楊玉琪，雷玲玲，周磊，周柯，劉昊，鄭恬，孔美娟，劉家云*（. 空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，西安 7003；. 延安大學醫(yī)學院，陜西 延安 76000）

侵襲性真菌病（invasive fungal disease，IFD）是指真菌侵入人體，在組織、器官或血液中生長、繁殖，并導致炎癥反應(yīng)及組織損傷的感染性疾病[1]。其中，侵襲性念珠菌病（invasive candidiasis，IC）的病原菌是以念珠菌為主的酵母樣真菌，可以占到所有IFD 的70%～90%。近年來，隨著醫(yī)療技術(shù)的快速發(fā)展、器官移植的增多和抗菌藥物的應(yīng)用等，IC 的發(fā)病率逐漸上升[2]。IC 因其臨床表現(xiàn)不特異而診斷困難，且治療周期長，會導致病情兇險、死亡率高，從而對患者的生命和財產(chǎn)安全構(gòu)成很大的威脅，因此早期診斷IC 對臨床早期干預(yù)治療具有重大意義[3]。

近幾年，以1，3-β-D-葡聚糖（G 試驗）和半乳甘露聚糖抗原（GM 試驗）檢測為主的血清學檢測方法，因其具有非侵襲性、快速且陽性率高等特點，已被廣泛應(yīng)用于IC 感染的早期診斷[4-6]。前期調(diào)查研究顯示，G 試驗和GM 試驗對IC 診斷的靈敏度和特異度各家報道差異較大[7-10]，分析發(fā)現(xiàn)其可能與各研究者所選擇的研究對象數(shù)量、診斷IC 的診斷方式和判斷標準不同有關(guān)。G試驗和GM 試驗診斷IC 相關(guān)研究的重點和難點在于IC 確診標準的選擇和確定，為進一步探討G 試驗和GM 試驗在IC 早期診斷中的臨床價值，本研究對本院2019年1月—2020年12月期間臨床懷疑為IC 且無粒細胞缺乏的患者的G 試驗、GM 試驗和無菌體液真菌培養(yǎng)結(jié)果進行回顧性相關(guān)分析。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集本院2019年1月—2020年12月期間臨床懷疑為IC 且無粒細胞缺乏，同時送檢G 試驗、GM 試驗和無菌體液真菌培養(yǎng)的患者共計201 例。病例分別來自燒傷科、移植中心、血液科、麻醉監(jiān)護室、心血管外科、心血管內(nèi)科、神經(jīng)內(nèi)科、神經(jīng)外科、肝膽外科、泌尿外科、呼吸內(nèi)科、骨科、老年病科等。根據(jù)中國侵襲性真菌感染工作組2017年“血液病/惡性腫瘤患者侵襲性真菌病的診斷標準與治療原則（第六次修訂版）”確診IFD的診斷標準，本研究根據(jù)無菌體液（包括血液、腦脊液及24 h 內(nèi)的引流液）是否培養(yǎng)出酵母菌，并經(jīng)臨床確診后分為：① 無菌體液真菌培養(yǎng)結(jié)果陽性，臨床確診為侵襲性真菌感染的49 例（IC 組），年齡在22 ～87 歲，平均年齡為（52.4±15.3）歲，男性32 例，女性17 例；② 無菌體液真菌培養(yǎng)結(jié)果陰性，臨床確診為非侵襲性真菌感染的152例（非IC 組），年齡在1 ～96 歲，平均年齡為（50.8±19.0）歲，男性104 例，女性48 例。

1.2 儀器與試藥

1.2.1 儀器 微生物快速動態(tài)檢測系統(tǒng)（IGL-800，北京金山川），全自動細菌培養(yǎng)系統(tǒng)（BACTEC FX，美國BD），全自動微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)（VITEK 2 Compact）、全自動快速微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)（VITEK MS）（法國梅里埃），恒溫恒濕箱（HWS-80B，天津泰斯特），Tol 智能恒溫儀（D-91052，德國Erlangen），低溫高速離心機（Micro 21R）、酶標儀（Multiskan FC）（美國Thermo）。

1.2.2 試藥 GKT 動態(tài)真菌檢測試劑盒和質(zhì)控品（北京金山川，JBGSS8F205Q），GM 檢測試劑盒（美國Bio-Rad，F(xiàn)92430），酵母菌鑒定卡（法國梅里埃，21343），血平板和沙保弱平板（鄭州安圖生物）。

1.3 方法

G 試驗：嚴格按照儀器和試劑盒說明書進行標準操作，結(jié)果參考試劑盒說明書，G ≤60 pg·mL-1為陰性，G ＞60 pg·mL-1為陽性。GM 試驗：嚴格按照試劑盒說明書進行標準操作，最后測定每個反應(yīng)孔的OD值，通過換算，將待測樣本的OD值轉(zhuǎn)化為血清指數(shù)I（待測樣本的血清指數(shù)＝待測樣本OD值/標準對照血清OD值），結(jié)果參考試劑盒說明書，血清指數(shù)I ≤0.5 為陰性，血清指數(shù)I ＞0.5 為陽性。真菌培養(yǎng)及鑒定：無菌體液真菌培養(yǎng)及真菌病原學鑒定按《全國臨床檢驗操作規(guī)程》（第四版）進行，報警陽性后，轉(zhuǎn)種于血平板、沙保弱平板，采用VITEK 2 Compact 全自動微生物鑒定系統(tǒng)、全自動快速微生物質(zhì)譜檢測分析系統(tǒng)（MS）對真菌菌種進行鑒定。

1.4 統(tǒng)計學分析

應(yīng)用統(tǒng)計學軟件SPSS 23.0 進行數(shù)據(jù)處理及分析，以無菌體液真菌培養(yǎng)陽性為金標準，分析G 試驗、GM 試驗以及二者聯(lián)合檢測診斷IC 的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值及陰性預(yù)測值、符合率等指標。數(shù)據(jù)經(jīng)檢驗，計量資料是非正態(tài)分布，因此以M（P25，P75）對其進行描述；計數(shù)資料“例數(shù)（百分比）”以“n（%）”的形式進行統(tǒng)計學描述。兩組間分類資料率的比較使用χ2檢驗，以P＜0.05 表明其差異有統(tǒng)計學意義。同時繪制ROC 曲線，對診斷效能進行分析。

2 結(jié)果

2.1 無菌體液標本來源

201 例可疑IC 且無粒細胞缺乏患者，其無菌體液培養(yǎng)標本主要來源于血液、腦脊液，以及無菌穿刺抽取的胸腹水、腹透液等無菌體液標本，具體見表1。

表1 無菌體液標本來源(n)Tab 1 Source of sterile body fluid samples (n)

2.2 菌株分布及報警時間

49 例無菌體液真菌培養(yǎng)陽性的IC 確診病例，經(jīng)鑒定菌株分布為：白色念珠菌17 株（34.69%），近平滑念珠菌14 株（28.57%），熱帶念珠菌8 株（16.33%），光滑念珠菌6 株（12.24%），新型隱球菌3 株（6.12%），解脂假絲酵母菌1 株（2.04%）。其中，陽性報警時間最短為13 小時5 分鐘，最長為5 天16 小時，平均陽性報警時間為1 天23 小時24 分鐘。

2.3 G 試驗和GM 試驗檢測值水平

IC 組和非IC 組的G 試驗和GM 試驗其檢測值水平及P值，見表2。

表2 IC 組和非IC 組G 試驗和GM 試驗檢測值Tab 2 Detection value of G test and GM test in the IC group and the non-IC group

2.4 G 試驗和GM 試驗診斷IC 的臨床效能

以G 試驗和GM 試驗檢測結(jié)果大于陽性判斷值為IC 實驗室指標，以無菌體液培養(yǎng)真菌陽性結(jié)果為IC 確診指標，計算G 試驗、GM 試驗以及聯(lián)合檢測診斷IC 的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值等指標，見表3。

表3 G 試驗、GM 試驗診斷IC 的性能指數(shù)(%)Tab 3 Performance index of G test and GM test for IC (%)

2.5 分析不同濃度水平的G 試驗和GM 試驗對IC 診斷效能

將49 例IC 患者和152 例非IC 患者作為分組，繪制ROC 曲線并計算曲線下面積，見圖1。其中，G 試驗檢測質(zhì)量濃度在10.18 pg·mL-1時，靈敏度為87.0%，特異度為85.5%，診斷最高效能為AUC＝0.825（95%的置信區(qū)間72.9%～92%）；GM 試驗血清指數(shù)為0.185 時，靈敏度為73.9%，特異度為40.1%，診斷最高效能為AUC＝0.559（95%的置信區(qū)間46.2%～65.6%）；G/GM 聯(lián)合檢測，診斷最高效能為AUC＝0.826（95%的置信區(qū)間：73.8%～91.5%）。

圖1 G 試驗和GM 試驗診斷IC 的ROC 曲線Fig 1 ROC curve of G test and GM test for IC

3 討論

根據(jù)中國侵襲性真菌感染工作組2017年“血液病/惡性腫瘤患者侵襲性真菌病的診斷標準與治療原則（第六次修訂版）”的標準，直接針吸或者活檢取材的深部無菌部位標本，通過組織病理學或者細胞病理學檢查是確診IFD 的金標準，但是因其具有創(chuàng)傷性、耗時長，且其檢出陽性率跟取材相關(guān)，易導致漏診，因此對于診斷IFD 具有一定的局限性。而以無菌體液真菌培養(yǎng)陽性作為IFD 診斷的金標準，可以降低臨床診斷的不確定性所造成的偏差，提高其客觀性和準確性。本研究的陽性無菌體液標本，菌株分離結(jié)果最終均以念珠菌為主，故本文主要探討G 試驗和GM 試驗對IC 早期診斷的效果和臨床應(yīng)用價值。

表2結(jié)果顯示，IC 組和非IC 組G 試驗的檢測結(jié)果差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；而兩組GM 試驗血清指數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P＝0.744）。提示G 試驗的檢測結(jié)果可以為IC 的早期診斷提供重要的參考，而GM 試驗在兩組間的差異無統(tǒng)計學意義，這與之前報道存在差異[11-12]。究其原因，1，3-β-D葡聚糖是除隱球菌和接合菌外所有真菌（包括念珠菌屬、曲霉、鐮孢菌屬、酵母菌、毛孢子菌屬、支頂孢屬等）細胞壁的特有成分，而半乳甘露聚糖（GM）是曲霉菌特有的細胞壁多糖，本研究確診的49 例IC 無菌體液培養(yǎng)真菌陽性菌株均為念珠菌屬，對于念珠菌感染的患者，G 試驗可呈陽性，而GM 試驗為陰性，這可能是造成IC 組和非IC 組GM 試驗檢測結(jié)果無統(tǒng)計學差異的原因。表3結(jié)果顯示，G 試驗診斷IC 的特異度，不及GM 試驗高；而G 試驗診斷IC 的靈敏度明顯高于GM 試驗；G+GM 聯(lián)合（兩項試驗均為陽性）特異度可以提高至98.03%，其均高于G 試驗或GM試驗單獨檢測的特異度；而兩個試驗進行G/GM 聯(lián)合（兩項試驗中任何一項試驗為陽性）靈敏度可以提高至82.61%，其也均高于G 試驗或GM 試驗單獨檢測的靈敏度。可以看出，G 試驗和GM 試驗聯(lián)合檢測可以提高對IC 的診斷效率，G 試驗和GM試驗結(jié)果同為陰性時可擬排除IC。且合理設(shè)置G試驗和GM 試驗的臨床診斷界值可以提高診斷效能，G/GM 聯(lián)合檢測可以提高對IC 診斷的最高診斷效能，值得注意的是GM 試驗單獨用于無菌體液感染IC 的診斷其診斷效能較低。

G 試驗和GM 試驗具有檢測速度快，操作簡單，檢測范圍寬，連續(xù)定量檢測可以為IFD 的治療效果提供參考依據(jù)。文獻報道，G 試驗因受各種醫(yī)療操作（包括血透、輸注免疫球蛋白、凝血因子等）、使用藥物（包括抗腫瘤藥物、磺胺類藥物等）、食用蘑菇類食物、細菌感染的白血病等各種因素的影響造成試驗結(jié)果出現(xiàn)假陽性[13-14]，而影響其出現(xiàn)假陰性的因素較少。GM 試驗相對于G 試驗，其影響因素較少，特異度可以達到85%以上[15]。本研究選用無菌體液真菌培養(yǎng)結(jié)果作為IFD 診斷的金標準，雖減少了因臨床診斷IFD 導致的不確定性，但也導致針對檢測侵襲性曲霉菌的GM 試驗，其在IC 組和非IC 組差異無統(tǒng)計學意義，同時導致GM 試驗的靈敏度較低，這是本研究不夠全面的地方。

通過本研究綜合分析，以無菌體液真菌培養(yǎng)結(jié)果作為IC 診斷的金標準，G 試驗和GM 試驗其特異度均在90%以上，G 試驗的陰性預(yù)測值也達到90%以上，兩者聯(lián)合檢測可以提高IC 的診斷價值，是無菌體液侵襲性真菌感染早期實驗室診斷的重要檢測指標；同時，兩者同為陰性時對排除IC 具有明確的指導意義。合理檢測G 試驗和GM試驗，綜合分析兩者的檢測結(jié)果，可以為IC 的早期診斷、早期治療提供有效的實驗室支持。