易 軍, 楊 光, 潘紅衛(wèi)*, 趙麗莉, 雷宏軍, 童文彬, 史利利

1. 河南省生態(tài)環(huán)境科學(xué)研究院, 河南 鄭州 450045

2. 華北水利水電大學(xué)水利學(xué)院, 河南 鄭州 450046

引 言

溶解性有機物(dissolved organic matter， DOM)是一種富含芳香性和脂質(zhì)類、 分子量非均勻的混合物， 含有羥基、 羧基、 羰基等活性基團， 廣泛存在于天然水體(河流、 湖泊等)及其沉積物、 土壤、 污(廢)水、 雨水道路徑流等中， 并作為其中最為活躍的組分幾乎參與所有的生物化學(xué)過程[1]， 因此研究DOM的時空變化可以揭示營養(yǎng)物質(zhì)及污染物的遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律[2]。 在以往研究中多使用溶解有機碳(dissolved organic carbon, DOC)、 溶解有機氮(dissolved organic nitrogen, DON)、 紫外吸光度系數(shù)等[3-4]表征DOM的濃度或含量的相對大小， 但是僅限于DOM總量的表征。 近年來， 三維熒光光譜技術(shù)因其提取方法簡單、 無須添加化學(xué)試劑避免了二次污染、 靈敏度高(10-9數(shù)量級)以及不破壞樣品結(jié)構(gòu)等優(yōu)點受到廣泛應(yīng)用。 目前， 隨著與光譜解析手段平行因子(parallel factor analysis, PARAFAC)模型和熒光區(qū)域積分法(fluorescence regional integration, FRI)等的結(jié)合， 可以進一步獲取DOM的組成分布、 來源等信息[5]。 例如腐殖酸和富里酸物質(zhì)是評價堆肥腐熟度的重要指標[6]。

然而由于提取對象不同， 三維熒光光譜掃描前樣品的提取時間從10 min到30 h不等[7-9]。 因此， 研究者就有關(guān)三維熒光光譜的最佳提取方案開展一系列研究。 申釗穎等[10]選用總熒光強度達到最大值后趨于穩(wěn)定的時刻作為濕地DOM最佳提取方案的判別標準。 趙鵬鶴等[11]在探究污泥資源化的最佳預(yù)處理溫度參數(shù)時， 選用熒光峰強度最大作為標準。 Xie等[12]在研究稻田DOM的預(yù)處理條件時， 發(fā)現(xiàn)提取時間、 水土比、 提取劑濃度與DOM成分有關(guān)， 并選擇獲得熒光峰強度最大的提取方案。 這些研究集中于土壤或沉積物DOM， 并且預(yù)處理方案的選取以DOM總量的提取效果最佳， 目前關(guān)于組分提取效果的研究未見報道。 此外， DOM作為一類含碳的大分子復(fù)雜有機聚合物， 不同組分的提取釋放情況不同， 總量與組分的提取時間可能存在差異， 如果仍以提取總量效果為依據(jù)， 會存在由于組分未提取完全所造成的誤差。

為對比各組分和總量的最優(yōu)提取時間的差異， 本研究選用腐殖酸(humic acid， HA)作為供試材料， 采用三維熒光光譜結(jié)合PARAFAC和FRI分析不同提取方式下DOM組分光學(xué)特性隨時間變化情況， 根據(jù)各熒光區(qū)域積分值和最大熒光強度得分值(Fmax)篩選出最佳提取時間。 本文中得到的DOM總量與組分的最佳提取時間， 可為DOM提取方案的優(yōu)化提供一定的參考。

1 實驗部分

1.1 樣品制備

本研究使用的HA購自天津光復(fù)試劑公司。 取1 g HA加入錐形瓶中， 加入100 mL去離子水配制樣品。 一組在室溫(25 ℃)， 150 r·min-1恒溫振蕩箱內(nèi)， 根據(jù)恒溫振蕩箱的工作時間上限設(shè)置振蕩時間為0～72 h， 間隔為3 h； 另一組在4 000 r·min-1高速離心機內(nèi)， 根據(jù)離心機最大工作時間設(shè)置的離心時間為0～60 min， 間隔為5 min。 靜置4 h后， 將每個試樣的上清液經(jīng)0.45 μm水系微孔濾膜過濾得到DOM提取液， 稀釋至UV260<0.02以去除內(nèi)濾效應(yīng)。

1.2 光譜測量方法

采用熒光分光光度計(F4600)測量樣品的三維熒光光譜。 激發(fā)光源為氘燈。 激發(fā)波長范圍為220～450 nm， 步長5 nm， 發(fā)射波長200～500 nm， 步長5 nm， 狹縫寬度5 nm， PMT電壓400 V, 掃描速度1 200 nm·min-1， 在1 cm石英熒光比色皿中測量。

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

利用MATLAB 2018對光譜數(shù)據(jù)(分析前以Milli-Q超純水為空白扣除瑞利散射和拉曼散射的影響)進行FRI和PARAFAC解析。 通過PARAFAC識別熒光組分前， 將熒光強度歸一化為激發(fā)波長350 nm處的拉曼信號強度(RU350)， 用最大熒光強度(Fmax)值評估熒光峰強度。 通過FRI方法得出不同區(qū)域的積分標準體積代表各區(qū)域?qū)?yīng)的DOM相對含量[13]， FRI所劃分的五個區(qū)域見表1， 相關(guān)計算公式見式(1)—式(3)。 利用Origin2018將處理好的光譜數(shù)據(jù)繪制成等高線譜圖。

Фi, n=MFi?exemI(λexλem)dλexdλem

(1)

(2)

(3)

式中： Фi, n為熒光區(qū)域i的積分標準體積； Фi為熒光區(qū)域i的積分體積；λex為激發(fā)波長；λem為發(fā)射波長；I(λexλem)為激發(fā)發(fā)射波長對應(yīng)的熒光強度； ФT, n為總熒光區(qū)域積分標準體積；Pi, n為熒光區(qū)域i的積分標準體積占總積分標準體積比例；MFi為倍增系數(shù)， 為熒光區(qū)域i的積分面積占總的熒光區(qū)域積分面積比例的倒數(shù)。

表1 熒光積分區(qū)域劃分范圍

2 結(jié)果與討論

2.1 兩種提取方式下DOM提取效果

三維熒光光譜可以指示可溶性有機物的種類、 性質(zhì)和相對含量等豐富信息， 從而反映提取樣品中DOM的變化情況。 振蕩和離心提取著HA水解的三維熒光光譜分別見圖1、 圖2。 結(jié)果表明， 隨著提取時間的變化， DOM的光譜形狀基本無明顯變化， 但熒光峰強度呈現(xiàn)上升到下降的往復(fù)過程。

圖3為離心和振蕩提取下光譜區(qū)域體積積分變化情況。 熒光區(qū)域的體積積分(Фi)可間接表征不同區(qū)域特定結(jié)構(gòu)熒光組分的相對含量。 結(jié)果表明， 與離心相比， 振蕩各組分的占比變化幅度較??； 在離心和振蕩處理下類腐殖質(zhì)組分的積分占比(P1+P2)最大， 分別占比53.41%～70.67%， 74.55%～81.77%； 類蛋白質(zhì)組分占比(P3+P4)分別在25.84%～42.65%， 14.85%～21.96%； 而微生物代謝產(chǎn)物的積分占比(P5)均在3%左右， 說明振蕩處理提取效果較穩(wěn)定。

圖2 振蕩提取下HA三維熒光光譜圖

圖3 兩種提取方式下熒光區(qū)域積分值變化情況

通過拆半分析、 殘差分析、 平方誤差和、 解釋方差和核一致性分析， 確定兩種提取方式DOM平行因子分析模型的最佳因子數(shù)為3， 其熒光光譜圖如圖5。 表2為所有組分的激發(fā)和發(fā)射波長最大值的位置， 在Open Fluor數(shù)據(jù)庫中查詢到三個組分的多個強匹配項(tucker congruence coefficient, TCC>0.95)， 提供了熒光成分的近似描述。 C3組分的熒光峰最大值較C1組分發(fā)生了紅移， 表現(xiàn)出更復(fù)雜的性質(zhì)。 同C1相比， C3生物生產(chǎn)、 降解和吸附的強度更低[14]。

兩種提取方式下Fmax變化情況如圖4所示， 振蕩提取樣品的Fmax為C1>C2>C3組分， 離心提取樣品的Fmax為C2>C1>C3組分。 C1對整個模擬熒光得分的平均貢獻率為44.03%， C2平均貢獻率44.28%之間， C3平均貢獻率為11.68%。

表2 HA的DOM熒光組分特征

圖4 兩種提取方式下Fmax值變化情況

圖5 基于PARAFAC解析出兩種提取方式下HA的DOM熒光組分

提取過程中振蕩處理的區(qū)域體積積分值和Fmax值均大于離心， 且其占比的變化幅度小于離心處理。 說明振蕩處理提取量充分且提取的組分相對較穩(wěn)定。 因為高速離心機工作時間最大為60 min， 恒溫振蕩箱工作時間上限為4 500 min， 可以通過較長時間的振蕩提取分子結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的組分。 離心是利用轉(zhuǎn)子高速旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的強大離心力， 在較短時間內(nèi)迫使這些微?？朔U散產(chǎn)生沉降運動[20]， 多用來分離不同密度的混合物。

2.2 DOM組分和總量的提取效果

兩種提取方法的區(qū)域積分值和Fmax變化趨勢基本一致， 呈現(xiàn)先上升后下降又恢復(fù)上升趨勢， 直至上升幅度趨于平緩。 圖6(a)顯示， 類絡(luò)氨酸與類腐殖質(zhì)、 微生物代謝產(chǎn)物組分呈負相關(guān)， 與類蛋白質(zhì)組分呈正相關(guān)。 可能是由于各組分之間存在復(fù)雜的相互作用， 導(dǎo)致類絡(luò)氨酸變化規(guī)律與其他組分存在差異。 在提取前期DOM被不斷釋放含量上升； 出現(xiàn)下降時可能是出現(xiàn)絮凝現(xiàn)象， 當釋放量大于絮凝量會出現(xiàn)上升， 反之則會下降。 同時， 大分子物質(zhì)的絮凝能力大于小分子物質(zhì)[20]， 這一點在振蕩提取后期(72 h)中熒光區(qū)域Ⅲ體積積分(Ф3)、 區(qū)域Ⅳ體積積分(Ф4)較初期上升， 而區(qū)域Ⅰ體積積分(Ф1)、 區(qū)域Ⅱ體積積分(Ф2)則出現(xiàn)下降能夠得到證實。

對PARAFAC和FRI分析得到的不同提取時間下的區(qū)域積分值和Fmax進行相關(guān)性分析和主成分分析， 結(jié)果如圖6、 圖7所示。 DOM組分間的相關(guān)關(guān)系表明它們來源或其結(jié)構(gòu)具有某種聯(lián)系。 相關(guān)性結(jié)果顯示， 離心處理下熒光區(qū)域積分Ф1， Ф2和Ф5均與總量呈現(xiàn)顯著正相關(guān)(p<0.05)， Ф3， Ф4與總量的關(guān)系較弱； C1， C2和C3均與總量呈現(xiàn)顯著正相關(guān)(p<0.05)。 類腐殖質(zhì)組分與總量的提取情況相似， 類蛋白質(zhì)與總量的提取情況存在差異， 說明各組分之間的相互作用不同， 總量的提取情況無法概括組分的情況， 需要對組分和總量分別設(shè)置提取時間。 PARAFAC和FRI解析DOM的主成分1對總方差的解釋分別達到67.9%和66.0%, 第2主成分對總方差的解釋分別達到32.0%和25.7%， 累積分別達到99.9%和91.7%， 說明主成分分析法對原數(shù)據(jù)的損失不大。 兩種解析方法下主成分1的主要影響因子均是類腐殖質(zhì)組分(Ф2， C1)， 表明類腐殖質(zhì)組分與總量的提取情況相似。

注： *表示存在顯著性差異(p<0.05)， **表示存在極顯著性差異(p<0.01)

圖7 HA DOM 組分的主成分分析

2.3 最佳提取時間與方法篩選

分別根據(jù)區(qū)域積分值、Fmax以及經(jīng)濟角度考慮， 篩選出的最佳提取時間結(jié)果見表3。 以往研究中[21]， DOC的提取過程符合一級動力學(xué)模型， 與本研究中得到結(jié)果存在差異， 可能是本研究中提取時間較長， 存在分段符合動力學(xué)模型的情況。 由于本研究中每次組分提取量趨于穩(wěn)定時的峰值相差較小， 從經(jīng)濟角度， 選擇區(qū)域積分值和Fmax初期出現(xiàn)峰值的時間。 此外， 本研究針對總量提取時間的選取， 為體現(xiàn)組分的提取效果， 以各組分占比變化趨于穩(wěn)定為前提， 篩選區(qū)域積分值和Fmax初期出現(xiàn)峰值的時間。 離心處理的組分最佳提取時間同理可得。 同時， 根據(jù)相關(guān)性分析和主成分分析發(fā)現(xiàn)， 類富里酸組分(區(qū)域Ⅱ、 C2)與總量的相關(guān)性較高且是主成分1的主要影響因子， 二者具有相同的提取時間。 說明總量可與影響因子較大且相關(guān)性較強的組分選擇相同的提取時間。 綜上， 兩種提取方法各有優(yōu)點， 振蕩提取的分子量大于離心處理， 提取組分比例較為穩(wěn)定。 離心提取下總量與組分最佳提取時間可選為一致。

表3 兩種提取方法下最佳提取時間結(jié)果

PARAFAC分析和FRI方法對DOM組分的解析情況存在差異[22]， 本研究根據(jù)以上兩種方法識別出的組分類別存在差異， 但是通過分析得到的最佳時間呈現(xiàn)較高的一致性。 雖然從表3來看， 振蕩處理中PARAFAC分析識別出的C3為類腐殖酸組分， 與FRI方法中的區(qū)域Ⅰ相對應(yīng)， 但是二者的最佳提取時間不同。 這是由于FRI方法把一部分類腐殖酸類物質(zhì)劃分入了類富里酸物質(zhì)[23]， 同時C3的發(fā)射波長也較同為類腐殖酸組分的C1發(fā)生紅移， 結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜， 需要延長提取時間， 這一點與DOC在提取過程中得出的結(jié)論一致[21]。

同時還必須強調(diào)本研究的局限性， 因為本研究只針對這一種外源有機物的最佳提取時間， 不同類別的外源有機物組分類別及分布存在差異， 組分與總量的關(guān)系是否存在差異， 需要后續(xù)進行比較研究。 此外， 在提取方案中對組分的最佳提取劑種類、 樣品濃度等可參考本文開展進一步研究。

3 結(jié) 論

(1)組分與總量在提取過程中DOM釋放情況均存在差異， 需要分別設(shè)置提取時間。 組分的最佳提取時間篩選條件為： 以提取量變化趨于平穩(wěn)為前提， 選擇初期區(qū)域體積積分值或Fmax達到峰值的時間。 總量的最佳提取時間篩選條件為： 以各組分占比變化趨于穩(wěn)定為前提， 篩選區(qū)域積分值和Fmax初期出現(xiàn)峰值的時間。

(2)FRI分析得出離心提取下最優(yōu)提取時間除類絡(luò)氨酸為10 min外均為45 min， 在振蕩提取下總量、 類腐殖酸、 類富里酸、 類色氨酸、 類絡(luò)氨酸和微生物代謝產(chǎn)物的最優(yōu)提取時間分別為12, 21, 12, 12, 12和12 h； PARAFAC分析得出總量、 C1、 C2、 C3在兩種提取方式下的最優(yōu)提取時間分別為： 45， 45和45 min； 12, 21, 12和39 h。

(3)兩種提取方法各有優(yōu)點， 振蕩提取的分子量大于離心處理， 提取組分比例較為穩(wěn)定。 離心提取下總量與組分最佳提取時間可選為一致。 兩種光譜解析方法得出的結(jié)果也呈現(xiàn)高度一致性。 總量的最佳提取時間與相關(guān)性較高且影響因子較大的組分一致， 分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜的組分需要延長提取時間。

(4)需要后續(xù)結(jié)合對不同類別的外源有機物組成成分及分布進行比較研究， 明確是否組分與總量的關(guān)系均存在差異。