李倚天，梅芊，劉英（河南省食品藥品檢驗(yàn)所，鄭州 450018）

基因毒性雜質(zhì)是指能引起DNA 突變、染色體斷裂或者DNA 重組的物質(zhì)，可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[1-2]?；蚨拘噪s質(zhì)主要來(lái)源于原料合成過(guò)程中的起始物料、中間體、試劑及反應(yīng)副產(chǎn)物，也可在藥物貯存中降解產(chǎn)生[3]。近年來(lái)，隨著各國(guó)基因毒性雜質(zhì)法規(guī)的逐步健全和監(jiān)管要求的日益提高，基因毒性雜質(zhì)的研究已成為藥物質(zhì)量研究與控制的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。

利奈唑胺是第一個(gè)由人工合成并應(yīng)用于臨床的新型噁唑烷酮類抗菌藥，2000年在美國(guó)獲批上市，2007年進(jìn)入中國(guó)市場(chǎng)[4]。自2000年美國(guó) FDA批準(zhǔn)該藥物上市以來(lái)，利奈唑胺被廣泛用于治療革蘭氏陽(yáng)性球菌引起的感染，包括由耐甲氧西林金黃色葡萄球菌引起的疑似或確診院內(nèi)獲得性肺炎、社區(qū)獲得性肺炎、復(fù)雜性皮膚或皮膚軟組織感染以及耐萬(wàn)古霉素腸球菌感染等[5]。其合成以（S）-N-[2-（乙酰氧基-3-氯丙基）]乙酰胺（ACPA）為起始物料，過(guò)程中用到了S-環(huán)氧氯丙烷（ECH）和S-1-氨基-3-氯-2-丙醇鹽酸鹽（結(jié)構(gòu)見圖1）[6]。依照歐盟基因毒性雜質(zhì)指導(dǎo)原則及相關(guān)文獻(xiàn)，這三者的結(jié)構(gòu)式中均含有基因毒性警示結(jié)構(gòu)[7]，其中 ECH 與ACPA 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道已采用GC-MS 法進(jìn)行測(cè)定和控制，而S-1-氨基-3-氯-2-丙醇鹽酸鹽暫無(wú)方法對(duì)其進(jìn)行控制，因此需要建立合適的方法對(duì)其進(jìn)行測(cè)定?？紤]到利奈唑胺治療期為1 ～12 個(gè)月，根據(jù)人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)（International Conference on Harmonization，ICH）M7 指南規(guī)定，關(guān)于遺傳毒性雜質(zhì)基于毒性學(xué)關(guān)注閾值（threshold of toxicological concern，TTC）的治療期為1 ～12個(gè)月的藥品的可接受攝入量為每日 60 μg[8]，S-1-氨基-3-氯-2-丙醇鹽酸鹽的限度為15 μg·g-1，限度較低，對(duì)測(cè)定方法的專屬性及靈敏度要求較高，采用常規(guī)的液相色譜紫外檢測(cè)器檢測(cè)難以實(shí)現(xiàn)，因此有必要建立一種準(zhǔn)確及靈敏度高的分析方法對(duì)其進(jìn)行控制。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)具有靈敏度高、分析速度快、結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn)，能夠滿足痕量基因毒性雜質(zhì)的檢測(cè)要求[9-10]。本文建立了液相色譜-四極桿-離子肼高分辨質(zhì)譜法分析利奈唑胺中S-1-氨基-3-氯-2-丙醇鹽酸鹽的含量，為其質(zhì)量控制提供參考。

圖1 S-1-氨基-3-氯-2-丙醇鹽酸鹽化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig 1 Chemical structure of S-1-amino-3-chloro-2-propanol hydrochloride

1 材料

1.1 儀器

賽默飛Q Exactive Plus 超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)賽默飛世爾科技公司），XPE205電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]。

1.2 試藥

甲醇、乙腈為色譜純（MERCK 公司），甲酸（Sigma-Aldrich， 批號(hào)：SHBL0331）， 水為MillQ 去離子水。S-1-氨基-3-氯-2-丙醇鹽酸鹽（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，純度：98.0%，批號(hào)：F2002149）；利奈唑胺原料（批號(hào)：27150501、27150601、27150602、27150603，浙江新塞科藥業(yè)有限公司；批號(hào)：4039190801、4039190802、4039190803、4039191001，河南華潤(rùn)雙鶴藥業(yè)股份有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 測(cè)定條件

色譜條件：采用ACE EXCEL C18-AR（2.1 mm×100 mm，5 μm）色譜柱，流動(dòng)相為0.2%甲酸水溶液-乙腈（70∶30），流速0.3 mL·min-1，柱溫30℃，進(jìn)樣量1 μL，0～5.0 min 進(jìn)質(zhì)譜檢測(cè)。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源（ESI 源），正離子模式檢測(cè)，噴霧電壓3.5 kV，離子傳輸管溫度350℃，輔助氣溫度350 ℃，輔助氣流量10 mL·min-1，鞘氣流量40 mL·min-1，碰撞能量（NCE）50 eV，掃描范圍為m/z50 ～235，掃描方式為SIM 掃描母離子，目標(biāo)離子精確質(zhì)量數(shù)：110.036 41，質(zhì)譜圖見圖2。

圖2 S-1-氨基-3-氯-2-丙醇質(zhì)譜圖Fig 2 Mass spectrogram of S-1-amino-3-chloro-2-propanol

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液 精密稱取利奈唑胺原料50 mg，置50 mL 量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，濾過(guò)，取續(xù)濾液進(jìn)樣。

2.2.2 對(duì)照品溶液儲(chǔ)備液 精密稱取S-1-氨基-3-氯-2-丙醇鹽酸鹽對(duì)照品約15 mg，置100 mL 量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，精密量取1 mL 置200 mL 量瓶中，用水稀釋制成每1 mL 中約含0.75 μg 對(duì)照品的溶液。

2.3 專屬性

按照“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣，空白溶劑不干擾S-1-氨基-3-氯-2-丙醇鹽酸鹽的測(cè)定，方法的專屬性較好，色譜圖見圖3。

圖3 空白溶劑質(zhì)譜圖Fig 3 Ion chromatograms of the blank solution

2.4 線性關(guān)系、檢測(cè)限與定量限

精密量取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液儲(chǔ)備液適量，用水分別稀釋制成3、12、15、18、22、30 ng·mL-1的S-1-氨基-3-氯-2-丙醇鹽酸鹽對(duì)照品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度（X，ng·mL）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得線性方程：Y＝1.601×105X+1.634×105（r＝0.9997）。

S-1-氨基-3-氯-2-丙醇鹽酸鹽在3.013 ～30.125 ng·mL-1與峰面積線性關(guān)系良好。將對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋，在信噪比（S/N）約為10.0時(shí)測(cè)得定量限為7.53×10-5ng，在S/N約為3.0時(shí)測(cè)得檢測(cè)限為7.53×10-6ng。

2.5 進(jìn)樣精密度與重復(fù)性試驗(yàn)

取“2.4”項(xiàng)下15 ng·mL-1的對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)得S-1-氨基-3-氯-2-丙醇鹽酸鹽峰面積的RSD為0.50%（n＝6），表明儀器精密度良好。

精密稱取利奈唑胺原料（批號(hào)：27150501）約50 mg 共6 份，分別按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按”2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果樣品中均未檢出S-1-氨基-3-氯-2-丙醇鹽酸鹽，表明方法重復(fù)性良好。

2.6 加樣回收試驗(yàn)

分別精密稱定已知含量（S-1-氨基-3-氯-2-丙醇鹽酸鹽未檢出）的利奈唑胺原料（批號(hào)：27150501）9 份，再分別精密稱取S-1-氨基-3-氯-2-丙醇鹽酸鹽對(duì)照品適量，用供試品溶液溶解，分別制成低、中、高濃度（80%、100%、120%水平）的溶液分別進(jìn)樣（各3 份），并作S-1-氨基-3-氯-2-丙醇鹽酸鹽隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果S-1-氨基-3-氯-2-丙醇鹽酸鹽的低、中、高濃度的平均回收率分別為95.8%、94.1%、95.8%，RSD分別為1.8%、1.0%、1.5%。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取利奈唑胺原料（批號(hào)：27150501）約50 mg置50 mL 量瓶中，用“2.4”項(xiàng)下15 ng·mL-1的對(duì)照品溶液稀釋至刻度，于0、1、2、4、6、8 h進(jìn)樣測(cè)定并記錄色譜圖，以S-1-氨基-3-氯-2-丙醇鹽酸鹽峰面積為指標(biāo)考察溶液穩(wěn)定性。結(jié)果原料及制劑加標(biāo)供試品溶液中S-1-氨基-3-氯-2-丙醇鹽酸鹽峰面積的RSD分別為1.9%，表明供試品溶液在8 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 樣品測(cè)定

按“2.2”項(xiàng)下方法制備對(duì)照品溶液及供試品溶液，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，并作隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用回歸方程計(jì)算其含量，結(jié)果8批次原料均未檢出S-1-氨基-3-氯-2-丙醇鹽酸鹽雜質(zhì)（見圖4）。

圖4 S-1-氨基-3-氯-2-丙醇鹽酸鹽離子色譜圖Fig 4 Ion chromatogram of S-1-amino-3-chloro-2-propanol hydrochloride

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

筆者曾用乙腈作為流動(dòng)相，峰的響應(yīng)較甲醇作為流動(dòng)相時(shí)更高，分析原因?yàn)橐译娴碾x子化效果更好，樣品更容易離子化。進(jìn)一步比較了不同濃度如0.1%、0.15%、0.2%、0.25%甲酸水溶液作為流動(dòng)相的峰響應(yīng)情況，結(jié)果甲酸濃度越低，S-1-氨基-3-氯-2-丙醇鹽酸鹽峰響應(yīng)越大，基線噪音越小，但綜合考慮保留時(shí)間的影響，選擇0.2%甲酸水溶液為流動(dòng)相。

3.2 流動(dòng)相比例的確定

分別比較了0.2%甲酸水溶液與乙腈在不同色譜條件下S-1-氨基-3-氯-2-丙醇鹽酸鹽峰與利奈唑胺峰的出峰情況，兩者比例越接近（50∶50），S-1-氨基-3-氯-2-丙醇鹽酸鹽峰與利奈唑胺峰保留時(shí)間越近，考慮到利奈唑胺濃度過(guò)大，進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)器后過(guò)載，有可能造成檢測(cè)器污染，因此，將比例設(shè)定0.2%甲酸水溶液-乙腈（70∶30），S-1-氨基-3-氯-2-丙醇鹽酸鹽峰雜質(zhì)峰保留時(shí)間約為3.4 min，而主成分利奈唑胺峰約為9 min，質(zhì)譜采集時(shí)間設(shè)定為0 ～5 min，利奈唑胺經(jīng)液相洗脫后直接從廢液管排出，以避免污染質(zhì)譜。

3.3 檢測(cè)模式的選擇

比較了3 種不同檢測(cè)模式，即全掃描模式（Fullscan）、單離子檢測(cè)掃描（SIM）以及多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描（MRM）模式，其中MRM 模式基線噪音最小，干擾最少，SIM 的檢測(cè)限及定量限最低，最終從檢測(cè)能力方面考慮采用SIM 作為本次檢測(cè)方法的掃描模式。