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        重樓皂苷H誘導(dǎo)耐替莫唑胺膠質(zhì)瘤SHG44R細(xì)胞凋亡和焦亡的作用研究

        2022-08-08 02:59:06孫光強(qiáng)薛玉葉陸云陽(yáng)杜洋王媛媛方菲紀(jì)玉強(qiáng)程光湯海峰邱鵬程
        中南藥學(xué) 2022年5期
        關(guān)鍵詞:焦亡重樓皂苷

        孫光強(qiáng),薛玉葉,陸云陽(yáng),杜洋,王媛媛,方菲,紀(jì)玉強(qiáng),程光,湯海峰,*,邱鵬程*

        (1. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,陜西 咸陽(yáng) 712046;2. 空軍特色醫(yī)學(xué)中心藥劑科,北京 100142;3. 空軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系中藥與天然藥物學(xué)教研室,西安 710032;4. 西安市第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室,西安 710002;5. 空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)外科,西安 710032)

        膠質(zhì)瘤是中樞性惡性腫瘤的一種,目前臨床上主要采用手術(shù)聯(lián)合放化療治療,但患者對(duì)其一線化療藥物替莫唑胺的耐藥問(wèn)題不容忽視[1]。同時(shí),膠質(zhì)瘤具有四高一低的發(fā)病特點(diǎn),即高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率、高死亡率、高致殘率和低治愈率[2]。因此,尋找一種新型的膠質(zhì)瘤的化療藥物具有十分重要的意義。

        細(xì)胞焦亡(pyroptosis)是一種細(xì)胞炎性程序性死亡方式,主要通過(guò)炎癥小體介導(dǎo)包含caspase-1 在內(nèi)的多種caspase 蛋白的激活,造成包括GSDMD 在內(nèi)的多種Gasdermin 家族成員發(fā)生剪切和多聚化,造成細(xì)胞穿孔,進(jìn)而引起細(xì)胞死亡[3-4]。相比于凋亡(apoptosis),焦亡發(fā)生更快,并伴隨著大量促炎癥因子的釋放[5]。大量的證據(jù)表明細(xì)胞焦亡能夠影響腫瘤的發(fā)展,可作為潛在的腫瘤治療策略,為患者開(kāi)發(fā)基于焦亡的新藥提供思路[6]。

        重樓皂苷H(結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1,paris saponin H,PSH)屬于偏諾皂苷元型甾體皂苷,在百合科重樓屬多種植物中大量存在,本課題組先后從川產(chǎn)南重樓和陜產(chǎn)具柄重樓、狹葉重樓、云南重樓中分離鑒定了該化合物。據(jù)報(bào)道,PSH 具有抗腫瘤、抗炎、抗凝等作用[7-8]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)PSH 通過(guò)A1 和A3 腺苷受體途徑,抑制膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞增殖[9],但其對(duì)耐替莫唑胺膠質(zhì)瘤的作用機(jī)制研究尚無(wú)報(bào)道,尤其未見(jiàn)其誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡的報(bào)道。故本研究基于細(xì)胞凋亡和焦亡對(duì)PSH 抗耐藥膠質(zhì)瘤機(jī)制進(jìn)行初步探討。

        圖1 重樓皂苷H 的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig 1 Chemical structure of paris saponin H

        1 材料

        1.1 細(xì)胞來(lái)源

        耐替莫唑胺膠質(zhì)瘤SHG44R 細(xì)胞株由本課題組前期研究建立成功[10]。

        1.2 儀器

        超凈工作臺(tái)(Thermo Fisher),CO2恒溫培養(yǎng)箱(ESCO 公司),倒置顯微鏡(Olympus),血球計(jì)數(shù)板(上海市求精生化試劑儀器有限公司),Multiskan FC 酶標(biāo)儀(賽默飛公司),流式細(xì)胞儀(BD FACSCalibur),透射電子顯微鏡(JEOL,JEM-1400),電泳系統(tǒng)(Bio-Rad),凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad), 熒光定量PCR 儀(BIONEER,Exicycler 96), 紫外分光光度計(jì)(Thermo,NANO 2000),真空干燥箱(SYSBERY 公司),微量移液器(BIOHIT 公司,Proline),超純水系統(tǒng)(Heal 公司,NW10LVF),超速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀公司)。

        1.3 試藥

        重樓皂苷H(寶雞翊瑞生物科技有限公司,純度:99.45%,批號(hào):JOT-11279),CCK-8 試劑盒(Elabscience,批號(hào):E-CK-A362),Annexin V-FITC/PI 雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(BD,批號(hào):556547),DMEM 培養(yǎng)基(Gibco,批號(hào):11965092),胎牛血清(Biological Industries,批號(hào):04-121-1A),胰蛋白酶(Solarbio,批號(hào):T1300),青鏈霉素混合液(Solarbio,批號(hào):P1400),Cleaved-caspase-1 抗體(Cell Signaling Technology,批號(hào):4199T)、N-GSDMD 抗體(abcam,批號(hào):ab215203)、Cleavedcaspase-3 抗體(批號(hào):19677-1-AP)、Bax 抗體(批號(hào):50599-2-AP)、Bcl-2 抗體(批號(hào):12789-1-AP)、IL-1β抗體(批號(hào):16806-1-AP)、IL-18 抗體(批號(hào):10663-1-AP)、NLRP3 抗體(批號(hào):19771-1-AP)、β-actin 抗體(批號(hào):20536-1-AP)(Proteintech),TRIpure(BioTeke,批號(hào):RP1001),BeyoRT II M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶(碧云天,批號(hào):D7160L),RNase inhibitor(BioTeke,批號(hào):RP5602),2×Taq PCR MasterMix(Solarbio,批號(hào):PC1150),SYBR Green(Solarbio,批號(hào):SY1020),其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純,引物由金斯瑞生物科技有限公司合成。

        2 方法

        2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

        將SHG44R 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清,1%青鏈霉素混合液的DMEM 高糖培養(yǎng)基中,置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且狀態(tài)良好的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

        2.2 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活力

        取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SHG44R 細(xì)胞接種于96 孔板中。待細(xì)胞貼壁后,加入不同濃度用DMSO 配制的PSH,培養(yǎng)不同時(shí)間后,棄上清液,每孔加入10 μL CCK-8 溶液,孵育2 h,用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)量各孔的吸光度(OD)值,計(jì)算細(xì)胞存活率。

        2.3 透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化

        取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SHG44R 細(xì)胞,PBS 洗滌,加入6 μg·mL-1的PSH,培養(yǎng)24 h 后收集細(xì)胞,用2%戊二醛溶液固定2 h,隨后PBS 洗滌2 次,每次10 min。然后在1% 四氧化鋨溶液中固定2 h。用乙醇梯度脫水后,將細(xì)胞包埋在環(huán)氧樹(shù)脂中并切成 50 ~60 nm 的切片。切片用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色。透射電子顯微鏡分析切割樣品。

        2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

        取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SHG44R 細(xì)胞,接種于6 孔板中,待細(xì)胞完全貼壁后,加入不同質(zhì)量濃度的PSH(6、12 μg·mL-1)處理24 h。收集細(xì)胞,按照Annexin V-FITC/PI 雙染色細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒進(jìn)行細(xì)胞凋亡雙染色,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

        2.5 Western blot 法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

        將細(xì)胞消化后接種于6 孔板中,待細(xì)胞貼壁后,加入不同質(zhì)量濃度的PSH(6、12 μg·mL-1)處理細(xì)胞24 h。收集細(xì)胞制備蛋白樣品,10%聚丙烯胺-SDS 凝膠電泳后轉(zhuǎn)至PVDF 膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,加入一抗4 ℃孵育過(guò)夜,PBST 洗3 次,加入二抗室溫孵育1 h,PBST 洗3 次。加入ECL 化學(xué)發(fā)光液后放入全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)中曝光。

        2.6 RT-qPCR 檢測(cè)焦亡相關(guān)mRNA 表達(dá)

        取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SHG44R 細(xì)胞,接種于6 孔板中,待細(xì)胞完全貼壁后,加入3 μg·mL-1的PSH 處理24 h。收集細(xì)胞,加入Trizol 試劑提取總RNA。反轉(zhuǎn)錄制備cDNA,除去培養(yǎng)基,PBS 洗1次,除去PBS,每組加入1 mL Trizol 后放置于冰面,輕搖使Trizol 試劑充分接觸5 min。RT-qPCR檢測(cè)PSH 給藥組(3 μg·mL-1)與對(duì)照組SHG44R細(xì)胞caspase-1、caspase-11、GSDMD、IL-1β、IL-18、NLRP3的mRNA 的表達(dá),采用2-△△CT法計(jì)算mRNA 相對(duì)表達(dá)量。

        caspase-1:Forward,ATTACAGACAAGGGTGCT;Reverse,CTTTCGGAATAACGGAGT;

        caspase-11:Forward,GCACAATGGGCTCTATCT;Reverse,CAGTCGTTCTATGGTGGG;

        GSDMD:Forward,GGTTAGGAAGCCCTCAAGC;Reverse,CATGGCATCGTAGAAGTGG;

        IL-1β:Forward,TATTACAGTGGCAATGAGG;Reverse,ATGAAGGGAAAGAAGGTG;

        IL-18:Forward,ATAGCCAGCCTAGAGGTA;Reverse,ATCAGGAGGATTCATTTC;

        NLRP3:Forward,CCCCGTGAGTCCCATTA;Reverse,GACGCCCAGTCCAACAT;

        β-actin:Forward,GGCACCCAGCACAATGAA;Reverse,TAGAAGCATTTGCGGTGG。

        2.7 統(tǒng)計(jì)分析

        所有統(tǒng)計(jì)分析均采用Graphpad prism 8 軟件完成,數(shù)據(jù)以±s表示,組間差異通過(guò)單因素方差分析檢驗(yàn)(One-way ANOVA),P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        3 結(jié)果

        3.1 PSH 對(duì)耐替莫唑胺膠質(zhì)瘤SHG44R 細(xì)胞活力的影響

        采用CCK-8 法檢測(cè)不同劑量PSH 處理24、48、72 h 對(duì)細(xì)胞存活率的影響,結(jié)果表明PSH抑制SHG44R 細(xì)胞增殖具有時(shí)間和劑量依賴性。PSH 在24 h 對(duì)SHG44R 的IC50=6.986 μg·mL-1,見(jiàn)圖2。

        圖2 PSH 對(duì)SHG44R 細(xì)胞活力的影響Fig 2 Effect of PSH on the cell viability of SHG44R cells

        3.2 PSH 對(duì)耐替莫唑胺膠質(zhì)瘤SHG44R 細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響

        如圖3所示,與正常組相比,PSH 組出現(xiàn)核染色質(zhì)固縮、核膜皺褶,細(xì)胞器集中,出現(xiàn)凋亡小體,表明PSH 可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外,細(xì)胞內(nèi)容物滲漏,細(xì)胞膜有輕微損傷,提示PSH 可能誘導(dǎo)耐替莫唑胺膠質(zhì)瘤細(xì)胞焦亡。

        圖3 PSH 對(duì)SHG44R 細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響Fig 3 Effect of PSH on the cell morphology of SHG44R cells

        3.3 PSH 誘導(dǎo)耐替莫唑胺膠質(zhì)瘤SHG44R 細(xì)胞凋亡

        為了進(jìn)一步證實(shí)PSH 介導(dǎo)耐替莫唑胺膠質(zhì)瘤SHG44R 細(xì)胞凋亡,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)給予PSH 后細(xì)胞凋亡率的變化。結(jié)果表明PSH 呈劑量依賴性地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(見(jiàn)圖4)。

        圖4 PSH 對(duì)SHG44R 細(xì)胞凋亡的影響(n =3)Fig 4 Effect of PSH on the cell apoptosis of SHG44R cells(n =3)

        3.4 PSH 對(duì)耐替莫唑胺膠質(zhì)瘤SHG44R 細(xì)胞凋亡的蛋白的影響

        采用Western blot 法檢測(cè)不同劑量PSH 處理后細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明,給予PSH 可使Bax、Cleaved-caspase-3 蛋白上調(diào),Bcl-2 蛋白下調(diào)(見(jiàn)圖5)。

        圖5 PSH 對(duì)SHG44R 細(xì)胞凋亡關(guān)鍵蛋白的影響Fig 5 Effect of PSH on the key proteins of cell apoptosis in SHG44R cells

        3.5 PSH 誘導(dǎo)耐替莫唑胺膠質(zhì)瘤SHG44R 細(xì)胞焦亡

        如圖6所示, 與正常組相比,PSH 組caspase-1、caspase-11、GSDMD、IL-1β、IL-18和NLRP3 的mRNA 表達(dá)量顯著增加。進(jìn)一步采用Western blot 法檢測(cè)不同劑量PSH 處理后細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明,給予PSH 使Cleaved-caspase-1、Cleaved-N-terminal-GSDMD、IL-1β、IL-18、NLRP3 蛋白上調(diào)(見(jiàn)圖7)。蛋白表達(dá)和基因水平結(jié)果一致,說(shuō)明PSH 可誘導(dǎo)耐替莫唑胺膠質(zhì)瘤SHG44R 細(xì)胞焦亡。

        圖6 PSH 對(duì)SHG44R 細(xì)胞焦亡GSDMD 通路相關(guān)mRNA 表達(dá)的影響(n =3)Fig 6 Effect of PSH on the expression of mRNA related to the GSDMD pathway of pyroptosis of SHG44R cells(n =3)

        圖7 PSH 對(duì)SHG44R 細(xì)胞焦亡GSDMD 通路相關(guān)蛋白的影響Fig 7 Effect of PSH on GSDMD pathway pyroptosis-related proteins in SHG44R cells

        4 討論

        耐藥是膠質(zhì)瘤臨床治療面臨的重要問(wèn)題。天然產(chǎn)物是抗腫瘤先導(dǎo)化合物的重要來(lái)源[11],從中藥中尋找具有抗耐藥膠質(zhì)瘤作用的活性成分具有重要意義。既往研究已報(bào)道重樓皂苷抗腫瘤的多種作用機(jī)制,主要包括抑制增殖、凋亡、影響遷移與侵襲、阻滯細(xì)胞周期、聯(lián)合一線化療藥物輔助治療、逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥、氧化應(yīng)激、改變腫瘤細(xì)胞膜通透性、抑制胞內(nèi)藥物外流,抑制血管增生、誘導(dǎo)自噬等[7-8,12]。但關(guān)于重樓皂苷對(duì)細(xì)胞焦亡等新型細(xì)胞死亡方式的影響的報(bào)道較少。本研究結(jié)果顯示,PSH 可抑制耐替莫唑胺膠質(zhì)瘤SHG44R 細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)SHG44R 細(xì)胞凋亡和焦亡。

        細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡,是多數(shù)重樓皂苷引起腫瘤細(xì)胞死亡的常見(jiàn)機(jī)制[13-14]。其中內(nèi)源性通路是由促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白調(diào)節(jié),如Bcl-2 蛋白家族蛋白[15-16],當(dāng) Bax/Bcl-2 比值發(fā)生變化,線粒體通透性增加,線粒體破裂,促凋亡蛋白細(xì)胞色素C 將從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì),激活下游caspase 家族[17-18]。caspase-8 和caspase-9 作為caspase 的啟動(dòng)子,最終激活下游凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3,通過(guò)裂解細(xì)胞底物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示,與正常組相比,重樓皂苷H 可顯著上調(diào)SHG44R 細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Cleavedcaspase-3、Bax 表達(dá)水平,顯著降低Bcl-2蛋白表達(dá)水平,表明重樓皂苷H 可誘導(dǎo)SHG44R 細(xì)胞凋亡。

        細(xì)胞焦亡在體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖和體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)中起著關(guān)鍵作用[19]。與其他細(xì)胞死亡方式相比,具有獨(dú)特的形態(tài)和機(jī)制[20-21]。Gasdermin 家族蛋白是細(xì)胞焦亡的關(guān)鍵效應(yīng)分子,其誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡的機(jī)制比較明確,同時(shí)也是其經(jīng)典途徑[22]。一方面,在外界的刺激下,細(xì)胞內(nèi)的模式識(shí)別受體(NLR)作為感受器,識(shí)別信號(hào),通過(guò)接頭蛋白ASC 與Pro-caspase-1 結(jié)合,形成多蛋白復(fù)合物,激活caspase-1,活化的caspase-1 一方面切割GSDMD,形成含有GSDM-NT 活性域的肽段,誘導(dǎo)細(xì)胞膜穿孔,細(xì)胞破裂,釋放內(nèi)容物,引起炎癥反應(yīng);另一方面,活化的caspase-1 對(duì)IL-1β和IL-18 前體進(jìn)行切割,形成有活性的IL-1β和IL-18,并釋放到胞外,募集炎癥細(xì)胞聚集,擴(kuò)大炎癥反應(yīng)其是由炎性小體組裝介導(dǎo)的,伴隨著GSDMD裂解及IL-1β和IL-18 的釋放[23]。本研究結(jié)果顯示,與正常組相比,PSH 可顯著上調(diào)SHG44R 細(xì)胞中caspase-1、caspase-11、GSDMD、IL-1β、IL-18、NLRP3 的mRNA 表達(dá)水平,同時(shí)上調(diào)Cleavedcaspase-1、Cleaved-N-terminal-GSDMD、IL-1β、IL-18 和NLRP3,表明重樓皂苷H 可誘導(dǎo)耐替莫唑胺膠質(zhì)瘤SHG44R 細(xì)胞焦亡。

        綜上所述,PSH 能夠抑制耐替莫唑胺膠質(zhì)瘤SHG44R 細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡與焦亡。

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