王真，吳方暉，陰憶烽，張毅，劉艷麗，宋云揚(yáng)（國民核生化災(zāi)害防護(hù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102205）

瘙癢是一種可以引起抓撓反應(yīng)的主觀感覺，大多數(shù)的皮膚病以及系統(tǒng)性疾病都伴有瘙癢癥狀，長期的慢性瘙癢嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量。目前，由于瘙癢的發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚不完全清楚，也因此缺乏較為有效完善的治療方法。隨著組胺依賴性和非組胺依賴性癢覺信號(hào)通路的發(fā)現(xiàn)，表明多種信號(hào)通路參與了癢覺信號(hào)的傳導(dǎo)[1]。常見的瘙癢介質(zhì)有生物胺類、神經(jīng)肽類、類花生酸類、蛋白酶類及細(xì)胞因子類等多種，我們研究的黧豆蛋白酶屬于蛋白酶類致癢介質(zhì)，它是通過非組胺依賴性的癢覺信號(hào)通路傳導(dǎo)瘙癢的。

黧豆（Cowhage）是豆科黧豆屬植物，多生在熱帶、亞熱帶地區(qū)，黧豆豆莢毛刺可以導(dǎo)致瘙癢。黧豆毛刺在刺入靈長類或嚙齒類動(dòng)物皮膚不久后可以產(chǎn)生持續(xù)幾分鐘的癢感[2]。早期的生化研究表明，黧豆毛刺中含有一種可以引發(fā)瘙癢的蛋白酶，稱之為mucunain[3]。研究人員發(fā)現(xiàn)，mucunain 是通過一群對(duì)辣椒素敏感的傳入神經(jīng)纖維引發(fā)瘙癢的，它可以激活所有的機(jī)械熱敏感的C 纖維，這與介導(dǎo)組胺誘發(fā)瘙癢的機(jī)械刺激不敏感的C 纖維不同，mucunain 誘導(dǎo)的瘙癢不能被抗組胺藥所阻斷[4-5]。Reddy 等[6]從黧豆豆莢毛刺中分離出天然黧豆蛋白酶并進(jìn)行了重組表達(dá)，鑒定了mucunain 是一種半胱氨酸蛋白酶，并發(fā)現(xiàn)mucunain 是蛋白酶激活受體2 和4（proteinase activated receptor 2/4，PAR2/4）的配體，而且對(duì)PAR4 的活性大于對(duì)PAR2 的活性。在之后的研究中，人們發(fā)現(xiàn)與組胺引發(fā)的瘙癢相比，mucunain誘導(dǎo)的瘙癢感覺更為強(qiáng)烈，其瘙癢反應(yīng)與慢性瘙癢更為類似，因此，mucunain 致癢可作為研究特應(yīng)性皮炎（atopic dermatitis，AD）等慢性瘙癢疾病的理想模型[7]。

在止癢藥物研究方面，抗組胺藥物并不能有效解決臨床瘙癢問題，而mucunain 作為一種非組胺機(jī)制的致癢物，常作為與組胺進(jìn)行瘙癢方面比較性研究的典型致癢劑。到目前為止，僅有一篇文獻(xiàn)報(bào)道了mucunain 的重組表達(dá)[6]。鑒于從黧豆毛刺中大量獲取mucunain 比較困難，本研究主要開展黧豆蛋白酶的基因克隆表達(dá)與純化，采用FLIPR 檢測(cè)技術(shù)對(duì)重組黧豆蛋白酶的生物活性進(jìn)行研究，以期可以高效地獲得大量黧豆蛋白酶，為相關(guān)止癢劑的研究提供模型物質(zhì)。

1 材料

1.1 試藥

pET-28a（+）-Sumo 載體（美國Novagen 公司）；DH5α感受態(tài)細(xì)胞、Rosetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞（北京天根生化科技有限公司）。

DNA 連接酶，限制性內(nèi)切酶XhoⅠ，限制性內(nèi)切酶KpnⅠ，1 kb DNA Ladder，Prestained protein MW marker 26616（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；卡那抗菌藥物（美國Amersco 公司）；E-64（德國Sigma 公司）；Ni-NTA 親和層析柱（美國Cytiva 公司）。

1.2 儀器

MillQ-10A 超純水凈化系統(tǒng)（美國Millipore公司）；CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；離心機(jī)（德國Sigma 公司，德國Eppendorf 公司）；FLIPR Penta 高通量實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)分析系統(tǒng)（德國Molecular Devices 公司）。

2 方法

2.1 黧豆蛋白酶的重組構(gòu)建

黧豆蛋白酶全長基因（NCBI：ACB87490.1）編碼整個(gè)前體蛋白（前體肽和成熟肽），可分為I29 抑制肽、C1 半胱氨酸蛋白肽和顆粒蛋白3 個(gè)部分（見圖1）[8]。

圖1 黧豆蛋白酶的組成Fig 1 Composition of mucunain

根據(jù)結(jié)構(gòu)活性預(yù)測(cè)結(jié)果，推測(cè)其活性區(qū)域位于氨基酸序列的93 ～309 位，對(duì)其進(jìn)行大腸埃希菌密碼子優(yōu)化，全基因合成獲得質(zhì)粒M-pUC57（南京金斯瑞生物科技有限公司合成）。將M-pUC57 用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切后，與用同樣酶酶切后的線性化表達(dá)載體pET-28a（+）-Sumo 在T4 DNA 連接酶作用下于25 ℃連接2 h，載體構(gòu)建如圖2所示。采用CaCl2法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將Escherichia coliDH5α（DE3）感受態(tài)細(xì)胞置于冰上孵育30 min，細(xì)胞在42℃水浴90 s，冰上孵育2 ～3 min。加入900 μL 2×YT 培養(yǎng)基于37℃振蕩培養(yǎng)箱中孵育40 ～50 min，最后涂布在含有50 μg·mL-1卡那抗菌藥物的2×YT 瓊脂平板上，在37 ℃孵育16 h 后，挑取單菌落進(jìn)行質(zhì)粒提取，并通過限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、XhoⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定和DNA 測(cè)序鑒定。

圖2 M-pET-28a（+）-Sumo 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建Fig 2 Construction of M-pET-28a（+）-Sumo expression plasmid

2.2 黧豆蛋白酶的表達(dá)

將重組質(zhì)粒M-pET-28a（+）-Sumo 轉(zhuǎn)入大腸埃希菌Rosetta（DE3）菌株中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。挑取單個(gè)菌落，在含卡那抗菌藥物（50 μg·mL-1）的10 mL 2×YT 培養(yǎng)基中于37 ℃、220 r·min-1條件下培養(yǎng)12 ～16 h。以1∶100 的比例接種于新鮮培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r·min-1條件下培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6 ～0.8， 用0.05 mmol·L-1異丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）在18℃誘導(dǎo)48 h。4℃、4500 r·min-1離心15 min，收集細(xì)胞，將其重懸于100 mL 冰冷的裂解緩沖液（20 mmol·L-1PBS，pH 7.4）中，采用低溫超高壓細(xì)胞破碎儀進(jìn)行裂解。將裂解液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，對(duì)其進(jìn)行表達(dá)形式分析。

2.3 黧豆蛋白酶的純化

在室溫下，將包涵體用洗滌液（2 mol·L-1尿素、20 mmol·L-1Tris、5 mmol·L-1咪唑和500 mmol·L-1氯化鈉） 洗滌兩次，9000 r·min-1離心10 min，之后溶解在增溶緩沖液（pH 7.4，8 mol·L-1尿 素、280 mmol·L-1β-巰基乙醇、20 mmol·L-1Tris、5 mmol·L-1咪唑和500 mmol·L-1氯化鈉）中室溫放置1 h，10 000 r·min-1離心15 min，回收溶解有目的蛋白His6-Sumo-M 的上清液。將融合蛋白His6-Sumo-M 進(jìn)行純化和重折疊復(fù)性。融合蛋白用超濾管濃縮后用SUMO 蛋白酶酶切，SUMO 蛋白酶與His6-Sumo-M 以100∶1 的比例加入到Sumo Protease Buffer（50 mmol·L-1Tris-HCl，1 mmol·L-1DTT，pH 8.0）中4 ℃過夜。然后采用鎳柱親和層析法（Ni-NTA 親和層析柱）進(jìn)行純化得到變性蛋白。將純化的蛋白進(jìn)行透析重折疊恢復(fù)其活性。重折疊過程分以下三步進(jìn)行，第一步透析是用由1.5 mol·L-1尿素、50 mmol·L-1咪唑、300 mmol·L-1氯化鈉、200 mmol·L-1蔗糖、1 mmol·L-1還原型谷胱甘肽（GSH）、0.2 mmol·L-1氧化型谷胱甘肽（GSSG）和0.1%Triton X-100 組成的溶液（pH 7.4）進(jìn)行的；使用由0.5 mol·L-1尿素、25 mmol·L-1咪唑、300 mmol·L-1氯化鈉、200 mmol·L-1蔗糖、1 mmol·L-1谷胱甘肽、0.2 mmol·L-1GSSG 和0.1%Triton X-100 組成的溶液（pH 7.4）進(jìn)行第二步透析；用100 mmol·L-1Tris、2 mmol·L-1咪唑、300 mmol·L-1氯化鈉和200 mmol·L-1蔗糖組成的溶液（pH 7.4）進(jìn)行最后一步透析。所有透析步驟均使用攪拌器在4 ℃冰箱內(nèi)攪拌6 h，最后用0.45 μm 濾膜過濾除去沉淀物[9]。將蛋白溶液進(jìn)行超濾濃縮，冷凍干燥，-20℃保存。

2.4 黧豆蛋白酶的分子量鑒定

經(jīng)過蛋白表達(dá)純化以及復(fù)性得到了重組蛋白，采用15% SDS-PAGE 確定其分子量大小是否與預(yù)期一致，并采用Edman 降解法對(duì)表達(dá)的重組黧豆蛋白酶進(jìn)行N-端氨基酸序列分析，將重組蛋白溶解于500 μL 含蛋白酶抑制劑的8 mol·L-1尿素溶液中，用胰蛋白酶按酶∶底物＝1∶50 的比例對(duì)蛋白進(jìn)行酶切。將酶切后的多肽溶于溶劑A（0.1%甲酸水），10 000 g 離心5 min。取上清液采用Q Exactive 型液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀檢測(cè)，以含0.1%甲酸的水（溶劑A）和含0.1%甲酸的乙腈（溶劑B）為流動(dòng)相，梯度洗脫（0 ～8 min，6% ～10%B；8 ～60 min，10% ～30%B；60 ～79 min，30% ～42%B；79 ～80 min，42% ～95%B；80 ～85 min，95%B；85 ～86 min，95% ～6%B；86 ～90 min，6%B）， 流速為0.6 L·min-1，總采集時(shí)間為90 min。噴霧電壓為2.1 kV，毛細(xì)管溫度為320℃；碰撞能量為27 eV，采集一級(jí)質(zhì)量范圍為300 ～1400m/z，二級(jí)掃描范圍為200 ～2000m/z。使用MaxQuant 對(duì)液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀（LC/MS）原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2.5 黧豆蛋白酶生物活性分析

采用FLIPR 檢測(cè)Hela 細(xì)胞中胞質(zhì)Ca2+的變化，分析重組黧豆蛋白酶的生物活性。使用RPMI-1640 完全培養(yǎng)基，以（1 ～2）×105個(gè)·mL-1的密度將Hela 細(xì)胞接種于96 孔板內(nèi)。培養(yǎng)24 h 后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入80 μL Hank’s 緩沖液配制的calcium 6 染料（10×calcium 6 染 料 用 含20 mmol·L-1HEPES 的Hank’s 緩沖液以1∶10 稀釋，pH 7.4），37℃避光孵育。2 h 后，分別加入20 μL 重組黧豆蛋白酶（10 μmol·L-1）及重組黧豆蛋白酶（10 μmol·L-1）與E-64（20 μmol·L-1，半胱氨酸蛋白酶抑制劑）的混合物至孔中。采用FLIPR 檢測(cè)胞質(zhì)Ca2+的變化，應(yīng)用Max Pro 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和可視化。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)進(jìn)行三次，采用GraphPad Prism 8.0.1 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3 結(jié)果

3.1 黧豆蛋白酶的重組構(gòu)建與表達(dá)

將KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切后的pET-28a（+）-Sumo 載體和膠回收純化的黧豆蛋白酶基因片段連接，轉(zhuǎn)化Escherichia coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，經(jīng)KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切后鑒定得到約650 bp 大小的特異條帶（見圖3）。DNA 測(cè)序結(jié)果表明，與優(yōu)化后的核苷酸序列一致。

圖3 重組質(zhì)粒M-pET-28a（+）-Sumo 的酶切鑒定Fig 3 Identify of recombinant plasmid M-pET-28a（+）-Sumo digested by restriction enzyme

實(shí)驗(yàn)采用了多種感受態(tài)細(xì)胞、不同的溫度、不同的時(shí)間以及不同的IPTG 濃度進(jìn)行誘導(dǎo)條件優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)重組黧豆蛋白酶都能進(jìn)行表達(dá)，但始終以包涵體的形式存在（結(jié)果未列出）。采用Rosetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，在18℃時(shí)用0.05 mmol·L-1IPTG 誘導(dǎo)48 h，用20 mmol·L-1PBS 裂解細(xì)菌后蛋白獲得量最高，并確定其為最終的表達(dá)和裂解條件，結(jié)果如圖4所示。

圖4 重組黧豆蛋白酶的表達(dá)Fig 4 Recombinant mucunain expressed in Escherichia coli strain Rosetta（DE3）

3.2 黧豆蛋白酶的純化與鑒定

黧豆蛋白酶純化時(shí)同樣進(jìn)行了條件優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)先將包涵體洗滌后溶解，再進(jìn)行酶切、純化和重折疊復(fù)性，這樣得到的重組黧豆蛋白酶收率較大。酶切以及重折疊復(fù)性時(shí)都應(yīng)保證溶液中各成分濃度條件合適，避免沉淀的生成，最終影響復(fù)性及產(chǎn)率。將包涵體進(jìn)行溶解、酶切、純化和重折疊復(fù)性后得到重組黧豆蛋白酶，經(jīng)超濾除鹽和濃縮以及凍干后，得到的重組黧豆蛋白酶純度≥90%，產(chǎn)量達(dá)到50 mg·L-1。

純化復(fù)性后的重組黧豆蛋白酶進(jìn)行SDSPAGE 電泳，結(jié)果如圖5所示。重組黧豆蛋白酶用LC/MS 進(jìn)行鑒定，檢測(cè)到18 條肽段，蛋白序列覆蓋率為68.2%（見圖6，表1）。

表1 重組黧豆蛋白酶的MaxQuant 搜庫肽段鑒定結(jié)果Tab 1 Peptides identification of recombinant mucunain in MaxQuant library

圖5 重組黧豆蛋白酶的純化結(jié)果鑒定Fig 5 15% SDS-PAGE analysis of recombinant mucunain purified by Ni-NTA

圖6 重組黧豆蛋白酶經(jīng)胰蛋白酶酶解的肽段質(zhì)譜TIC 圖Fig 6 Total ion chromatogram of recombinant mucunain obtained by trypsin

3.3 重組黧豆蛋白酶生物活性研究

將得到的重組黧豆蛋白酶刺激內(nèi)源性表達(dá)PAR2 和PAR4 受體的Hela 細(xì)胞（見圖7），采用FLIPR 進(jìn)行了胞質(zhì)鈣流變化的測(cè)定，鈣流變化如圖8所示，發(fā)現(xiàn)重組黧豆蛋白酶可以引起胞內(nèi)Ca2+濃度升高，持續(xù)時(shí)間約20 ～30 min，而加入重組黧豆蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶抑制劑E-64后的混合物后胞質(zhì)Ca2+無明顯的變化，即E-64可以抑制重組黧豆蛋白酶引起胞內(nèi)Ca2+濃度的變化，這表明獲得的重組黧豆蛋白酶具有生物活性。

圖7 Hela 細(xì)胞中PAR2 和PAR4 受體表達(dá)情況Fig 7 Expression of PAR2 and PAR4 receptor in Hela cells

圖8 Hela 細(xì)胞中Ca2+濃度變化曲線Fig 8 Changes of Ca2+concentration in Hela cells

4 討論

Mucunain 是黧豆豆莢毛刺中引起強(qiáng)烈瘙癢的主要成分，是研究慢性瘙癢性疾病的理想模型。大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道中使用的黧豆蛋白酶是從黧豆毛刺中提取后直接使用的，其活性效應(yīng)評(píng)價(jià)也均是通過有活性或滅活的毛刺或者制作成嵌刺板形式將天然黧豆蛋白酶作用于人體或動(dòng)物體皮膚。到目前為止，僅有一篇文章報(bào)道m(xù)ucunain 的重組表達(dá)[6]?？紤]到從黧豆豆莢毛刺中分離提取大量天然mucunain 比較困難，本研究將mucunain基因片段克隆到pET-28a（+）-Sumo 載體上，其上帶有-Sumo 和-His6 標(biāo)簽，以期得到可溶性表達(dá)的目的蛋白，同時(shí)便于后續(xù)進(jìn)行蛋白純化。在重組黧豆蛋白酶表達(dá)的過程中，我們采用了不同的誘導(dǎo)時(shí)間和溫度、不同濃度的IPTG 以及多種大腸埃希菌表達(dá)菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)融合蛋白始終以包涵體的形式呈現(xiàn)。我們對(duì)包涵體的純化和復(fù)性條件也進(jìn)行了適當(dāng)調(diào)整，包括蛋白的溶解、酶切、純化以及重折疊的條件和順序等，最終得到了重組黧豆蛋白酶，產(chǎn)量達(dá)到50 mg·L-1。

文獻(xiàn)表明，mucunain 激活PAR2 和PAR4 受體，不是通過受體配體占位，而是切割PAR2和PAR4 受體使其產(chǎn)生一個(gè)新的栓系配體后，與細(xì)胞外受體外環(huán)-2 相互作用啟動(dòng)自身，活化的PAR2 和PAR4 受體激活PLC，PLC 繼續(xù)激活TRPV1 和TRPA1 通道引起Ca2+內(nèi)流。為了研究重組黧豆蛋白酶是否具有生物活性，本研究采用內(nèi)源性表達(dá)PAR2 和PAR4 受體的Hela 細(xì)胞，使用FLIPR 檢測(cè)Hela 細(xì)胞胞質(zhì)Ca2+濃度變化。FLIPR 檢測(cè)結(jié)果表明，重組黧豆蛋白酶可以引起胞質(zhì)Ca2+持續(xù)變化20 ～30 min，而E-64 可以抑制重組黧豆蛋白酶引起的Hela 細(xì)胞胞質(zhì)中Ca2+的變化，表明重組黧豆蛋白酶具有顯著的生物活性。這與Reddy 等[6]的研究結(jié)果并不完全一致，他們的結(jié)果顯示在分別外源性表達(dá)PAR2 和PAR4 受體的Hela 細(xì)胞中，胞質(zhì)Ca2+濃度的變化持續(xù)20 ～100 s。而在本研究中使用的是內(nèi)源性共表達(dá)PAR2 和PAR4 受體的Hela 細(xì)胞，這可能是重組黧豆蛋白酶引發(fā)了持續(xù)的Ca2+變化的原因，也可能是多種信號(hào)通路對(duì)Ca2+釋放的協(xié)同作用。PAR2 受體下游的PLC 激活后，不僅可以激活TRPV1 和TRPA1 誘導(dǎo)細(xì)胞外Ca2+的內(nèi)流[10]，而且可以將二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）水解成三磷酸肌醇（IP3），IP3 能和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的IP3R 結(jié)合刺激內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+釋放進(jìn)入胞質(zhì)中。在RIN-5F細(xì)胞，飽和濃度的IP3 對(duì)胞質(zhì)中高濃度的Ca2+抑制具有低靈敏度，呈現(xiàn)一個(gè)寬峰，稱為高原型鈣依賴曲線[11]。Pierre 等[12]的研究顯示，PbTx-1誘導(dǎo)的鈣流是多相的和持續(xù)的，鈣流的變化可以持續(xù)25 min，PbTx-1 誘導(dǎo)的Ca2+的增加可能與偏倚通路和經(jīng)典的PAR2 途徑有關(guān)。目前已經(jīng)有研究證實(shí)了激活后的PAR 受體的脫敏、內(nèi)化和再敏化的機(jī)制[13]。在大鼠成纖維細(xì)胞中，PAR4 受體可以促進(jìn)持續(xù)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng)，而且在過表達(dá)時(shí)不會(huì)出現(xiàn)激動(dòng)劑促進(jìn)的磷酸化，活化的PAR4受體也表現(xiàn)出緩慢的內(nèi)化速率[14]。這說明重組黧豆蛋白酶激活的PAR2 和PAR4 受體的內(nèi)化過程較慢也可能是導(dǎo)致Hela 細(xì)胞胞質(zhì)Ca2+濃度持續(xù)變化的原因。另外在本研究中，經(jīng)重組表達(dá)獲得的蛋白為黧豆蛋白酶的活性部分——C1A 半胱氨酸蛋白酶，而Reddy 等[6]獲得的是C1A 半胱氨酸蛋白酶和顆粒蛋白酶部分，這也可能與重組黧豆蛋白酶引起的Ca2+變化不一致有關(guān)。

5 結(jié)論

根據(jù)文獻(xiàn)對(duì)mucunain 的全長序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其活性片段為中間C1A 半胱氨酸蛋白酶部分。因此，我們對(duì)活性片段進(jìn)行設(shè)計(jì)合成、高效表達(dá)及活性驗(yàn)證，獲得了具有生物活性的重組黧豆蛋白酶，為非組胺依賴性癢覺信號(hào)通路研究提供模型物質(zhì)。