解瑩馨, 王一惟, 薛艷玲， 鄧 彪， 彭冠云*

1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院腎內(nèi)科， 上海 200011

2. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院泌尿外科， 上海 200011

3. 中國科學(xué)院上海高等研究院上海光源中心， 上海 201204

4. 中國科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所， 上海 201204

引 言

泌尿系結(jié)石是全球的泌尿系統(tǒng)常見病、 多發(fā)病， 據(jù)統(tǒng)計， 約11%男性和7%女性罹患腎結(jié)石[1-2]。 泌尿系統(tǒng)任何部位均可發(fā)生結(jié)石但常原發(fā)于腎。 我國腎結(jié)石患病率稍低于歐美洲國家， 男性約為10.3%， 女性約為6.6%[3]。 雖然腎結(jié)石的診斷及治療技術(shù)在過去的幾十年中已取得很大的進(jìn)步， 但其發(fā)病率和復(fù)發(fā)率仍高居不下， 且發(fā)病率有日漸上升的趨勢[3]。 結(jié)石可導(dǎo)致腎積水， 損傷腎功能， 甚至誘發(fā)出現(xiàn)危及生命的情況， 如嚴(yán)重的泌尿系感染和終末期腎病等[4-6]。 因此， 增加對于腎結(jié)石發(fā)病機(jī)制認(rèn)識以便開展針對性的治療方法是提高治療腎結(jié)石成功率的關(guān)鍵。

腎結(jié)石病因較復(fù)雜， 結(jié)石形成機(jī)制尚不清楚， 目前提出了各種各樣的有關(guān)腎結(jié)石病因的學(xué)說， 主要是從人體種族遺傳、 疾病、 代謝和飲食習(xí)慣等方面研究結(jié)石病因， 從而產(chǎn)生不同種類的結(jié)石， 再確定治療方案。 對結(jié)石本身的研究， 主要集中在結(jié)石的成分上。 腎結(jié)石主要以含鈣結(jié)石為主， 其中又以草酸鈣結(jié)石最多， 約占腎結(jié)石的(65.9%～90%)[7-8]。 然而， 若能直觀觀察到結(jié)石的內(nèi)部結(jié)構(gòu)， 并根據(jù)這些結(jié)構(gòu)特征推斷出結(jié)石的形成和成長軌跡， 無疑能對治療患者腎結(jié)石和預(yù)后起到重要作用。 因傳統(tǒng)的研究手段難以無損獲得結(jié)石的內(nèi)部結(jié)構(gòu)， 目前， 還不曾見到腎結(jié)石微觀結(jié)構(gòu)相關(guān)報道。 而高分辨率顯微CT特別是同步輻射X射線顯微CT的出現(xiàn)， 無疑能為這一研究提供最先進(jìn)的檢測手段[5-7]。

上海同步輻射光源作為第三代優(yōu)質(zhì)同步輻射光源， 具有高光子通量、 高準(zhǔn)直性、 高極化性、 高相干性及寬頻譜范圍等優(yōu)點(diǎn)， 其配合高分辨的X射線探測器可實(shí)現(xiàn)精確、 靈敏的組織結(jié)構(gòu)信息的快速、 無損檢測， 在保持標(biāo)本完整性的前提下， 清晰再現(xiàn)樣品內(nèi)部的三維顯微結(jié)構(gòu)， 從而克服了傳統(tǒng)的二維切片技術(shù)存在破壞組織結(jié)構(gòu)的完整性、 無法準(zhǔn)確獲得組織結(jié)構(gòu)的三維空間信息和基質(zhì)成份等局限性。 X射線成像及生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用光束線站(BL13W1)是上海光源首批運(yùn)行的七條線站之一。 該線站利用插入件扭擺器作為光源， 以雙晶單色器將白光轉(zhuǎn)為單色光， 主要開展單色X射線成像實(shí)驗(yàn)研究， 發(fā)展了多種X射線成像方法， 如吸收成像、 同軸相襯成像等， 從而克服了傳統(tǒng)的二維組織學(xué)切片染色技術(shù)存在破壞組織結(jié)構(gòu)的完整性、 無法準(zhǔn)確獲得組織結(jié)構(gòu)的三維空間信息和基質(zhì)成份等局限性， 為本研究提供了先進(jìn)可靠的技術(shù)手段[9-10]。

本研究以不同患者腎結(jié)石為探測目標(biāo)， 依托上海同步輻射光源， 通過利用同步輻射X射線顯微CT技術(shù)， 探測腎結(jié)石結(jié)構(gòu)， 為進(jìn)一步深入研究結(jié)石病因的形成與生長機(jī)制以及腎結(jié)石的科學(xué)防治提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料

收集草酸鈣腎病患者的結(jié)石32例， 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院提供。

1.2 方法

在上海光源BL13W1光束線站進(jìn)行顯微CT掃描。 BL13W1為Wiggler光源， 最大束斑尺寸為45 mm(H)×5 mm(V) @30 m@20 keV， 光子通量密度為6×10 phs·s-1·mm-2@20keV@Si111, 光子能量可調(diào)范圍在8～72.5 keV， 能量分辨率(ΔE/E)為<5×10-3， 該線站采用同軸法其系統(tǒng)極限分辨率可達(dá)亞微米級。

選擇能量26 keV, CCD單像素尺寸為3.25 μm， 樣品到CCD距離13 cm。 所獲取的圖像用ImageJ軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

結(jié)石內(nèi)部結(jié)構(gòu)差異明顯， 可歸納為6種類型(圖1)： Ⅰ兩相密實(shí)型； Ⅱ結(jié)晶型； Ⅲ連續(xù)多層沉積型; Ⅳ非連續(xù)多層沉積型； Ⅴ鑲嵌式多孔型； Ⅵ復(fù)合型。 其特征如下：

Ⅰ兩相密實(shí)型： 結(jié)石由密度差異明顯的兩相組成， 結(jié)石內(nèi)部基本密實(shí)或有少量空隙， 沒有明顯的層狀結(jié)構(gòu)。 Ⅱ結(jié)晶型： 分Ⅱa型和Ⅱb型， Ⅱa型顆粒和結(jié)晶體相對均勻分散， 孔隙較多； Ⅱb型中結(jié)晶體顆粒分布在結(jié)石的一側(cè)， 而結(jié)石另一側(cè)密度差異相對較少， 孔隙相對較少， 結(jié)石棱角清晰。 Ⅲ連續(xù)多層沉積型： 具有明顯的層狀結(jié)構(gòu)， 且層狀結(jié)構(gòu)連續(xù)。 Ⅳ非連續(xù)多層沉積型： 有明顯的層狀結(jié)構(gòu)， 層狀結(jié)構(gòu)斷裂不連續(xù)。 Ⅴ鑲嵌式多孔型： 結(jié)石由密度差異較大的兩相組成， 有較多的不同尺寸大小的孔隙分布在結(jié)石之中。 Ⅳ復(fù)合型： 兼連續(xù)多層沉積型和鑲嵌式多孔型結(jié)構(gòu)， 連續(xù)多層沉積部分分層明顯， 且分層連續(xù)、 致密， 少孔隙； 而多孔部分孔隙多， 成蜂窩狀。

圖1 腎結(jié)石顯微CT結(jié)構(gòu)(6種類型， 標(biāo)尺為200 μm)

腎結(jié)石形成機(jī)制復(fù)雜， 形成過程包括成核、 生長、 聚集、 固相轉(zhuǎn)化等幾個階段， 然而目前越來越多的研究者強(qiáng)調(diào)腎小管上皮細(xì)胞與結(jié)石晶體間的相互影響， 即只有在腎小管上皮損傷情況下， 尿中的鈣晶體才能夠黏附、 生長和聚集， 形成結(jié)石。 在近期的研究中發(fā)現(xiàn)結(jié)石中存在許多尿蛋白, 主要包括骨橋蛋白(OPN)、 Tamm-Horsfall蛋白(THP)、 尿凝血酶原片段1(UPTF1) 、 腎鈣蛋白(NC)等, 這些蛋白與腎結(jié)石的形成關(guān)系密切[10-12]。 假設(shè)基質(zhì)蛋白與礦物質(zhì)， 如混凝土中的水泥和沙石， 基質(zhì)蛋白能起到黏結(jié)膠合作用。 因腎結(jié)石復(fù)發(fā)率高， 獲得結(jié)石的微觀結(jié)構(gòu)， 分析患者產(chǎn)生不同的種類的結(jié)石， 積極探索結(jié)石的生長機(jī)制， 科學(xué)確定治療和預(yù)后方案， 無疑能有助于腎結(jié)石更為有效的治療。

研究表明， 顯微CT無損檢測能獲取到清晰的腎結(jié)石內(nèi)部結(jié)構(gòu)。 腎結(jié)石內(nèi)部的結(jié)構(gòu)有較大差異， 表明結(jié)石形成的復(fù)雜性。 本研究中通過觀察歸納出的6種類型中， 其中連續(xù)多層沉積型、 非連續(xù)多層沉積型和復(fù)合型能明顯看到結(jié)石分層結(jié)構(gòu)， 體現(xiàn)出結(jié)石清晰的生長軌跡。 而從兩相密實(shí)型、 結(jié)晶型和鑲嵌式多孔型顯微CT圖中推測不出腎結(jié)石的生長過程， 需要對其更深入的跟蹤研究。

3 結(jié) 論

通過收集腎結(jié)石患者的結(jié)石樣本32例， 利用SR-μCT(能量為26 keV， CCD單像素尺寸3.25 μm)對其精細(xì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 顯微CT能清晰獲得結(jié)石內(nèi)部微觀結(jié)構(gòu)； 腎結(jié)石內(nèi)部結(jié)構(gòu)差異明顯， 可歸納為6種類型： Ⅰ兩相密實(shí)型； Ⅱ結(jié)晶型； Ⅲ連續(xù)多層沉積型; Ⅳ非連續(xù)多層沉積型； Ⅴ鑲嵌式多孔型； Ⅵ復(fù)合型。 本研究結(jié)果對進(jìn)一步深入揭示腎結(jié)石生長機(jī)制及對腎結(jié)石更為科學(xué)有效防治提供了一新的研究方法和科學(xué)視角。