白鳳媛, 趙冬梅, 蔡仁軍, 宋素菲, 劉 濤*, 徐秋玲*

1. 海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院, 海南 ?？?571199

2. 海南醫(yī)學(xué)院中醫(yī)學(xué)院， 海南 海口 571199

引 言

慢性疼痛是最常見的慢性疾病之一， 不僅給患者帶來軀體和精神上的痛苦、 降低生活質(zhì)量, 同時增加醫(yī)療支出,加重家庭和社會的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。 慢性疼痛的致殘率高， 醫(yī)療費用支出巨大[1-2]。 目前臨床治療疼痛的藥物包括抗抑郁藥、 NMDA 拮抗劑、 阿片類鎮(zhèn)痛藥等， 然而這些藥物大部分具有較多的不良反應(yīng)， 限制了其廣泛應(yīng)用。

慢性疼痛的代謝組學(xué)研究尚處于起步階段。 代謝組學(xué)研究在其他醫(yī)學(xué)領(lǐng)域取得了成功。 這些成就激勵研究人員擴(kuò)大代謝組學(xué)研究， 可以提高對慢性疼痛基本機(jī)制的理解， 并提供診斷、 預(yù)測和監(jiān)測慢性疼痛狀況的工具。

1 實驗部分

1.1 實驗動物及分組

12只無特定病原體(SPF)級雄性大鼠購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司， 許可證號： SCXK(湘)2019-0013。 體重180～200 g。 隨機(jī)均分為正常組、 慢性壓迫損傷(chronic constriction injury, CCI)組， 每組6只。 CCI組進(jìn)行左側(cè)坐骨神經(jīng)結(jié)扎手術(shù)造成慢性壓迫損傷(CCI)模型， 正常組除不結(jié)扎坐骨神經(jīng)， 其余步驟實驗組。 術(shù)后14天， 腹主動脈采血， 進(jìn)行代謝組學(xué)檢測。

1.2 方法

參考Bennett等推薦的方法制備 CCI模型[3]。 將大鼠用1%的戊巴比妥鈉(4 mL·kg-1)麻醉后， 在左側(cè)坐骨神經(jīng)分叉前的主干部位距神經(jīng)起始處上方2 mm用4-0羊腸線結(jié)扎坐骨神經(jīng)4道， 每道間隔約1 mm， 結(jié)扎的松緊度以打結(jié)時可見肌肉輕微抽動為準(zhǔn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 大鼠血清差異代謝物的層次聚類分析熱力圖

對差異代謝物的定量值計算歐式距離矩陣(Euclidean distance matrix)， 以完全連鎖方法對差異代謝物進(jìn)行聚類， 并以熱力圖展示。 結(jié)果見圖1和圖2。

圖中橫坐標(biāo)代表不同實驗分組， Bm為CCI組， K為正常組， 縱坐標(biāo)代表該組對比的差異代謝物， 不同位置的色塊代表對應(yīng)位置代謝物的相對表達(dá)量， 紅色表示該物質(zhì)含量高表達(dá)， 藍(lán)色表示該物質(zhì)含量低表達(dá)。

圖1 POS(正離子模式)

圖1表明, 正離子模式下， 喹啉、 肉毒堿、 3-甲基胞嘧啶、 L-α-氨基丁酸、 脯氨酸羥脯氨酸、 硫胺素、 羥基苯乙酰甘氨酸、 膽固醇、 乙苯等代謝物的表達(dá)升高； 4-胍丁酸甲基吡嗪、 3-甲基組氨酸、 D-丙氨酸、 丙酰肉堿、 肌苷、 胸苷、 L-天冬氨酸、 N-乙酰組氨酸等代謝物的表達(dá)降低。

圖2表明， 負(fù)離子模式下， 2-甲基戊二酸(R)-3-羥基丁酸、 吲哚乙酸、 焦谷氨酸、 十一烷酸、 二十碳五烯酸等代謝物的表達(dá)升高； 牛磺酸、 神經(jīng)酸、 3-甲基組氨酸、 馬兜鈴酸、 馬尿酸、 吲哚丙烯酸、 蘇糖酸等代謝物的表達(dá)降低。

圖2 NEG(負(fù)離子模式)

2.2 差異代謝物的富集分析

利用超高效液相色譜Q萃取質(zhì)譜分析(ultra-high performance liquid chromatography q exactive mass spectrometry, UHPLC-QE-MS)并結(jié)合PCA(主成分分析)、 OPLS-DA(正交最小二乘法判別分析)和OPLS-DA置換檢驗等多元統(tǒng)計分析方法后， 對上述層次聚類分析熱力圖篩選出的差異代謝物, 利用MetabolicAnalyst5.0進(jìn)行差異代謝物的富集分析。 富集分析氣泡圖見圖3， 富集分析表見表1。

圖3 富集分析氣泡圖

表1 富集分析表

代謝組學(xué)是指生物體或細(xì)胞在特定生理時期所有小分子量代謝產(chǎn)物的集合[4]。 通過檢測血液、 尿液等各種生物樣品中的分子來揭示整個代謝概況[5]。 代謝組學(xué)的目的是研究生物系統(tǒng)中代謝物的變化, 通過篩選實驗組和對照組之間的不同代謝物， 可以研究與不同代謝物相關(guān)的生物過程， 以揭示相關(guān)生命活動的機(jī)制[6]。 代謝組學(xué)技術(shù)為疾病的發(fā)生和治療機(jī)制研究提供了新思路[7]， 代謝組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用促進(jìn)了疼痛研究的發(fā)展[8]。

目前慢性疼痛尚缺乏特異性的分子生物學(xué)指標(biāo)， 而代謝組學(xué)在研究生物標(biāo)志物方面具有廣闊的前景。 王國遼等[8]采用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)研究代謝組學(xué)， 篩選出大鼠術(shù)后急性疼痛和慢性坐骨神經(jīng)痛的35種差異代謝物。 段昆等[9]通過建立大鼠原發(fā)性痛經(jīng)模型， 采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)共篩選鑒定出12種與原發(fā)性痛經(jīng)相關(guān)的差異性代謝物。 何瑤等[10]構(gòu)建大鼠痛經(jīng)模型， 采用超高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF-MS) 技術(shù)篩選出?；切苋パ跄懰岷腿苎字岬韧唇?jīng)大鼠血漿中的差異性代謝物。 龔思思等[11]運用基于UPLC-QToFMS的非靶向代謝組學(xué)方法研究骨關(guān)節(jié)炎血清代謝物， 結(jié)果表明， 血清代謝組學(xué)方法能夠有效區(qū)分病例組和對照組。 本研究以正常大鼠及慢性坐骨神經(jīng)痛大鼠血清為樣本， 采用UHPLC-QE-MS代謝組學(xué)技術(shù)對其進(jìn)行差異性代謝物篩選， 結(jié)果共篩選出9種差異性代謝物， 主要包括： 有機(jī)酸、 有機(jī)雜環(huán)化合物、 脂肪酰基、 碳水化合物、 核酸、 有機(jī)氮化合物、 碳?xì)浠衔铩?有機(jī)氧化合物、 苯類。 實驗結(jié)果顯示這些差異性代謝物在慢性疼痛的診斷、 機(jī)制研究及藥物靶點研究中具有重要應(yīng)用價值。

有機(jī)酸、 有機(jī)化合物、 核酸等代謝物與慢性疼痛關(guān)系密切。 楊菁等[12]研究結(jié)果表明， 食用土當(dāng)歸總有機(jī)酸具有較好的抗炎鎮(zhèn)痛作用， 并且有機(jī)酸是食用土當(dāng)歸抗炎鎮(zhèn)痛的主要有效成分。 有研究表明[13]當(dāng)疼痛發(fā)生時大鼠腦組織中一氧化氮(NO)、 COX2等化合物表達(dá)量明顯增加。 研究發(fā)現(xiàn)， 有機(jī)化合物——甲烷具有鎮(zhèn)痛作用[14]。 核酸在慢性疼痛的發(fā)生、 發(fā)展中均具有重要作用[15]。 本研究結(jié)果顯示， 與正常組相比， 建立CCI模型后血清中的有機(jī)酸、 有機(jī)化合物、 核酸等代謝發(fā)生了變化， 說明有機(jī)酸、 有機(jī)化合物、 核酸等可能是引起慢性疼痛的重要靶點。

3 結(jié) 論

使用UHPLC-QE-MS代謝組學(xué)技術(shù)對坐骨神經(jīng)慢性壓迫損傷模型大鼠的血清代謝物進(jìn)行初步研究， 篩選出的有機(jī)酸、 有機(jī)雜環(huán)化合物、 脂肪?；?、 碳水化合物、 苯類等9類代謝物質(zhì)可能與慢性疼痛關(guān)系密切。 但有機(jī)雜環(huán)化合物、 脂肪?；?、 碳水化合物、 苯類等包含的相關(guān)化學(xué)物質(zhì)詳細(xì)種類較多， 尚不明確究竟何種物質(zhì)在慢性疼痛的發(fā)生、 傳遞和調(diào)制的過程中起決定作用， 這些差異代謝物在慢性疼痛中的作用機(jī)制及其具體靶點還有待進(jìn)一步深入研究。