張國(guó)榮，張建萍，馬小花，周燕，武新安（蘭州大學(xué)第一醫(yī)院藥劑科，蘭州 730000）

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus（Fisch.）Bge. var.mongholicus（Bge.）Hsiao或膜莢黃芪Astragalusmembranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根，具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、固表止汗、斂瘡生肌等功效[1]。黃芪多糖（Astragalus polysaccharides，APS）是黃芪中含量最多的一類物質(zhì)，是由葡萄糖、果糖、木糖、核糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖和鼠李糖組成的酸性多糖[2-3]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)APS 具有抗感染、抗氧化、抗自由基和免疫調(diào)節(jié)等藥理作用，臨床廣泛應(yīng)用于皮膚創(chuàng)傷、皰疹病毒感染、瘡瘍、過(guò)敏性皮膚病和燙傷等[4-6]。

放療是利用放射線治療腫瘤的一種局部方法，是目前治療惡性腫瘤的重要手段之一，約70%腫瘤患者需要接受放療。然而，95%的放療患者在放療后均會(huì)出現(xiàn)不同形式的放射性皮炎[7]，部分患者甚至因出現(xiàn)3 級(jí)和4 級(jí)放射性皮炎，而不得不進(jìn)行傷口處理，甚至中斷放療。因此，緩解或減慢放射性皮炎進(jìn)展對(duì)于確保放療順利進(jìn)行具有重要的意義。研究表明放射性皮炎與DNA 破壞，氧化應(yīng)激和免疫破壞等有關(guān)[7-8]。P物質(zhì)（substance P，SP）是參與皮膚局部免疫炎癥反應(yīng)和促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)的重要介質(zhì)。P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）是分布于細(xì)胞膜上的外排轉(zhuǎn)運(yùn)體，可促進(jìn)毒性物質(zhì)的排出。免疫組化研究顯示P-gp 在表皮、表皮角質(zhì)形成細(xì)胞或真皮成纖維細(xì)胞中的表達(dá)較弱，而在人皮膚汗管、血管、神經(jīng)鞘和肌肉中有明顯表達(dá)，其可將表皮細(xì)胞吸收的毒性物質(zhì)及代謝廢物及時(shí)分泌到血流和汗管中，促進(jìn)皮膚微環(huán)境的改善[9]。為此，本研究基于SP 和P-gp 探討APS 溫敏凝膠對(duì)小鼠放射性皮炎的作用及其機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器

Western blot 電泳儀（DYCZ-24DN）、 濕轉(zhuǎn)儀（DYCZ-40D）和水平脫色搖床（WD-9405B）（北京六一儀器廠）；Unique 型直線加速器（美國(guó)VARIAN 醫(yī)療設(shè)備有限公司）；羅氏實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（480/480 Ⅱ）（瑞士羅氏公司）；GBS 光學(xué)顯微鏡（德國(guó)GBS 公司）。

1.2 試藥

APS （西安明澤生物科技有限公司，純度＞90%，批號(hào)：89250-26-0）；泊洛沙姆407（德國(guó)巴斯夫公司，批號(hào)：GNC08825B）；泊洛沙姆188（德國(guó)巴斯夫公司，批號(hào)：GNC33221B）；SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒和組織裂解液（碧云天生物科技研究所）；RNA 提取試劑盒和甲苯胺藍(lán)染液（北京索萊寶科技有限公司）；蘇木素染液和伊紅染液（博士德生物）；ECL 發(fā)光液（北京天能公司）；CD31（武漢塞維爾生物科技有限公司）；P-gp 抗體（Abcam 有限公司）；雙染檢測(cè)試劑（抗小鼠IgG/AP+抗兔IgG/HRP）（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；去離子水（自制）。

1.3 動(dòng)物

健康SPF 級(jí)昆明種小鼠，雄性，體質(zhì)量18 ～22 g，動(dòng)物許可證書號(hào)：SCXK（甘）2019-0723，由蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。所有實(shí)驗(yàn)均按照動(dòng)物保護(hù)法進(jìn)行，并經(jīng)蘭州大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2 方法

2.1 APS 溫敏凝膠的制備

將處方量的APS、1，2-丙二醇和0.02%苯扎溴銨先溶于適量純化水中，攪拌加入泊洛沙姆407 和泊洛沙姆188，4℃放置24 h 至泊洛沙姆完全溶解，最后加水至全量，攪拌混勻，即得。膠凝溫度為（32.3±0.2）℃，pH 值為7.03。

2.2 小鼠放射性皮炎模型的制備[10-11]

小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、APS 溫敏凝膠組和空白溫敏凝膠組，每組10 只，除正常對(duì)照組，其他組小鼠腹部以8% Na2S 溶液去毛，將同組10 只小鼠固定于鼠板上，進(jìn)行10 Gy X 線的照射，每日照射1 次，連續(xù)照射5 d（如圖1所示）。每次照射后，在腹部涂抹APS 溫敏凝膠或空白溫敏凝膠，每日涂抹2 次，涂抹15 d。

圖1 小鼠放射性皮炎模型的制備Fig 1 Preparation of radioactive dermatitis model in mice

2.3 RT-PCR 法測(cè)定皮膚中SP 和炎癥因子的mRNA

根據(jù)RNA 提取試劑盒說(shuō)明書提取皮膚組織中的總RNA，經(jīng)總RNA 濃度測(cè)定、反轉(zhuǎn)錄、PCR 反應(yīng)和PCR 產(chǎn)物定量分析，考察APS 對(duì)皮膚中SP和炎癥因子白介素（IL）-6、IL-10、IL-12 mRNA的影響。SP 和各炎癥因子引物序列見(jiàn)表1[12]。

表1 引物序列Tab 1 Primer paris for RT-PCR

2.4 Western blot 法測(cè)定皮膚中P-gp 的表達(dá)

稱取皮膚組織0.04 g，加組織裂解液提取蛋白。然后采用BCA 蛋白定量檢測(cè)法測(cè)定并計(jì)算蛋白濃度。再采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，依次經(jīng)制膠、上樣與電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育和ECL 發(fā)光液顯影成像，最后用Image J 軟件對(duì)成像結(jié)果進(jìn)行灰度值統(tǒng)計(jì)及分析。

2.5 組織形態(tài)學(xué)檢查

將皮膚組織置于10% 甲醛溶液中固化48 h，常規(guī)制備石蠟組織切片，經(jīng)蘇木精-伊紅染色及甲苯胺藍(lán)染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察皮膚組織病理學(xué)形態(tài)。

2.6 CD31 免疫熒光染色[13]

組織切片常規(guī)梯度脫蠟后，用抗原修復(fù)緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)、洗滌（5 min×3 次）、封閉液封閉30 min、4℃孵育一抗過(guò)夜、洗滌（5 min×3次）、孵育二抗50 min、洗滌（5 min×3 次）、加 DAPI 染液避光-室溫孵育10 min、洗滌（5 min×3 次）、抗熒光淬滅封片劑封片，最后于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

2.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用IBM SPSS21 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，通過(guò)單因素方差進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Graphpad Prism 軟件繪圖。

3 結(jié)果

3.1 APS 溫敏凝膠對(duì)放射性皮炎小鼠創(chuàng)面的影響

模型組照射5 d 時(shí)，小鼠皮膚開(kāi)始發(fā)紅伴輕度水腫，有少量分泌物滲出，紅腫部位向外蔓延趨勢(shì)；恢復(fù)5 d 后紅腫減輕，無(wú)明顯分泌物滲出；恢復(fù)10 d 后無(wú)明顯紅腫，皮毛恢復(fù)生長(zhǎng)。與模型比較，APS溫敏凝膠組照射5 d 時(shí)，皮膚紅腫及分泌物滲出情況較輕，小鼠抓撓次數(shù)較少；恢復(fù)5 d 后可見(jiàn)明顯結(jié)痂；恢復(fù)10 d 后無(wú)明顯紅腫，皮毛恢復(fù)生長(zhǎng)較好（見(jiàn)圖2）?？瞻诇孛裟z組對(duì)小鼠創(chuàng)面無(wú)明顯影響。

圖2 APS 溫敏凝膠對(duì)放射性皮炎小鼠創(chuàng)面情況的考察Fig 2 Effect of APS thermosensitive gel on the wound of radioactive dermatitis

3.2 APS 溫敏凝膠對(duì)放射性皮炎SP 和炎癥因子的影響

0 ～5 d 時(shí)，模型組和APS 溫敏凝膠組的SP、IL-6、IL-10 和IL-12 mRNA 隨照射時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高，且APS 溫敏凝膠組的SP 高于模型組；10 d 和15 d 時(shí)APS 溫敏凝膠組的SP、IL-6、IL-10 和IL-12 mRNA 較模型組均顯著降低，見(jiàn)圖3。

圖3 ASP 溫敏凝膠對(duì)放射性皮炎SP 和炎癥因子的影響Fig 3 Effect of APS thermosensitive gel on SP and inflammatory factors of radioactive dermatitis

3.3 APS 溫敏凝膠對(duì)放射性皮炎P-gp 的影響

如圖4a 所示，放療后皮膚組織中P-gp 的表達(dá)顯著降低，即使放療結(jié)束10 d 后，皮膚組織中的P-gp 仍顯著低于正常對(duì)照組。在放療的同時(shí)給予APS 溫敏凝膠，可顯著增加皮膚組織中的P-gp 表達(dá)，且放療后第5 d 的表達(dá)量仍顯著高于正常對(duì)照組，直到放療結(jié)束10 d 后，P-gp 較正常對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 放療（a）及放療的同時(shí)給予APS 溫敏凝膠（b）對(duì)皮膚組織中P-gp 表達(dá)的影響Fig 4 Effect of radiotherapy（a）and combination with APS thermosensitive gel（b）on P-gp in the skin tissue

3.4 APS 溫敏凝膠對(duì)放射性皮炎病理學(xué)改變的影響

HE 染色顯示正常對(duì)照組及空白溫敏凝膠組表皮輕度角化，真皮淺層可見(jiàn)少量淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞浸潤(rùn)，毛囊汗腺未見(jiàn)明顯異常。模型組15 d 時(shí)可見(jiàn)表皮過(guò)度角化伴角化不全，真皮充血水腫，真皮淺層皮膚附屬器周圍有較多淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞浸潤(rùn)。APS 溫敏凝膠組給藥15 d 時(shí)表皮輕度角化，真皮輕度水腫，真皮淺層皮膚附屬器周圍有少量淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞浸潤(rùn)。甲苯胺藍(lán)染色顯示正常對(duì)照組及空白溫敏凝膠組真皮淺層有少量肥大細(xì)胞，模型組15 d 時(shí)可見(jiàn)真皮淺層有大量肥大細(xì)胞，APS 溫敏凝膠組15 d 時(shí)真皮淺層有少量肥大細(xì)胞，較模型組明顯減少，見(jiàn)圖5。

圖5 APS 溫敏凝膠對(duì)放射性皮炎病理學(xué)改變的影響Fig 5 Effect of APS thermosensitive gel on the pathological changes in radioactive dermatitis

3.5 APS 溫敏凝膠對(duì)放射性皮炎微血管的影響

與正常對(duì)照組、模型組和空白溫敏凝膠組相比較，APS 溫敏凝膠組的血管損傷最小，見(jiàn)圖6。

圖6 免疫熒光染色檢測(cè)APS 溫敏凝膠對(duì)放射性皮炎微血管的影響（×15）Fig 6 Effect of APS thermosensitive gel on the microvascular of radioactive dermatitis detected by immunological fluorescence assay（×15）

4 討論

放射治療中高能X 線產(chǎn)生大量的自由基，并導(dǎo)致DNA 雙鏈斷裂，其不僅抑制了皮膚基底角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和分化，而且還可引起炎性反應(yīng)，引發(fā)放射性皮炎[14]。SP 是一種高活性神經(jīng)肽類物質(zhì)，合成于背根神經(jīng)節(jié)的小型神經(jīng)元胞體中，再由軸漿運(yùn)輸至外周神經(jīng)末梢，儲(chǔ)存于皮膚感覺(jué)神經(jīng)末梢的大囊泡中。當(dāng)神經(jīng)末梢受到刺激時(shí)，囊泡中SP 釋放，并與其受體結(jié)合后，在皮膚免疫炎癥和創(chuàng)傷修復(fù)中扮演重要角色。Kim 等[15]研究發(fā)現(xiàn)慢性皮膚損傷如糖尿病大鼠皮膚潰瘍因無(wú)充足的血供，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)因子很難達(dá)到損傷部位，導(dǎo)致傷口難以愈合，SP 偶聯(lián)自組裝肽水凝膠可動(dòng)員具有修復(fù)作用的內(nèi)源性間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢，促進(jìn)糖尿病大鼠皮膚的傷口愈合。有學(xué)者報(bào)道生物活性SP 和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子裝載的殼聚糖微粒復(fù)合水凝膠可顯著增加放射性皮炎的再生修復(fù)[16]。

本研究發(fā)現(xiàn)，0 ～5 d 時(shí)小鼠皮膚組織中SP、IL-6、IL-10 和IL-12 mRNA 逐漸升高，且APS 溫敏凝膠組的SP 高于模型組，提示APS 在炎癥早期一定程度可增加SP 表達(dá)以促進(jìn)皮膚局部免疫炎性因子參與的修復(fù)反應(yīng)。15 d 時(shí)模型組肥大細(xì)胞數(shù)目顯著增加、病理?yè)p傷以及血管丟失最嚴(yán)重，15 d 時(shí)APS 溫敏凝膠組SP 及炎癥因子mRNA 顯著降低，且可有效緩解肥大細(xì)胞數(shù)目的增加、改善病理學(xué)損傷和血管丟失。這些結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致，SP 可增加肥大細(xì)胞蓄積[17]，高濃度SP 可誘導(dǎo)肥大細(xì)胞脫顆粒[18]，肥大細(xì)胞脫顆粒和組胺釋放的免疫反應(yīng)進(jìn)一步加重了急性放射性皮炎[19]。與野生型小鼠相比較，敲除外排性轉(zhuǎn)運(yùn)體P-gp 和乳腺癌耐藥蛋白的小鼠皮炎及抓撓行為更嚴(yán)重，代謝組學(xué)分析顯示皮膚代謝物組胺、尿酸鹽和5-羥色胺在皮膚中的濃度較高[20]，提示這兩種轉(zhuǎn)運(yùn)體可能與皮膚炎癥介質(zhì)有關(guān)，二者具有保護(hù)作用。本研究也發(fā)現(xiàn)模型組P-gp 的表達(dá)顯著降低，APS溫敏凝膠在一定時(shí)間內(nèi)可增加P-gp 的表達(dá)。

綜上所述，APS 溫敏凝膠可增加SP 和P-gp的表達(dá)，降低炎癥因子的表達(dá)，有效緩解小鼠放射性皮炎，提示APS 具有一定的皮膚保護(hù)作用。