李倚天，梅芊，劉英（河南省食品藥品檢驗所，鄭州 450018）

基因毒性雜質(zhì)是指能引起DNA 突變、染色體斷裂或者DNA 重組的物質(zhì)，可導致腫瘤的發(fā)生[1-2]?；蚨拘噪s質(zhì)主要來源于原料合成過程中的起始物料、中間體、試劑及反應副產(chǎn)物，也可在藥物貯存中降解產(chǎn)生[3]。近年來，隨著各國基因毒性雜質(zhì)法規(guī)的逐步健全和監(jiān)管要求的日益提高，基因毒性雜質(zhì)的研究已成為藥物質(zhì)量研究與控制的熱點與難點。

利奈唑胺是第一個由人工合成并應用于臨床的新型噁唑烷酮類抗菌藥，2000年在美國獲批上市，2007年進入中國市場[4]。自2000年美國 FDA批準該藥物上市以來，利奈唑胺被廣泛用于治療革蘭氏陽性球菌引起的感染，包括由耐甲氧西林金黃色葡萄球菌引起的疑似或確診院內(nèi)獲得性肺炎、社區(qū)獲得性肺炎、復雜性皮膚或皮膚軟組織感染以及耐萬古霉素腸球菌感染等[5]。其合成以（S）-N-[2-（乙酰氧基-3-氯丙基）]乙酰胺（ACPA）為起始物料，過程中用到了S-環(huán)氧氯丙烷（ECH）和S-1-氨基-3-氯-2-丙醇鹽酸鹽（結構見圖1）[6]。依照歐盟基因毒性雜質(zhì)指導原則及相關文獻，這三者的結構式中均含有基因毒性警示結構[7]，其中 ECH 與ACPA 根據(jù)文獻報道已采用GC-MS 法進行測定和控制，而S-1-氨基-3-氯-2-丙醇鹽酸鹽暫無方法對其進行控制，因此需要建立合適的方法對其進行測定?？紤]到利奈唑胺治療期為1 ～12 個月，根據(jù)人用藥品注冊技術要求國際協(xié)調(diào)會（International Conference on Harmonization，ICH）M7 指南規(guī)定，關于遺傳毒性雜質(zhì)基于毒性學關注閾值（threshold of toxicological concern，TTC）的治療期為1 ～12個月的藥品的可接受攝入量為每日 60 μg[8]，S-1-氨基-3-氯-2-丙醇鹽酸鹽的限度為15 μg·g-1，限度較低，對測定方法的專屬性及靈敏度要求較高，采用常規(guī)的液相色譜紫外檢測器檢測難以實現(xiàn)，因此有必要建立一種準確及靈敏度高的分析方法對其進行控制。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術具有靈敏度高、分析速度快、結果準確等特點，能夠滿足痕量基因毒性雜質(zhì)的檢測要求[9-10]。本文建立了液相色譜-四極桿-離子肼高分辨質(zhì)譜法分析利奈唑胺中S-1-氨基-3-氯-2-丙醇鹽酸鹽的含量，為其質(zhì)量控制提供參考。

圖1 S-1-氨基-3-氯-2-丙醇鹽酸鹽化學結構Fig 1 Chemical structure of S-1-amino-3-chloro-2-propanol hydrochloride

1 材料

1.1 儀器

賽默飛Q Exactive Plus 超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國賽默飛世爾科技公司），XPE205電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]。

1.2 試藥

甲醇、乙腈為色譜純（MERCK 公司），甲酸（Sigma-Aldrich， 批號：SHBL0331）， 水為MillQ 去離子水。S-1-氨基-3-氯-2-丙醇鹽酸鹽（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，純度：98.0%，批號：F2002149）；利奈唑胺原料（批號：27150501、27150601、27150602、27150603，浙江新塞科藥業(yè)有限公司；批號：4039190801、4039190802、4039190803、4039191001，河南華潤雙鶴藥業(yè)股份有限公司）。

2 方法與結果

2.1 測定條件

色譜條件：采用ACE EXCEL C18-AR（2.1 mm×100 mm，5 μm）色譜柱，流動相為0.2%甲酸水溶液-乙腈（70∶30），流速0.3 mL·min-1，柱溫30℃，進樣量1 μL，0～5.0 min 進質(zhì)譜檢測。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源（ESI 源），正離子模式檢測，噴霧電壓3.5 kV，離子傳輸管溫度350℃，輔助氣溫度350 ℃，輔助氣流量10 mL·min-1，鞘氣流量40 mL·min-1，碰撞能量（NCE）50 eV，掃描范圍為m/z50 ～235，掃描方式為SIM 掃描母離子，目標離子精確質(zhì)量數(shù)：110.036 41，質(zhì)譜圖見圖2。

圖2 S-1-氨基-3-氯-2-丙醇質(zhì)譜圖Fig 2 Mass spectrogram of S-1-amino-3-chloro-2-propanol

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液 精密稱取利奈唑胺原料50 mg，置50 mL 量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，濾過，取續(xù)濾液進樣。

2.2.2 對照品溶液儲備液 精密稱取S-1-氨基-3-氯-2-丙醇鹽酸鹽對照品約15 mg，置100 mL 量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，精密量取1 mL 置200 mL 量瓶中，用水稀釋制成每1 mL 中約含0.75 μg 對照品的溶液。

2.3 專屬性

按照“2.1”項下條件進樣，空白溶劑不干擾S-1-氨基-3-氯-2-丙醇鹽酸鹽的測定，方法的專屬性較好，色譜圖見圖3。

圖3 空白溶劑質(zhì)譜圖Fig 3 Ion chromatograms of the blank solution

2.4 線性關系、檢測限與定量限

精密量取“2.2.2”項下對照品溶液儲備液適量，用水分別稀釋制成3、12、15、18、22、30 ng·mL-1的S-1-氨基-3-氯-2-丙醇鹽酸鹽對照品溶液，進樣測定，記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度（X，ng·mL）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得線性方程：Y＝1.601×105X+1.634×105（r＝0.9997）。

S-1-氨基-3-氯-2-丙醇鹽酸鹽在3.013 ～30.125 ng·mL-1與峰面積線性關系良好。將對照品溶液逐級稀釋，在信噪比（S/N）約為10.0時測得定量限為7.53×10-5ng，在S/N約為3.0時測得檢測限為7.53×10-6ng。

2.5 進樣精密度與重復性試驗

取“2.4”項下15 ng·mL-1的對照品溶液連續(xù)進樣6 次，測得S-1-氨基-3-氯-2-丙醇鹽酸鹽峰面積的RSD為0.50%（n＝6），表明儀器精密度良好。

精密稱取利奈唑胺原料（批號：27150501）約50 mg 共6 份，分別按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，按”2.1”項下條件進行測定，記錄色譜圖。結果樣品中均未檢出S-1-氨基-3-氯-2-丙醇鹽酸鹽，表明方法重復性良好。

2.6 加樣回收試驗

分別精密稱定已知含量（S-1-氨基-3-氯-2-丙醇鹽酸鹽未檢出）的利奈唑胺原料（批號：27150501）9 份，再分別精密稱取S-1-氨基-3-氯-2-丙醇鹽酸鹽對照品適量，用供試品溶液溶解，分別制成低、中、高濃度（80%、100%、120%水平）的溶液分別進樣（各3 份），并作S-1-氨基-3-氯-2-丙醇鹽酸鹽隨行標準曲線，按“2.1”項下條件進行測定，計算回收率，結果S-1-氨基-3-氯-2-丙醇鹽酸鹽的低、中、高濃度的平均回收率分別為95.8%、94.1%、95.8%，RSD分別為1.8%、1.0%、1.5%。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取利奈唑胺原料（批號：27150501）約50 mg置50 mL 量瓶中，用“2.4”項下15 ng·mL-1的對照品溶液稀釋至刻度，于0、1、2、4、6、8 h進樣測定并記錄色譜圖，以S-1-氨基-3-氯-2-丙醇鹽酸鹽峰面積為指標考察溶液穩(wěn)定性。結果原料及制劑加標供試品溶液中S-1-氨基-3-氯-2-丙醇鹽酸鹽峰面積的RSD分別為1.9%，表明供試品溶液在8 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 樣品測定

按“2.2”項下方法制備對照品溶液及供試品溶液，照“2.1”項下色譜條件進樣測定，并作隨行標準曲線，采用回歸方程計算其含量，結果8批次原料均未檢出S-1-氨基-3-氯-2-丙醇鹽酸鹽雜質(zhì)（見圖4）。

圖4 S-1-氨基-3-氯-2-丙醇鹽酸鹽離子色譜圖Fig 4 Ion chromatogram of S-1-amino-3-chloro-2-propanol hydrochloride

3 討論

3.1 流動相的選擇

筆者曾用乙腈作為流動相，峰的響應較甲醇作為流動相時更高，分析原因為乙腈的離子化效果更好，樣品更容易離子化。進一步比較了不同濃度如0.1%、0.15%、0.2%、0.25%甲酸水溶液作為流動相的峰響應情況，結果甲酸濃度越低，S-1-氨基-3-氯-2-丙醇鹽酸鹽峰響應越大，基線噪音越小，但綜合考慮保留時間的影響，選擇0.2%甲酸水溶液為流動相。

3.2 流動相比例的確定

分別比較了0.2%甲酸水溶液與乙腈在不同色譜條件下S-1-氨基-3-氯-2-丙醇鹽酸鹽峰與利奈唑胺峰的出峰情況，兩者比例越接近（50∶50），S-1-氨基-3-氯-2-丙醇鹽酸鹽峰與利奈唑胺峰保留時間越近，考慮到利奈唑胺濃度過大，進入質(zhì)譜檢測器后過載，有可能造成檢測器污染，因此，將比例設定0.2%甲酸水溶液-乙腈（70∶30），S-1-氨基-3-氯-2-丙醇鹽酸鹽峰雜質(zhì)峰保留時間約為3.4 min，而主成分利奈唑胺峰約為9 min，質(zhì)譜采集時間設定為0 ～5 min，利奈唑胺經(jīng)液相洗脫后直接從廢液管排出，以避免污染質(zhì)譜。

3.3 檢測模式的選擇

比較了3 種不同檢測模式，即全掃描模式（Fullscan）、單離子檢測掃描（SIM）以及多反應監(jiān)測掃描（MRM）模式，其中MRM 模式基線噪音最小，干擾最少，SIM 的檢測限及定量限最低，最終從檢測能力方面考慮采用SIM 作為本次檢測方法的掃描模式。