楊玉琪，雷玲玲，周磊，周柯，劉昊，鄭恬，孔美娟，劉家云*（. 空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，西安 7003；. 延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院，陜西 延安 76000）

侵襲性真菌?。╥nvasive fungal disease，IFD）是指真菌侵入人體，在組織、器官或血液中生長、繁殖，并導(dǎo)致炎癥反應(yīng)及組織損傷的感染性疾病[1]。其中，侵襲性念珠菌病（invasive candidiasis，IC）的病原菌是以念珠菌為主的酵母樣真菌，可以占到所有IFD 的70%～90%。近年來，隨著醫(yī)療技術(shù)的快速發(fā)展、器官移植的增多和抗菌藥物的應(yīng)用等，IC 的發(fā)病率逐漸上升[2]。IC 因其臨床表現(xiàn)不特異而診斷困難，且治療周期長，會(huì)導(dǎo)致病情兇險(xiǎn)、死亡率高，從而對患者的生命和財(cái)產(chǎn)安全構(gòu)成很大的威脅，因此早期診斷IC 對臨床早期干預(yù)治療具有重大意義[3]。

近幾年，以1，3-β-D-葡聚糖（G 試驗(yàn)）和半乳甘露聚糖抗原（GM 試驗(yàn)）檢測為主的血清學(xué)檢測方法，因其具有非侵襲性、快速且陽性率高等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于IC 感染的早期診斷[4-6]。前期調(diào)查研究顯示，G 試驗(yàn)和GM 試驗(yàn)對IC 診斷的靈敏度和特異度各家報(bào)道差異較大[7-10]，分析發(fā)現(xiàn)其可能與各研究者所選擇的研究對象數(shù)量、診斷IC 的診斷方式和判斷標(biāo)準(zhǔn)不同有關(guān)。G試驗(yàn)和GM 試驗(yàn)診斷IC 相關(guān)研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)在于IC 確診標(biāo)準(zhǔn)的選擇和確定，為進(jìn)一步探討G 試驗(yàn)和GM 試驗(yàn)在IC 早期診斷中的臨床價(jià)值，本研究對本院2019年1月—2020年12月期間臨床懷疑為IC 且無粒細(xì)胞缺乏的患者的G 試驗(yàn)、GM 試驗(yàn)和無菌體液真菌培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行回顧性相關(guān)分析。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集本院2019年1月—2020年12月期間臨床懷疑為IC 且無粒細(xì)胞缺乏，同時(shí)送檢G 試驗(yàn)、GM 試驗(yàn)和無菌體液真菌培養(yǎng)的患者共計(jì)201 例。病例分別來自燒傷科、移植中心、血液科、麻醉監(jiān)護(hù)室、心血管外科、心血管內(nèi)科、神經(jīng)內(nèi)科、神經(jīng)外科、肝膽外科、泌尿外科、呼吸內(nèi)科、骨科、老年病科等。根據(jù)中國侵襲性真菌感染工作組2017年“血液病/惡性腫瘤患者侵襲性真菌病的診斷標(biāo)準(zhǔn)與治療原則（第六次修訂版）”確診IFD的診斷標(biāo)準(zhǔn)，本研究根據(jù)無菌體液（包括血液、腦脊液及24 h 內(nèi)的引流液）是否培養(yǎng)出酵母菌，并經(jīng)臨床確診后分為：① 無菌體液真菌培養(yǎng)結(jié)果陽性，臨床確診為侵襲性真菌感染的49 例（IC 組），年齡在22 ～87 歲，平均年齡為（52.4±15.3）歲，男性32 例，女性17 例；② 無菌體液真菌培養(yǎng)結(jié)果陰性，臨床確診為非侵襲性真菌感染的152例（非IC 組），年齡在1 ～96 歲，平均年齡為（50.8±19.0）歲，男性104 例，女性48 例。

1.2 儀器與試藥

1.2.1 儀器 微生物快速動(dòng)態(tài)檢測系統(tǒng)（IGL-800，北京金山川），全自動(dòng)細(xì)菌培養(yǎng)系統(tǒng)（BACTEC FX，美國BD），全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)（VITEK 2 Compact）、全自動(dòng)快速微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)（VITEK MS）（法國梅里埃），恒溫恒濕箱（HWS-80B，天津泰斯特），Tol 智能恒溫儀（D-91052，德國Erlangen），低溫高速離心機(jī)（Micro 21R）、酶標(biāo)儀（Multiskan FC）（美國Thermo）。

1.2.2 試藥 GKT 動(dòng)態(tài)真菌檢測試劑盒和質(zhì)控品（北京金山川，JBGSS8F205Q），GM 檢測試劑盒（美國Bio-Rad，F(xiàn)92430），酵母菌鑒定卡（法國梅里埃，21343），血平板和沙保弱平板（鄭州安圖生物）。

1.3 方法

G 試驗(yàn)：嚴(yán)格按照儀器和試劑盒說明書進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)操作，結(jié)果參考試劑盒說明書，G ≤60 pg·mL-1為陰性，G ＞60 pg·mL-1為陽性。GM 試驗(yàn)：嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)操作，最后測定每個(gè)反應(yīng)孔的OD值，通過換算，將待測樣本的OD值轉(zhuǎn)化為血清指數(shù)I（待測樣本的血清指數(shù)＝待測樣本OD值/標(biāo)準(zhǔn)對照血清OD值），結(jié)果參考試劑盒說明書，血清指數(shù)I ≤0.5 為陰性，血清指數(shù)I ＞0.5 為陽性。真菌培養(yǎng)及鑒定：無菌體液真菌培養(yǎng)及真菌病原學(xué)鑒定按《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》（第四版）進(jìn)行，報(bào)警陽性后，轉(zhuǎn)種于血平板、沙保弱平板，采用VITEK 2 Compact 全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)、全自動(dòng)快速微生物質(zhì)譜檢測分析系統(tǒng)（MS）對真菌菌種進(jìn)行鑒定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 23.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及分析，以無菌體液真菌培養(yǎng)陽性為金標(biāo)準(zhǔn)，分析G 試驗(yàn)、GM 試驗(yàn)以及二者聯(lián)合檢測診斷IC 的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值及陰性預(yù)測值、符合率等指標(biāo)。數(shù)據(jù)經(jīng)檢驗(yàn)，計(jì)量資料是非正態(tài)分布，因此以M（P25，P75）對其進(jìn)行描述；計(jì)數(shù)資料“例數(shù)（百分比）”以“n（%）”的形式進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述。兩組間分類資料率的比較使用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05 表明其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)繪制ROC 曲線，對診斷效能進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 無菌體液標(biāo)本來源

201 例可疑IC 且無粒細(xì)胞缺乏患者，其無菌體液培養(yǎng)標(biāo)本主要來源于血液、腦脊液，以及無菌穿刺抽取的胸腹水、腹透液等無菌體液標(biāo)本，具體見表1。

表1 無菌體液標(biāo)本來源(n)Tab 1 Source of sterile body fluid samples (n)

2.2 菌株分布及報(bào)警時(shí)間

49 例無菌體液真菌培養(yǎng)陽性的IC 確診病例，經(jīng)鑒定菌株分布為：白色念珠菌17 株（34.69%），近平滑念珠菌14 株（28.57%），熱帶念珠菌8 株（16.33%），光滑念珠菌6 株（12.24%），新型隱球菌3 株（6.12%），解脂假絲酵母菌1 株（2.04%）。其中，陽性報(bào)警時(shí)間最短為13 小時(shí)5 分鐘，最長為5 天16 小時(shí)，平均陽性報(bào)警時(shí)間為1 天23 小時(shí)24 分鐘。

2.3 G 試驗(yàn)和GM 試驗(yàn)檢測值水平

IC 組和非IC 組的G 試驗(yàn)和GM 試驗(yàn)其檢測值水平及P值，見表2。

表2 IC 組和非IC 組G 試驗(yàn)和GM 試驗(yàn)檢測值Tab 2 Detection value of G test and GM test in the IC group and the non-IC group

2.4 G 試驗(yàn)和GM 試驗(yàn)診斷IC 的臨床效能

以G 試驗(yàn)和GM 試驗(yàn)檢測結(jié)果大于陽性判斷值為IC 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，以無菌體液培養(yǎng)真菌陽性結(jié)果為IC 確診指標(biāo)，計(jì)算G 試驗(yàn)、GM 試驗(yàn)以及聯(lián)合檢測診斷IC 的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值等指標(biāo)，見表3。

表3 G 試驗(yàn)、GM 試驗(yàn)診斷IC 的性能指數(shù)(%)Tab 3 Performance index of G test and GM test for IC (%)

2.5 分析不同濃度水平的G 試驗(yàn)和GM 試驗(yàn)對IC 診斷效能

將49 例IC 患者和152 例非IC 患者作為分組，繪制ROC 曲線并計(jì)算曲線下面積，見圖1。其中，G 試驗(yàn)檢測質(zhì)量濃度在10.18 pg·mL-1時(shí)，靈敏度為87.0%，特異度為85.5%，診斷最高效能為AUC＝0.825（95%的置信區(qū)間72.9%～92%）；GM 試驗(yàn)血清指數(shù)為0.185 時(shí)，靈敏度為73.9%，特異度為40.1%，診斷最高效能為AUC＝0.559（95%的置信區(qū)間46.2%～65.6%）；G/GM 聯(lián)合檢測，診斷最高效能為AUC＝0.826（95%的置信區(qū)間：73.8%～91.5%）。

圖1 G 試驗(yàn)和GM 試驗(yàn)診斷IC 的ROC 曲線Fig 1 ROC curve of G test and GM test for IC

3 討論

根據(jù)中國侵襲性真菌感染工作組2017年“血液病/惡性腫瘤患者侵襲性真菌病的診斷標(biāo)準(zhǔn)與治療原則（第六次修訂版）”的標(biāo)準(zhǔn)，直接針吸或者活檢取材的深部無菌部位標(biāo)本，通過組織病理學(xué)或者細(xì)胞病理學(xué)檢查是確診IFD 的金標(biāo)準(zhǔn)，但是因其具有創(chuàng)傷性、耗時(shí)長，且其檢出陽性率跟取材相關(guān)，易導(dǎo)致漏診，因此對于診斷IFD 具有一定的局限性。而以無菌體液真菌培養(yǎng)陽性作為IFD 診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，可以降低臨床診斷的不確定性所造成的偏差，提高其客觀性和準(zhǔn)確性。本研究的陽性無菌體液標(biāo)本，菌株分離結(jié)果最終均以念珠菌為主，故本文主要探討G 試驗(yàn)和GM 試驗(yàn)對IC 早期診斷的效果和臨床應(yīng)用價(jià)值。

表2結(jié)果顯示，IC 組和非IC 組G 試驗(yàn)的檢測結(jié)果差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；而兩組GM 試驗(yàn)血清指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.744）。提示G 試驗(yàn)的檢測結(jié)果可以為IC 的早期診斷提供重要的參考，而GM 試驗(yàn)在兩組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與之前報(bào)道存在差異[11-12]。究其原因，1，3-β-D葡聚糖是除隱球菌和接合菌外所有真菌（包括念珠菌屬、曲霉、鐮孢菌屬、酵母菌、毛孢子菌屬、支頂孢屬等）細(xì)胞壁的特有成分，而半乳甘露聚糖（GM）是曲霉菌特有的細(xì)胞壁多糖，本研究確診的49 例IC 無菌體液培養(yǎng)真菌陽性菌株均為念珠菌屬，對于念珠菌感染的患者，G 試驗(yàn)可呈陽性，而GM 試驗(yàn)為陰性，這可能是造成IC 組和非IC 組GM 試驗(yàn)檢測結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的原因。表3結(jié)果顯示，G 試驗(yàn)診斷IC 的特異度，不及GM 試驗(yàn)高；而G 試驗(yàn)診斷IC 的靈敏度明顯高于GM 試驗(yàn)；G+GM 聯(lián)合（兩項(xiàng)試驗(yàn)均為陽性）特異度可以提高至98.03%，其均高于G 試驗(yàn)或GM試驗(yàn)單獨(dú)檢測的特異度；而兩個(gè)試驗(yàn)進(jìn)行G/GM 聯(lián)合（兩項(xiàng)試驗(yàn)中任何一項(xiàng)試驗(yàn)為陽性）靈敏度可以提高至82.61%，其也均高于G 試驗(yàn)或GM 試驗(yàn)單獨(dú)檢測的靈敏度?？梢钥闯?，G 試驗(yàn)和GM 試驗(yàn)聯(lián)合檢測可以提高對IC 的診斷效率，G 試驗(yàn)和GM試驗(yàn)結(jié)果同為陰性時(shí)可擬排除IC。且合理設(shè)置G試驗(yàn)和GM 試驗(yàn)的臨床診斷界值可以提高診斷效能，G/GM 聯(lián)合檢測可以提高對IC 診斷的最高診斷效能，值得注意的是GM 試驗(yàn)單獨(dú)用于無菌體液感染IC 的診斷其診斷效能較低。

G 試驗(yàn)和GM 試驗(yàn)具有檢測速度快，操作簡單，檢測范圍寬，連續(xù)定量檢測可以為IFD 的治療效果提供參考依據(jù)。文獻(xiàn)報(bào)道，G 試驗(yàn)因受各種醫(yī)療操作（包括血透、輸注免疫球蛋白、凝血因子等）、使用藥物（包括抗腫瘤藥物、磺胺類藥物等）、食用蘑菇類食物、細(xì)菌感染的白血病等各種因素的影響造成試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)假陽性[13-14]，而影響其出現(xiàn)假陰性的因素較少。GM 試驗(yàn)相對于G 試驗(yàn)，其影響因素較少，特異度可以達(dá)到85%以上[15]。本研究選用無菌體液真菌培養(yǎng)結(jié)果作為IFD 診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，雖減少了因臨床診斷IFD 導(dǎo)致的不確定性，但也導(dǎo)致針對檢測侵襲性曲霉菌的GM 試驗(yàn)，其在IC 組和非IC 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)導(dǎo)致GM 試驗(yàn)的靈敏度較低，這是本研究不夠全面的地方。

通過本研究綜合分析，以無菌體液真菌培養(yǎng)結(jié)果作為IC 診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，G 試驗(yàn)和GM 試驗(yàn)其特異度均在90%以上，G 試驗(yàn)的陰性預(yù)測值也達(dá)到90%以上，兩者聯(lián)合檢測可以提高IC 的診斷價(jià)值，是無菌體液侵襲性真菌感染早期實(shí)驗(yàn)室診斷的重要檢測指標(biāo)；同時(shí)，兩者同為陰性時(shí)對排除IC 具有明確的指導(dǎo)意義。合理檢測G 試驗(yàn)和GM試驗(yàn)，綜合分析兩者的檢測結(jié)果，可以為IC 的早期診斷、早期治療提供有效的實(shí)驗(yàn)室支持。