陳雙華，李榮，周玉生（1. 南華大學(xué)藥物藥理研究所，湖南 衡陽 421001；2. 湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，湖南 株洲 412000；3. 南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院，湖南 衡陽 421001；4. 南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院，湖南 衡陽 421001）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，病死率居女性腫瘤首位[1]。隨著診療手段的不斷發(fā)展，乳腺癌患者的病死率逐漸下降，但即便是在疾病早期進行治療，也只能短時間內(nèi)控制疾病的發(fā)展，大多數(shù)患者仍會復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、惡化。因此，深入了解乳腺癌的發(fā)病機制和乳腺癌細胞的分子生物學(xué)特點，尋找乳腺癌新的治療靶點，對乳腺癌的防治是非常必要的[2]。

ABCE1 屬ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子基因亞家族成員之一，其編碼的ABCE1 蛋白是一種核糖核酸酶L（ribonuclease L，RNase L）抑制因子[3]。RNase L 屬于2-5 腺苷酸（2'-5'oligoadenylate，2-5A）系統(tǒng)，作用于水解磷酸二酯鍵，水解單鏈RNA 分子[4]。以往研究表明RNase L 主要與干擾素抗病毒作用有關(guān)，近期研究表明此酶有誘導(dǎo)細胞死亡的功能[5-6]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，RNase不僅具有消化酶的功能，而且還可作為一種有選擇性的細胞毒素，具有抗病毒和抗腫瘤等特殊的生物學(xué)功能[7]。研究發(fā)現(xiàn)，ABCE1 能特異性抑制2-5A/RNase L 信號通路，又名RNase L 抑制因子，從而增強腫瘤細胞蛋白質(zhì)合成及細胞增殖，促進腫瘤的進展[3]。Huang 等[2]研究發(fā)現(xiàn)，在人小細胞肺癌細胞中轉(zhuǎn)染ABCE1基因的siRNA 后能限制腫瘤細胞的增殖、侵襲與遷移，并促使其凋亡。使用ABCE1 特異性shRNA 的慢病毒載體感染人肺腺癌細胞后，細胞生長受到顯著的抑制，凋亡率增加[8]，上述研究均提示ABCE1基因與惡性腫瘤有著較為密切的關(guān)系。

微小RNA（micro RNA，miRNA）是真核細胞中一類參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的非編碼小分子RNA，是一類近年來新發(fā)現(xiàn)的非編碼小RNA分子，通常成熟miRNA 通過與mRNA 完全或不完全配對，降解靶mRNA 或阻遏其轉(zhuǎn)錄后翻譯[9]。研究表明，超過50%的miRNA 基因定位于與腫瘤相關(guān)的基因組區(qū)域或其脆性位點，認為miRNA 在腫瘤的發(fā)生機制中扮演著重要作用。多種miRNA 在乳腺癌中低表達并可作為腫瘤抑制基因，如miR-34、miR-125、miR-200、miR-205、miR-328、miR-30、miR-213和miR-203等[10-12]。Cosentino 等[12]首次對乳腺癌疾病患者的癌組織miRNA 表達譜進行了系統(tǒng)性分析，發(fā)現(xiàn)這些miRNA 表達異常可能誘發(fā)乳腺癌，并在腫瘤的分類及預(yù)后評估方面起著重要的作用，如miR-213及miR-203與乳腺癌的發(fā)展相關(guān)聯(lián)。隨著越來越多miRNA 與乳腺癌相關(guān)研究成果的積累，現(xiàn)在更多的關(guān)注于miRNA 的靶向調(diào)控作為乳腺癌治療的一個新手段。因此本課題研究ABCE1在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，并尋找調(diào)控其基因表達的miRNA，探討干預(yù)ABCE1基因表達對乳腺癌腫瘤細胞的影響及作用機制。

1 材料

1.1 細胞與試藥

乳腺癌細胞株（MCF-7，中南大學(xué)湘雅藥學(xué)院饋贈，來源于中國科學(xué)院上海細胞庫）。β-actin 抗體（sc-47778）、GAPDH 抗體（sc-47724）、tubulin抗體（sc-23950）（美國santa cruz 公司）；山羊抗兔IgG（ZB-2301）、兔抗山羊IgG（ZF-0314）和DAB試劑盒（ZLI-9017）（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；RNA 提取試劑盒、cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RIPA 裂解液（CW2333）和SDS-PAGE 制膠試劑盒（CW0022）（康為世紀）；蛋白marker（26616）（Thermo scientific）；clone1 試劑盒（CL001）（湖南萊拓福生物科技有限公司）。miR-145 mimic 和miR-145 inhibitor 由吉瑪基因（中國）合成；本實驗中所用到的引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 儀器

生物倒置顯微鏡（日本Nikon 公司），高速冷凍離心機（德國Eppendorf 公司），酶標儀（美國BioTek 公司），凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Alpha Innotech 公司），Q-PCR 儀（美國Bio Rad 公司）。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)和組織樣本來源

MCF-7 細胞培養(yǎng)于含體積分數(shù)為10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 U·mL-1鏈霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃、5%CO2條件。

本研究中所用到的組織樣本來自南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，選擇2015年1月至2017年3月收住院行手術(shù)治療的乳腺癌患者10 例，術(shù)前均無放療、化療及其他治療史，患者中位年齡52 歲（31 ～69 歲），均經(jīng)病理檢查確診。所有患者均為中國漢族人，無親緣關(guān)系，并簽署知情同意書，收集上述患者術(shù)后乳腺病變組織和癌旁組織，-86℃保存。本研究已獲得本院倫理委員會的批準同意。納入標準：① 乳腺癌患者經(jīng)病理診斷確診；② 認知功能正常；③ 知情同意本研究。排除標準：① 有乳腺整形病史患者；② 認知功能障礙患者；③ 伴有嚴重心肝腎功能不全患者；④ 伴有急性傳染病患者。

2.2 Western blot 實驗

提取乳腺癌組織和癌旁組織蛋白：將組織稱重，分別取約100 mg 組織于研磨器內(nèi)，加入500 μL 細胞裂解液RIPA 研磨。

提取乳腺癌細胞蛋白：將乳腺癌細胞MCF-7分為3 組，分別是對照組（轉(zhuǎn)染miR-NC，序列為5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'）、miR-145高表達組（轉(zhuǎn)染miR-145 mimic，序列為5'-GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU-3'）和miR-145抑制組（轉(zhuǎn)染miR-145 inhibitor，序列為5'-AGGGAUUCCUGGGAAAACUGGAC-3'）。用預(yù)冷的PBS 清洗細胞3 次，小心傾去PBS，并加入RIPA裂解液于冰上孵育30 min。使用RIPA 裂解液分別提取組織和細胞中的總蛋白后，采用BAD 試劑盒測定提取液中蛋白濃度，上樣蛋白量為70 μg，蛋白樣本與上樣緩沖液以1∶4 體積混合均勻，置于100℃水中煮10 min，使蛋白充分變性。待蛋白樣本混合物自然冷卻后加至凝膠加樣孔內(nèi)，電泳直至溴酚蘭到達凝膠底部。

利用轉(zhuǎn)膜裝置用濕轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF 上，轉(zhuǎn)膜后用麗春紅溶液染膜4 ～8 min，再用去離子水漂洗脫色，觀察PVDF 膜上有無蛋白條帶出現(xiàn)，以明確轉(zhuǎn)膜效果。將已完成轉(zhuǎn)膜的PVDF 膜浸泡于1%脫脂奶粉中室溫封閉1 h。然后用TBST 漂洗PVDF 膜3 次，每次5 min，用相應(yīng)一抗于37℃孵育1 h，然后將PVDF 膜用TBST 漂洗3 次，每次5 min，加入辣根過氧化酶標記的IgG二抗，于37℃孵育45 ～60 min，TBST 洗膜3 次，每次5 min，然后取出PVDF 膜，瀝干殘余液體，置于凝膠成像分析系統(tǒng)觀察照相并進行灰度掃描。用β-actin 作標準，來表示目的蛋白的相對含量。

2.3 總RNA 提取與熒光定量PCR

采用Trizol 分別提取乳腺組織總RNA 提取和MCF-7 細胞總RNA 提取，核酸蛋白分析儀測量樣本的A260和A280值。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA，置于-20℃保存?zhèn)溆?。采?0 μL 反應(yīng)體系進行目的基因表達分析，實驗條件為：50 ℃ 2 min；95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s；60 ℃30 s，40 個循環(huán)；Melt Curve 55 ～95℃。實驗結(jié)果由熒光定量PCR 分析軟件自動進行統(tǒng)計和計算。實驗中使用引物如下：ABCE1上游引物：5'-GCCCAGTTATGGCAGACAAG-3'，下游引物：5'-GTGACAACTCCATAGGCGCT-3'；β-actin 上游引物：5'-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3'，下游引物：5'-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3'。根據(jù)miRNA-145 成熟體序列5'-GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU-3'設(shè)計如下引物用于檢測細胞內(nèi)miRNA-145 的表達水平：上游引物：5'-ACACTCCAGCTGGGGTCCAGTTTTCCCAGGA-3'；下游引物：5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAGGGATTC-3'。以U6 作為miR-145 檢測的參照miRNA，U6 上游引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

2.4 MTT 實驗

將乳腺癌細胞MCF-7 分為3 組，即對照組（轉(zhuǎn)染miR-NC）、miR-145 高表達組（轉(zhuǎn)染miR-145 mimic） 和miR-145 抑制組（轉(zhuǎn)染miR-145 inhibitor）。收集各組MCF-7 細胞，用完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞懸液濃度為5×104個·mL-1，在96 孔板中每孔加入100 μL 細胞懸液，每個樣本設(shè)6 個復(fù)孔，邊緣孔用無菌PBS 充填，細胞培養(yǎng)24 h 后，每孔加入20 μL MTT 工作液（5 mg·mL-1），培養(yǎng)3 ～4 h 后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，繼續(xù)孵育15 min 后，酶標儀檢測490 nm 處各孔的吸光度值（OD）。細胞存活率＝（實驗組OD-空白組OD）/（對照組OD-空白組OD）×100%。

2.5 psiCHECK-ABCE1-3'UTR 載體構(gòu)建與鑒定

根據(jù)clone1 試劑盒設(shè)計ABCE1 mRNA 3'-UTR 插入片段引物，序列如下：上游引物：5'-AT TCTAGGCGATCGCTCGAGTAGACTGACTCTG AGAATAT-3'（Xhol）；下游引物：5'-TTATTGC GGCCAGCGGCCGCAGCCATTATTTGCATATT AA-3'（Notl）。從MCF-7 細胞中提取總mRNA，利用上述引物進行PCR 擴增出ABCE1 從終止密碼子到3500 位的UTR 序列及兩側(cè)Xhol 和Notl的酶切序列區(qū)。利用clone1 試劑盒將psiCHECK質(zhì)粒與PCR 產(chǎn)物進行連接，培養(yǎng)感受態(tài)細胞，提取菌液，純化質(zhì)粒，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.6 miRNA 生物信息學(xué)分析

通過Target Scans 靶基因預(yù)測軟件對miR-145的潛在靶基因進行預(yù)測，為了降低假陽性，選擇至少6 種miRNA 靶標預(yù)測工具預(yù)測的交集。利用在線軟件RNAhybrid 預(yù)測miR-145 與ABCE1 mRNA 靶序列的結(jié)合自由能。通過TAM 數(shù)據(jù)庫查詢miR-145 與疾病的相關(guān)性。

2.7 熒光素酶報告基因?qū)嶒?/h3>

采用重組質(zhì)粒psiCHECK-ABCE1-3'UTR 轉(zhuǎn)染HEK293T 細胞，轉(zhuǎn)染前24 h 在500 μL 完全培養(yǎng)基重接種1×105個MCF-7 細胞，待細胞融合度達80%時進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染步驟分別取1 μg psiCHECKABCE1-3'UTR 質(zhì)粒和psiCHECK 空質(zhì)粒用50 μL 無血清培養(yǎng)基稀釋。取2 μL 脂質(zhì)體lipofectamne2000用50 μL 無血清培養(yǎng)基稀釋，輕輕混勻，室溫下靜置5 min。將含有質(zhì)粒的培養(yǎng)基和含有脂質(zhì)體的培養(yǎng)基混合在一起，室溫下靜置20 min。將上述混合物按100 μL/孔分別加到24 孔培養(yǎng)板中，輕輕混勻。將24 孔培養(yǎng)板在CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，轉(zhuǎn)染24 h 后收集細胞采用熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0 軟件進行分析，t檢驗用于兩個樣本間的比較，方差分析用于多個樣本均數(shù)差別的顯著性檢驗。P＜0.05 認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 乳腺癌組織中ABCE1 蛋白及mRNA 的表達

為了確定ABCE1 與乳腺癌的相關(guān)性，我們檢測乳腺癌組織和癌旁組織中ABCE1 蛋白及mRNA 的表達情況。結(jié)果顯示，10 例乳腺癌組織樣本中ABCE1 蛋白含量明顯高于其癌旁組織（P＜0.05），但mRNA 的表達水平在乳腺癌組織和癌旁組織間并無明顯差異（見圖1，2）。

圖1 乳腺癌組織和癌旁組織中ABCE1 蛋白的表達情況Fig 1 Expression of ABCE1 protein in the breast cancer and adjacent tissues

圖2 乳腺癌組織和癌旁組織中ABCE1 mRNA 的表達情況Fig 2 Expression of ABCE1 mRNA in the breast cancer and adjacent tissues

3.2 生物信息學(xué)分析miR-145 對ABCE1 mRNA的靶向作用

乳腺癌組織中ABCE1 蛋白含量明顯增加，但其mRNA 水平并未明顯改變，提示在乳腺癌組織中可能存在對ABCE1 的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)機制。筆者將ABCE1 mRNA 序列輸入miR Base、miR anda、TargetScan 和PicTar 等miRNA 靶標預(yù)測網(wǎng)站，以預(yù)測靶向調(diào)節(jié)ABCE1 的miRNA，得到miR-135、miR-29、miR-145 等多個目標miRNA。同樣，檢索疾病數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中miR-145 表達是明顯降低的，并且TAM 疾病數(shù)據(jù)庫也顯示miR-145 與乳腺腫瘤和細胞增殖能力密切相關(guān)（見圖3）。進一步分析miR-145 對ABCE1 mRNA 的3'-UTR 序列能較好吻合，且兩者結(jié)合自由能較低，提示具有較高親和力（見圖4）。因此，上述相關(guān)查詢結(jié)果提示miR-145 對ABCE1 的調(diào)控機制可能參與乳腺癌發(fā)生發(fā)展。

圖3 TAM 數(shù)據(jù)庫顯示miR-145 與乳腺腫瘤和細胞增殖具有明確的相關(guān)性Fig 3 TAM database shows that miR-145 is clearly associated with breast tumors and cell proliferation

圖4 ABCE1 mRNA 與miR-145 結(jié)合的自由能Fig 4 Free energy of ABCE1 mRNA binding with miR-145

3.3 miR-145 與ABCE1 的結(jié)合能力

為了驗證ABCE1基因的3'UTR 是否是miR-145 的靶序列，我們將ABCE1基因的3'UTR 片段克隆到熒光素酶報告基因載體psiCHECK 中，構(gòu)建miR-reporter 載體psiCHECK-ABCE1-3'UTR，將熒光素酶報告載體psiCHECK-ABCE1-3'UTR 分別和miR-145 mimic（miR-145 高表達組）、miR-NC（對照組）共轉(zhuǎn)染HEK 293T 細胞，48 h 后檢測熒光素酶活性。結(jié)果表明，共轉(zhuǎn)染miR-145 mimic 和psiCHECK-ABCE1-3'UTR 后，熒光素酶活性受到明顯抑制（見圖5）。說明ABCE1是miR-145 的靶基因。

圖5 熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測miR-145 與ABCE1 的結(jié)合能力Fig 5 Binding ability of miR-145 with ABCE1 by luciferase reporter gene assay

3.4 miR-145 對ABCE1 的調(diào)節(jié)在乳腺癌細胞凋亡中的作用

為明確miR-145 對ABCE1 的靶向調(diào)節(jié)作用對乳腺癌細胞凋亡的影響，我們檢測了乳腺癌組織和癌旁組織中的miR-145 的表達情況。結(jié)果顯示，乳腺癌組織中miR-145 表達水平顯著降低（見圖6）。然后，在乳腺癌細胞MCF-7 中通過外源轉(zhuǎn)染miR-145 mimic 和miR-145 inhibitor 分別上調(diào)或下調(diào)細胞內(nèi)miR-145 水平。結(jié)果表明，與miR-145 抑制組相比，miR-145 高表達組能夠顯著抑制ABCE1 蛋白表達（見圖7）。此外，MTT 實驗結(jié)果表明轉(zhuǎn)染miR-145 的MCF-7 細胞存活率顯著低于miR-145 抑制組細胞（見圖8）。

圖6 乳腺癌組織與癌旁組織中miR-145 的表達差異Fig 6 Expression differences of miR-145 in the breast cancer tissues and adjacent tissues

圖7 miR-145 對乳腺癌細胞MCF-7 中ABCE1 蛋白表達的影響（n ＝3）Fig 7 Effect of miR-145 on the expression of ABCE1 in MCF-7 cells（n ＝3）

圖8 miR-145 對MCF-7 細胞增殖能力的影響（n ＝3）Fig 8 Effect of miR-145 on the proliferation of MCF-7 cells（n ＝3）

4 討論

臨床上乳腺癌的治療主要通過手術(shù)、放化療等[13]，但不可避免地給患者帶來了極大傷害，且后續(xù)治療對身心均有不利影響，因此深入研究乳腺癌的發(fā)病機制，從中尋找可供應(yīng)用的治療靶點將有益于臨床治療。

腫瘤細胞的代謝過程如轉(zhuǎn)錄、翻譯都異常亢進，RNase L 能通過切割RNA 抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)錄，被認為是腫瘤治療的重要分子靶點。ABCE1在多種腫瘤組織中高表達，是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵基因，其編碼的ABCE1 蛋白是一種RNase L 抑制因子，通過抑制RNase L 發(fā)揮促腫瘤細胞增殖的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中ABCE1 蛋白含量明顯高于癌旁組織，提示其與乳腺癌的發(fā)生密切相關(guān)。然而，ABCE1 mRNA 的表達水平在兩組間并無明顯差異，說明在乳腺癌組織中存在著對ABCE1 的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)機制。我們通過多種miRNA 靶標預(yù)測軟件發(fā)現(xiàn)ABCE1 的3'-UTR 含有多個miR-145 互補的序列，提示miRNA-145 與ABCE1 之間可能存在調(diào)控關(guān)系。應(yīng)用miRNA 靶標預(yù)測顯示miR-145 與ABCE1 mRNA 的3'-UTR序列能較好吻合，提示miR-145 與ABCE1 mRNA的結(jié)合特異性較高。采用RNAhybrid 和PicTar 在線網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)miR-145 與ABCE1 mRNA 結(jié)合自由能較低，提示兩者具有較高的親和力。這些均說明miR-145 對ABCE1 靶向抑制是一種普遍存在的生理性調(diào)節(jié)。我們通過在乳腺癌細胞MCF-7 中外源轉(zhuǎn)染miR-145 mimic 和miR-145 inhibitor 分別上調(diào)或下調(diào)細胞內(nèi)miR-145 水平，證實了miR-145 mimic 能抑制MCF-7 細胞中ABCE1 的表達，同時促進細胞凋亡。此外，熒光素酶報告基因?qū)嶒炓诧@示miR-145 與ABCE1 mRNA 具有結(jié)合能力，這些結(jié)果進一步證實miR-145 對ABCE1 蛋白表達存在靶向調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，本研究篩選出乳腺癌組織內(nèi)能夠有效靶向ABCE1 mRNA 的miR-145。通過外源性增加miR-145 能夠抑制ABCE1 的表達，進而取消ABCE1 對2-5A/RNase L 信號的阻滯，有利于RNase L 促進乳腺癌細胞的凋亡。因此，miR-145 及其調(diào)節(jié)的ABCE1基因可能作為新的突破口，為乳腺癌的診治提供新的作用靶點。