楊東亮，馬瑞麗，趙宇郁，滕亮，馬桂芝*，高曉黎（. 新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，烏魯木齊80054；. 新疆醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，烏魯木齊 800；. 慶陽(yáng)市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，甘肅 慶陽(yáng) 745099）

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是結(jié)直腸的一種慢性免疫介導(dǎo)的炎癥性疾病[1]，病因尚不明確，且暫無(wú)法治愈，如果不及時(shí)治療，可導(dǎo)致黏膜損傷及結(jié)直腸癌等致命并發(fā)癥[2]。在全球范圍內(nèi)，UC 的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[3]，近二十余年來(lái)，我國(guó)UC的就診人數(shù)快速增長(zhǎng)[4]。UC 一般均以連續(xù)性分布的方式，從直腸向近端結(jié)腸擴(kuò)展，在中國(guó)病變的主要部位為直腸、直-乙狀結(jié)腸、左側(cè)結(jié)腸。糖皮質(zhì)激素是活動(dòng)期UC 誘導(dǎo)緩解治療的重要藥物，臨床常口服或靜脈給予糖皮質(zhì)激素，但全身用藥易出現(xiàn)藥物不良反應(yīng)并存在諸多限制，且局部藥物濃度低[5]。布地奈德（budesonide，Bud）是第二代皮質(zhì)類(lèi)固醇類(lèi)激素，具有局部抗炎作用強(qiáng)，全身不良反應(yīng)少的優(yōu)點(diǎn)，可有效緩解輕中度UC 患者的癥狀[6]。

目前，臨床常使用吸入用Bud 混懸劑灌腸[7]，但混懸劑幾乎沒(méi)有生物黏附性，在腸道保留時(shí)間短，且?guī)缀醪蝗苡谒?、局部吸收差，影響療效。故本研究利用脂質(zhì)體的特性增加藥物溶解度、提高黏膜滯留性能、升高靶部位濃度、減少藥物入血[8]；同時(shí)，利用溫敏凝膠常溫下為液態(tài)、體溫下為凝膠的特點(diǎn)，促進(jìn)藥物的均勻分布、提高局部黏附性能，以對(duì)抗腸道的自蠕動(dòng)[9-10]。本研究將Bud 制備成脂質(zhì)體后再進(jìn)一步制成脂質(zhì)體溫敏凝膠，使其兼顧脂質(zhì)體和溫敏凝膠的優(yōu)勢(shì)：給藥前為液體狀態(tài)，到達(dá)給藥部位后均勻分布，后迅速相變?yōu)槟z黏附于腸黏膜，進(jìn)一步通過(guò)脂質(zhì)體實(shí)現(xiàn)靶向作用，提高療效，降低不良反應(yīng)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AD 高效液相色譜儀（日本島津公司）；New Classic MS 分析天平（梅特勒-托利多公司，d ＝0.01 mg）；KQ5200DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Zetasizer Nano ZS 納米激光粒徑測(cè)定儀（英國(guó)馬爾文儀器有限公司）；PS-1000 磁力攪拌器（東京理化器械株式會(huì)社）；3-18KS 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（SIGMA公司）；VCX500 超聲波細(xì)胞破碎儀（Sonics &Materials Inc）；TP-6 智能透皮試驗(yàn)儀（天津市鑫洲科技有限公司）；PHSJ-3F 雷磁pH 計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器有限公司）；NDJ-5S 數(shù)字式黏度計(jì)（上海菁海儀器有限公司）；Milli-Q 艾柯超純水儀（美國(guó)密理博公司）。

1.2 試藥

Bud 對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：Y13J7C9082，純度≥ 98%）；Bud 原料藥（山東泰華生物科技有限公司，批號(hào)：20190906，純度≥ 99%）；大豆磷脂（批號(hào)：SYSO-200401）、膽固醇（批號(hào)：B80859）（上海艾偉拓醫(yī)藥科技有限公司）；泊洛沙姆407、泊洛沙姆188（北京索萊寶科技有限公司）；羥丙基甲基纖維素（上海麥克林生化科技有限公司）；醋酸纖維素膜（孔徑：0.45 μm，尺寸：50 mm）（上海市新亞凈化器件廠）；甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 Bud 的含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Agilent SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇-水（72∶28）為流動(dòng)相等度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm，進(jìn)樣量10μL，流速1 mL·min-1，柱溫25℃。

2.1.2 溶液的配制 取Bud 對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，置25 mL 量瓶中，加甲醇超聲溶解并定容，即得質(zhì)量濃度為196.4 μg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密移取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用甲醇依次稀釋為0.38、0.77、1.53、3.07、6.14、12.28、24.55、49.1、98.2 μg·mL-1的系列對(duì)照品溶液。

分別取Bud 對(duì)照品溶液、Bud 脂質(zhì)體、Bud脂質(zhì)體溫敏凝膠1.0 mL，甲醇定容，超聲，以0.22 μm 微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

制備不含Bud 的空白脂質(zhì)體、空白脂質(zhì)體溫敏凝膠，各取1.0 mL，甲醇定容，超聲，以0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得陰性樣品溶液。

2.1.3 專(zhuān)屬性考察 取Bud 對(duì)照品、供試品及陰性樣品溶液各10 μL，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖1，基質(zhì)對(duì)Bud 測(cè)定無(wú)干擾[11]。

圖1 Bud 脂質(zhì)體及Bud 脂質(zhì)體溫敏凝膠的HPLC 圖Fig 1 HPLC chromatogram of Bud liposomes and Bud liposome temperature sensitive gel

2.1.4 線性關(guān)系考察 測(cè)定系列對(duì)照品溶液，以峰面積（Y）對(duì)Bud 質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y＝1.59×104X+1.993×103（r＝0.9999）。結(jié)果表明，Bud 在0.38 ～98.2 μg·mL-1與峰面積線性關(guān)系良好。

2.1.5 方法學(xué)考察 取供試品溶液連續(xù)測(cè)定6 次，測(cè)得精密度RSD為0.30%。于常溫下供試品分別放置0、2、4、6、8、10、12 h，測(cè)得穩(wěn)定性RSD為1.1%。平行制備6 份供試品溶液，測(cè)得重復(fù)性RSD為1.7%。精密量取已知濃度樣品9 份，加低、中、高濃度對(duì)照品溶液，測(cè)得平均加樣回收率在98.7%～100.2%，RSD均＜2.0%。

2.2 Bud 脂質(zhì)體的制備

2.2.1 制備工藝優(yōu)選指標(biāo) 以包封率、載藥量和粒徑作為考察指標(biāo)，綜合分析。結(jié)合層次分析法確定的權(quán)重系數(shù)，得到綜合評(píng)分Y＝包封率/包封率最大值×0.7306+載藥量/載藥量最大值×0.1884+粒徑最小值/粒徑×0.0810[11]。

2.2.2 Bud 脂質(zhì)體的制備工藝 根據(jù)Bud 性質(zhì)，采用逆向蒸發(fā)法制備Bud 脂質(zhì)體。精密稱(chēng)取Bud原料藥、膽固醇和大豆磷脂適量于250 mL 圓底燒瓶中，加入20 mL 氯仿超聲使其溶解，再按有機(jī)相與水相的體積比加入超純水，水浴超聲10 min形成穩(wěn)定的W/O型乳液，40℃下減壓蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，加入超純水，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，于冰浴條件下超聲，即得Bud 脂質(zhì)體，于3 ～5℃保存[12]。

2.2.3 Bud 脂質(zhì)體制備工藝單因素的考察 測(cè)定各脂質(zhì)體包封率、載藥量和粒徑，以綜合評(píng)分Y為指標(biāo)，按“2.2.2”項(xiàng)下方法考察膜材比（3∶1、6∶1、9∶1、12∶1 和15∶1）、脂藥比（2∶1、6∶1、10∶1、14∶1 和18∶1）、有機(jī)相與水相比例（V有機(jī)/V水相為2∶1、3∶1、4∶1、5∶1 和6∶1）、乳化時(shí)間（6、8、10、12 和14 min）、孵育溫度（20、30、40、50 和60℃）、分散時(shí)間（10、15、20、25和30 s）等因素對(duì)Bud 脂質(zhì)體綜合指標(biāo)的影響。結(jié)果，在膜材比為9∶1、脂藥比為6∶1、V有機(jī)/V水相為4∶1、乳化時(shí)間12 min、孵育溫度50 ℃、分散時(shí)間15 s 時(shí)，所制脂質(zhì)體包封率較高。

2.2.4 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化制備工藝 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取脂藥比和V有機(jī)/V水相兩個(gè)對(duì)指標(biāo)影響較大的因素，設(shè)計(jì)二因素三水平的星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化Bud 脂質(zhì)體制備工藝。因素水平見(jiàn)表1，以綜合評(píng)分Y為考察指標(biāo)，按照星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)見(jiàn)表2、圖2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 方差分析Tab 3 Analysis of variance

圖2 Bud 脂質(zhì)體制備工藝優(yōu)化的效應(yīng)面圖Fig 2 Response surface for optimization of preparation process of budesonide liposomes

表1 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法的因素水平表Tab 1 Factor and level of central composite design-response surface method

采用Design-Expert 10.0.7 軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到綜合評(píng)分Y的回歸方程為Y＝0.8897 - 0.0854A+ 0.0527B- 5.9275AB-0.0874A2-0.0902B2，模型P＜0.01，與數(shù)據(jù)的擬合度好，誤差低，可用于進(jìn)一步分析與檢測(cè)。通過(guò)Design-Expert 10.0.7 軟件對(duì)優(yōu)選的制備工藝條件進(jìn)行預(yù)測(cè)，A＝4.5∶1，B＝4.0∶1，Y的預(yù)測(cè)值為0.92。應(yīng)用Design-Expert 10.0.7 軟件對(duì)優(yōu)選的制備工藝條件進(jìn)行預(yù)測(cè)，A＝4.5∶1，B＝4.0∶1，Y的預(yù)測(cè)值為0.92。結(jié)合實(shí)際操作條件，初步確定優(yōu)選工藝參數(shù)為：脂藥比4.5∶1，V有機(jī)/V水相＝4.0∶1，按照優(yōu)選參數(shù)，采用逆向蒸發(fā)法制備3 批Bud 脂質(zhì)體。結(jié)果表明，3 批樣本的包封率為（82.15±0.34）%、載藥量為（12.71±0.34）%、粒徑為（273.8±3.4）nm、Y為（0.95±0.01），說(shuō)明工藝穩(wěn)定可行，重現(xiàn)性好。

表2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法的結(jié)果Tab 2 Central composite design-response surface method

2.3 Bud 脂質(zhì)體溫敏凝膠的制備

采用冷溶法制備Bud 脂質(zhì)體溫敏凝膠。精密稱(chēng)取泊洛沙姆407（P407）、泊洛沙姆188（P188）和羥丙基甲基纖維素（HPMC）適量，在磁力攪拌下緩慢加入到一定量的脂質(zhì)體中，攪拌均勻后，于4 ℃下靜置溶脹24 h，即得。

2.4 Bud 脂質(zhì)體溫敏凝膠工藝優(yōu)選指標(biāo)

2.4.1 膠凝溫度 采用試管倒置法[13]測(cè)定膠凝溫度。試管中加2 mL 凝膠溶液，插入溫度計(jì)，置恒溫水浴鍋中，從25 ℃開(kāi)始緩慢升溫，每隔0.2 ℃將試管傾斜180°以觀察溶液的流動(dòng)情況。溶液不流動(dòng)時(shí)的最低溫度即為膠凝溫度，重復(fù)3次取平均值。

2.4.2 累積釋放度的測(cè)定 采用Franz 擴(kuò)散池對(duì)藥物的累積釋放度進(jìn)行測(cè)定[14]。供給池和接收池間以半透膜隔離。向接收池中加入恒溫至37.5℃的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）釋放介質(zhì)，將Franz 擴(kuò)散池置于37.5℃恒溫水浴磁力攪拌器中。取Bud 脂質(zhì)體溫敏凝膠1.0 mL，加入到供給池中，放置10 min，待凝膠膠凝后開(kāi)始攪拌。分別于0.5、1、2、4、6、8、10、12 h 各取樣0.4 mL，同時(shí)補(bǔ)充恒溫介質(zhì)0.4 mL。按“2.1.1”項(xiàng)下方法測(cè)定Bud含量。

2.4.3 評(píng)價(jià)指標(biāo)——綜合評(píng)分法 以膠凝溫度（Y1）和累積釋放度（Y2）的綜合評(píng)分（Y）為評(píng)價(jià)指標(biāo)[15]，其中：

Y1＝膠凝溫度/32 ℃，Y1評(píng)分實(shí)行分段評(píng)分，即：當(dāng)Y1≥1時(shí)，Y1評(píng)分＝1/Y1×80；當(dāng)Y1＜1 時(shí)，Y1評(píng)分＝Y(jié)1×80；

Y2＝∣Q2h-20%∣+∣Q6h-50%∣+∣Q12h-80%∣，Y2評(píng)分＝Y(jié)2min/Y2×20；

Y＝Y(jié)1評(píng)分+Y2評(píng)分。Y值越大指標(biāo)越好。其中，Q2h、Q6h、Q8h分別為2 h、6 h、8 h 后的累積釋放度；Y2min為Y2最小值。

2.5 單因素對(duì)處方用量的考察

2.5.1 P407 用量的考察 固定處方中其他用量，分別加入14%、16%、18%、20%、22%、24%的P407 制備Bud 脂質(zhì)體溫敏凝膠，測(cè)定膠凝溫度分別為38.8、36.2、33.5、31.0、30.0、29.0℃。表明隨著P407 用量的增加，膠凝溫度逐漸降低，當(dāng)P407 的用量小于16%時(shí)，溫敏凝膠在37℃仍未發(fā)生膠凝。

2.5.2 P188 用量的考察 固定處方中其他用量，分別加入1%、2%、3%、4%、5%、6%的P188制備Bud 脂質(zhì)體溫敏凝膠，測(cè)定膠凝溫度分別為28.9、30.8、33.5、35.5、37.2、39.0℃。表明隨著P188 用量的增加，膠凝溫度逐漸增大，當(dāng)P188 的用量大于5%時(shí)，溫敏凝膠在37.5℃仍未發(fā)生膠凝。

2.5.3 HPMC 用量的考察 固定處方中其他用量，分別加入0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%的HPMC 制備Bud 脂質(zhì)體溫敏凝膠，測(cè)定膠凝溫度分別為34.3、34.0、33.8、33.6、33.5℃。表明隨著HPMC 用量的增加，膠凝溫度逐漸減小，但減小的趨勢(shì)不顯著。

2.6 正交試驗(yàn)優(yōu)選溫敏凝膠的處方組成

根據(jù)單因素試驗(yàn)，確定各因素的水平，以“2.4.3”項(xiàng)下Y為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行L16（45）正交試驗(yàn)，因素水平見(jiàn)表4，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5，方差分析見(jiàn)表6。

表4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平(%)Tab 4 Factor and level of orthogonal test (%)

由表5及表6中可知，處方中各因素對(duì)Bud脂質(zhì)體溫敏凝膠質(zhì)量的影響程度依次為AB ＞A ＞C ＞B，優(yōu)選水平組合為A3B3C1，即優(yōu)選處方為P407 用量20%、P188 用量4%、HPMC 用量0.4%。

表5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab 5 Orthogonal test

表6 方差分析Tab 6 Variance analysis

2.7 最佳工藝的驗(yàn)證

按優(yōu)化的最佳工藝條件平行制備3 批樣品，平均膠凝溫度為（33.1±0.1）℃；平均體外累積釋放度Q2h（13.6±0.2）%、Q6h（41.6±0.4）%、Q12h（72.6±1.1）%；平均綜合評(píng)分（90.12±0.43）；分別用超純水將3 批樣本稀釋10 倍，置于NDJ-5S數(shù)字式粘度計(jì)樣品池中，通過(guò)Zetasizer Nano ZS納米激光粒徑測(cè)定儀對(duì)其粒徑和Zeta 電位進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣平行測(cè)3 次。分別用超純水將3 批樣本稀釋10 倍，置于NDJ-5S 數(shù)字式粘度計(jì)樣品池中，通過(guò)Zetasizer Nano ZS 納米激光粒徑測(cè)定儀對(duì)其粒徑和Zeta 電位進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣平行測(cè)3次。平均粒徑為（285.2±6.7）nm，平均Zeta 電位為-（45.8±5.3）mV，分布見(jiàn)圖3。制備的脂質(zhì)體的平均粒經(jīng)和平均Zeta 電位分別為（273.8±3.4）nm 和-（31.9±2.16）mV，可知制成脂質(zhì)體溫敏凝膠后粒徑和Zeta 電位絕對(duì)值有增大的趨勢(shì)，但影響不明顯。經(jīng)驗(yàn)證該Bud 脂質(zhì)體溫敏凝膠在體溫條件下能迅速膠凝，且累積釋藥性能良好。

圖3 Bud 脂質(zhì)體溫敏凝膠的粒徑（A）和 Zeta 電位分布（B）Fig 3 Particle size（A）and Zeta potential distribution（B）of Bud liposome temperature sensitive gel

2.8 穩(wěn)定性初步考察

按最佳處方工藝制備Bud 脂質(zhì)體溫敏凝膠，置密閉西林瓶中，于4℃冰箱避光保存，分別于第0、15、30、45、60日取樣，觀察外觀性狀，測(cè)定膠凝溫度及藥物含量。結(jié)果表明在考察的時(shí)間范圍內(nèi)，Bud 脂質(zhì)體溫敏凝膠外觀、膠凝溫度、含量、粒徑和Zeta 電位無(wú)明顯變化，可滿足后續(xù)藥效學(xué)和藥動(dòng)學(xué)的研究要求。

3 討論

Bud 為親脂性藥物，幾乎不溶于水，難以有效分散于水溶性凝膠中，故將其包裹于脂質(zhì)體，以有效分散于溫敏凝膠中，從而發(fā)揮緩釋、局部靶向作用[16]。Bud 脂質(zhì)體溫敏凝膠，在常溫下為自由流動(dòng)的液體，在灌腸后可快速均勻分布于降結(jié)腸、乙狀結(jié)腸、直腸，后在體溫調(diào)節(jié)下迅速膠凝，黏度升高以對(duì)抗腸道自蠕動(dòng)。另外，脂質(zhì)體還可提高局部黏膜的滯留量，減少全身作用[8]。包封率、載藥量、粒徑、分散指數(shù)、電位等均為評(píng)價(jià)脂質(zhì)體制備工藝的指標(biāo)，一方面指標(biāo)過(guò)多容易導(dǎo)致試驗(yàn)難度增加；另一方面，預(yù)試驗(yàn)中各考察因素對(duì)分散指數(shù)和電位并無(wú)顯著影響，故選擇包封率、載藥量和粒徑為指標(biāo)，采用加權(quán)后綜合評(píng)分進(jìn)行全面評(píng)價(jià)，不僅能全面反映各檢測(cè)指標(biāo)對(duì)脂質(zhì)體的重要程度，也能直觀反映整體制備工藝[11]。

膠凝溫度是溫敏凝膠的一個(gè)重要指標(biāo)，溫敏凝膠灌腸后，若在病灶部位短時(shí)間內(nèi)不能相變，會(huì)因腸道自蠕動(dòng)作用而漏出，且凝膠所載藥物會(huì)發(fā)生突釋?zhuān)档椭苿┑木忈屪饔茫虼诉x擇膠凝溫度在30 ～34℃為宜[16]。為保證該直腸給藥系統(tǒng)在室溫下為液態(tài)，便于給藥和分布，進(jìn)入直腸后迅速的膠凝，本研究以32℃為膠凝溫度的參考溫度[17]。然而，制劑質(zhì)量的好壞不只取決于膠凝溫度，還與合適溫度下藥物能否充分釋放有關(guān)。故本研究在單因素篩選出各基質(zhì)的合理范圍后，繼以膠凝溫度和累積釋放度的綜合評(píng)分為指標(biāo)，使優(yōu)選出的Bud 脂質(zhì)體溫敏凝膠在生理溫度下迅速膠凝，發(fā)揮良好的釋藥作用。

在篩選處方時(shí)，P407 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響最為顯著，這與P407 在處方中的作用與貢獻(xiàn)是一致的。泊洛沙姆分子是排列整齊的Z 字形結(jié)構(gòu)。當(dāng)溫度升高時(shí)，Z 字形結(jié)構(gòu)可能轉(zhuǎn)變?yōu)槔p繞緊密的折疊結(jié)構(gòu)，而且纏繞越來(lái)越緊密，形成更黏稠的凝膠[18]。P407 是由聚氧乙烯（PEO）、聚氧丙烯（PPO）組成的PEO-PPO-PEO 非離子型三嵌段共聚物，其中PEO 與PPO 的質(zhì)量比為7∶3。加入P188 后，相對(duì)增加了PEO 的比例而降低了PPO的比例，升高了體系的膠凝溫度。但P188 的用量過(guò)大時(shí)，本身已膠束化的P188 分子亦可參與凝膠構(gòu)成，又導(dǎo)致體系膠凝溫度降低。因此要調(diào)節(jié)P407 的膠凝溫度需選擇P188 合適的用量[19]。本研究還發(fā)現(xiàn)P407 與P188 存在較為顯著的交互作用，其對(duì)指標(biāo)的影響甚至大于P407 與P188 各自的影響。

雖然本研究對(duì)該直腸定向給藥制劑進(jìn)行了初步研究，但對(duì)于其生物有效性、安全性尚待進(jìn)一步研究，以期為UC 患者提供可靠的藥物制劑。