的治療效價，此外，MF還能增加NO的產(chǎn)量，促進RCECs的增殖能力，顯示了其對內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)功能的修復(fù)作用。未來還可進一步明確MF在內(nèi)皮細(xì)胞中的作用位點，并明確其中參與的其他細(xì)胞內(nèi)信號通路的傳導(dǎo)機制。

綜上所述，AKT/eNOS信號通路的變化可能是PA造成RCECs內(nèi)皮功能障礙的損傷機制，而MF能夠有效逆轉(zhuǎn)上述變化；與ICA Ⅱ相比，MF可更有效地產(chǎn)生NO。由于本研究僅在細(xì)胞水平研究了MF的作用機制，具有一定局限性，未來需要進一步探索雙黃酮類藥物MF在治療ED相關(guān)內(nèi)皮功能障礙中的作用，包括使用ED動物模型，以期闡明其分子機制，為改善ED治療現(xiàn)狀和開發(fā)臨床上有效的治療手段提供全新思路。