張軍，阮慧，劉濤，馬麗

（武漢市第七醫(yī)院，湖北武漢 430071）

妊娠期子宮會發(fā)生一定程度的改變直到分娩后子宮開始重塑恢復(fù)[1]。產(chǎn)后子宮復(fù)舊不全是指產(chǎn)后6周子宮仍未恢復(fù)到非孕狀態(tài)，即子宮體肌纖維不能如期縮復(fù)和子宮內(nèi)膜再生障礙，主要表現(xiàn)為產(chǎn)后腹痛、血性惡露持續(xù)淋漓不凈，或反復(fù)間歇性血性惡露，并可在此基礎(chǔ)上繼發(fā)盆腔感染、月經(jīng)失調(diào)、貧血、不孕等，直接危害婦女的身心健康。其誘發(fā)原因復(fù)雜，多與盆腔感染及胎膜殘留有關(guān)[2]。臨床醫(yī)學(xué)對于產(chǎn)后子宮復(fù)舊患者的治療方法多為對癥宮縮劑及物理療法，但是依從性較差[3]。中醫(yī)藥對產(chǎn)后子宮復(fù)舊不全顯示出了良好的治療作用，并且具有安全性、依從性較高的特點(diǎn)。根據(jù)產(chǎn)后復(fù)舊不全的臨床表現(xiàn)，其歸屬于中醫(yī)學(xué)“產(chǎn)后惡露不絕”的范疇。中成藥益母草顆粒具有活血調(diào)經(jīng)的功效，主治血瘀所致的月經(jīng)不調(diào)、產(chǎn)后惡露不絕，癥見痛經(jīng)、惡露不盡及月經(jīng)失調(diào)，產(chǎn)后子宮復(fù)舊不全見上述證候者，臨床療效良好[4-5]；但其作用機(jī)制尚不完全明確。因此，本研究通過建立產(chǎn)后子宮復(fù)舊不全大鼠模型，觀察益母草顆粒的子宮修復(fù)作用及機(jī)制，以期為產(chǎn)后子宮復(fù)舊不全患者提供用藥指導(dǎo)?，F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級SD大鼠（雌性40只，雄性20只），鼠齡均10周，體質(zhì)量（210±25）g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（桂）2019-0009。本實(shí)驗(yàn)在廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行，按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》規(guī)定進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。大鼠飼養(yǎng)于動(dòng)物房內(nèi)，常溫，濕度為55%左右，模擬動(dòng)物的生物周期黑白交替（12 h/12 h），無菌飲食適應(yīng)性喂養(yǎng)2周。實(shí)驗(yàn)期間均自由飲水及攝食。

1.2 細(xì)菌、主要試劑與儀器大腸桿菌（X25922）（青島海博生物公司）。腫瘤壞死因子（TNF）-α、轉(zhuǎn)化生子因子（TGF）-β1酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（上海撫生實(shí)業(yè)有限公司）；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（北京達(dá)科為生物技術(shù)股份有限公司）；脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）介導(dǎo)的核苷酸（dUTP）缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒[弗元（上海）生物科技有限公司]；免疫組織化學(xué)SP試劑盒（廣州鼎國生物公司）；環(huán)氧化酶（COX）-2單抗（美國開曼公司）；TGF-β1單抗[圣克魯斯生物技術(shù)（上海）有限公司]；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司）。光學(xué)顯微鏡（寧波永新光學(xué)股份有限公司）；蛋白電泳儀（北京六一生物科技有限公司）。

1.3 藥物及制備益母草顆粒，15 g/袋，由廣西天天樂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號：國藥準(zhǔn)字Z45020208。實(shí)驗(yàn)時(shí)大鼠用藥量按人與大鼠體表面積比值換算法求得大鼠給藥中劑量為0.043 g/kg，將該藥加入蒸餾水，配制成混懸液備用。桃紅四物湯（由桃仁、當(dāng)歸、白芍各9 g，紅花、川芎各6 g，熟地黃12 g組成），中藥飲片購自安徽省合肥樂家老鋪中藥飲片有限公司，先將藥材用10倍量的水浸泡1 h，然后常規(guī)煎煮2次，每次1 h，最后濃縮至180 g/L。

1.4 分組、造模與給藥將大鼠分為4組，即正常組、模型組、益母草顆粒組及桃紅四物湯組，每組10只。所有大鼠均進(jìn)行妊娠后自然分娩，除正常組外均采用大腸桿菌（X25922）建立子宮復(fù)舊不全模型。造模方法[6]：將雌性大鼠和雄性大鼠按照2∶1比例合籠，次日清晨觀察陰栓并進(jìn)行陰道檢測，在陰道栓發(fā)現(xiàn)精子為妊娠首日。將所有妊娠大鼠在相同環(huán)境下進(jìn)行單籠飼養(yǎng)，直到分娩后第1天。將大腸桿菌用Nacl溶液稀釋1×107/mL，0.2 mL接種于子宮內(nèi)，注射后第2天均處死1只大鼠，進(jìn)行子宮切片HE染色觀察，發(fā)現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤，子宮復(fù)舊不良，則表示造模成功。造模成功后，益母草顆粒組給予4.3 g/kg益母草顆?；鞈乙汗辔福壹t四物湯組給予4.5 g/kg桃紅四物湯灌胃，模型組和正常組大鼠均灌胃等體積的0.9%生理鹽水，均連續(xù)給藥7 d，早晚各1次。

1.5 觀察指標(biāo)與方法

1.5.1 ELISA法檢測大鼠血清TNF-α、TGF-β1含量 末次灌胃后，采集大鼠尾部靜脈血3 mL（每次抽取1 mL，抽取3次），放入離心管中，3 000 r/min（離心半徑10 cm）離心10 min，保留上清液。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，依次進(jìn)行繪制樣本布局表、配制試劑標(biāo)準(zhǔn)品、清洗孔板、加樣、覆膜、洗版、加顯色劑終止液處理。實(shí)驗(yàn)完成后立即用酶標(biāo)儀在450 nm波長相對630 nm波長處，測定每孔吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算TNF-α、TGF-β1濃度。

1.5.2 組織提取及HE染色法觀察大鼠子宮組織病理形態(tài) 用1%戊巴比妥鈉麻醉處死大鼠，摘取子宮，沖洗污血，一部分放入液氮保存?zhèn)溆?，一部分放?0%甲醛溶液中固定過夜，脫水后石蠟包埋制4μm切片。將石臘切片用二甲苯脫蠟后按照100%-95%-85%-75%乙醇進(jìn)行逐層脫水，蘇木素染色10 min，1%鹽酸處理，伊紅復(fù)染，100%-95%-85%-75%乙醇脫水，封片后顯微鏡下觀察子宮組織病理形態(tài)變化。

1.5.3 TUNEL法觀察大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡情況 將子宮組織切片與蛋白酶K室溫孵育后，浸入TUNEL反應(yīng)液中。PBS沖洗3次。再用過氧化氫沖洗淬滅酶活性后，聯(lián)合抗生物蛋白過氧化氫酶和二氨基聯(lián)苯胺覆蓋，光學(xué)高倍顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞核呈現(xiàn)棕黃色，隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.5.4 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測大鼠子宮組織COX-2、TGF-β1蛋白表達(dá) 子宮組織預(yù)冷，放射免疫沉淀法（RIPA）裂解提取總蛋白，蛋白定量后上樣，進(jìn)行1.5%的十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE），半干轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%牛血清封閉，分別加入一抗COX-2（1∶1 000稀釋）、TGF-β1（1∶3 000稀釋）4℃孵育過夜，加入羊抗兔IgG二抗（1∶5 000稀釋）孵育，電化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）顯色曝光。應(yīng)用ImageJ軟件分析得出目的蛋白的相對表達(dá)水平，內(nèi)參為GAPDH。

1.5.5 免疫組織化學(xué)法檢測大鼠子宮組織COX-2、TGF-β1蛋白表達(dá) 子宮組織石蠟切片常規(guī)脫蠟后，水化，37.5℃靜置0.5 h后，加入EDTA液抗原修復(fù)，山羊血清封閉。加入一抗COX-2及TGF-β1（1∶500稀釋），加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（1∶2 000稀釋）孵育0.5 h后，復(fù)染，脫水，透明，封片。顯微鏡下選擇不交叉的10個(gè)視野，COX-2在細(xì)胞核中呈現(xiàn)棕黃色陽性表達(dá)，TGF-β1在細(xì)胞漿中呈現(xiàn)棕黃色陽性表達(dá)，計(jì)算COX-2、TGF-β1陽性細(xì)胞數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較采用方差分析，事后檢驗(yàn)采用Bonferroni法進(jìn)行組間兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清TNF-α、TGF-β1水平比較表1結(jié)果顯示：模型組大鼠血清TNF-α、TGF-β1水平高于正常組（P＜0.05）；益母草顆粒組和桃紅四物湯組大鼠血清TNF-α、TGF-β1水平低于模型組（P＜0.05）；益母草顆粒組血清TNF-α、TGF-β1水平與桃紅四物湯組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠血清TNF-α、TGF-β1水平比較Table 1 Comparison of serum TNF-αand TGF-β1 levels among various groups of rats （±s）

表1 各組大鼠血清TNF-α、TGF-β1水平比較Table 1 Comparison of serum TNF-αand TGF-β1 levels among various groups of rats （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組益母草顆粒組桃紅四物湯組F值P值鼠數(shù)/只9 9 9 9 TNF-α/（pg·mL-1）21.33±10.25 56.08±5.11①44.60±6.70①②45.63±7.04①②34.330＜0.001 TGF-β1/（mg·mL-1）852.08±56.06 1 855.32±169.17①1 247.22±77.00①②1 248.39±98.08①②130.500＜0.001

2.2 各組大鼠子宮組織病理形態(tài)比較圖1結(jié)果顯示：正常組子宮腔形態(tài)正常，子宮內(nèi)膜較厚，肌細(xì)胞排列整齊；模型組子宮腔形態(tài)異常，子宮內(nèi)膜較薄，肌細(xì)胞排列不規(guī)則，血管大面積透明樣變化及存在炎性浸潤；益母草顆粒組和桃紅四物湯組子宮腔形態(tài)趨于正常，未見明顯炎性浸潤，無上皮細(xì)胞損傷，腺體細(xì)胞數(shù)目增多，間質(zhì)較致密。

圖1 各組大鼠子宮組織病理形態(tài)比較（HE染色，×200）Figure 1 Comparison of histopathological patterns of the uterus among various groups of rats（HE staining，×200）

2.3 各組大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡程度比較圖2結(jié)果顯示：正常組、模型組、益母草顆粒組和桃紅四物湯組子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡率分別為（6.30±0.36）%、（24.40±2.70）%、（12.28±2.35）%及（13.08±2.70）%，組間比較存在差異（F=101.600，P＜0.001）。進(jìn)一步比較，模型組大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡率高于正常組（P＜0.05），而益母草顆粒組和桃紅四物湯組大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡率低于模型組（P＜0.05），益母草顆粒組子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡率與桃紅四物湯組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組大鼠子宮內(nèi)膜凋亡細(xì)胞分布情況見圖3。

圖2 各組大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡率比較（±s）Figure 2 Comparison of apoptosis rates of endometrial cells among various groups of rats（±s）

圖3 各組大鼠子宮內(nèi)膜凋亡細(xì)胞分布情況比較（TUNEL法，×200）Figure 3 Comparison of the distribution of apoptotic cells in the endometrium among various groups of rats（TUNEL method，×200）

2.4 各組大鼠子宮組織COX-2、TGF-β1蛋白表達(dá)比較表2、圖4、圖5結(jié)果顯示：模型組大鼠子宮組織COX-2、TGF-β1蛋白相對表達(dá)水平較正常組升高（P＜0.05），而益母草顆粒組和桃紅四物湯組大鼠子宮組織COX-2及TGF-β1蛋白相對表達(dá)水平低于模型組（P＜0.05），益母草顆粒組子宮組織COX-2及TGF-β1蛋白相對表達(dá)水平與桃紅四物湯組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖4 各組大鼠子宮組織COX-2蛋白電泳條帶圖像Figure 4 Electrophoretic band images of COX-2 protein in uterus tissues in each group of rats

圖5 各組大鼠子宮組織中TGF-β1蛋白電泳條帶圖像Figure 5 Electrophoretic band images of TGF-β1 protein in uterus tissues in each group of rats

表2 各組大鼠子宮組織COX-2、TGF-β1蛋白表達(dá)比較Table 2 Comparison of protein expression of COX-2 and TGF-β1 in the uterine tissues among various groups of rats

2.5 各組大鼠子宮組織COX-2、TGF-β1陽性表達(dá)比較表3結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠子宮組織COX-2、TGF-β1陽性細(xì)胞數(shù)升高（P＜0.05），益母草顆粒組和核桃紅四物湯組大鼠子宮組織COX-2、TGF-β1陽性細(xì)胞數(shù)低于模型組（P＜0.05），益母草顆粒組COX-2、TGF-β1陽性細(xì)胞數(shù)與桃紅四物湯組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠子宮組織COX-2、TGF-β1陽性細(xì)胞數(shù)比較Table 3 Comparison of the number of COX-2 and TGF-β1 positive cells in uterine tissues among various groups of rats （±s）

表3 各組大鼠子宮組織COX-2、TGF-β1陽性細(xì)胞數(shù)比較Table 3 Comparison of the number of COX-2 and TGF-β1 positive cells in uterine tissues among various groups of rats （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組益母草顆粒組桃紅四物湯組F值P值鼠數(shù)/只9 9 9 9 COX-2陽性細(xì)胞數(shù)/個(gè)5.06±1.02 20.15±2.51①13.96±3.07①②14.55±3.11①②52.990＜0.001 TGF-β1陽性細(xì)胞數(shù)/個(gè)6.10±1.30 16.33±1.05①10.36±1.20①②11.05±1.17①②113.200＜0.001

圖6 各組大鼠子宮組織COX-2及TGF-β1陽性細(xì)胞分布情況（免疫組織化學(xué)，×200）Figure 6 The distribution of COX-2 and TGF-β1 positive cells in uterus tissues in each group of rats（Immunohistochemistry，×200）

3 討論

正常分娩后，由于子宮肌纖維的縮復(fù)作用，胎盤剝離面可及時(shí)得以修復(fù)，一般在產(chǎn)后5~6周可恢復(fù)到非孕狀態(tài)，這個(gè)過程即為子宮復(fù)舊。當(dāng)復(fù)舊功能受阻時(shí)，即引起子宮復(fù)舊不全，長期復(fù)舊不全，易發(fā)生子宮肌壁組織纖維化，子宮平滑肌收縮乏力，子宮肌壁血管擴(kuò)張，不能閉鎖，而導(dǎo)致產(chǎn)后出血延長，殘留蛻膜組織不能及時(shí)脫落排出，會產(chǎn)生局部炎癥反應(yīng)，出現(xiàn)產(chǎn)后腹痛、產(chǎn)后感染、產(chǎn)后惡露不絕等疾病[7]。產(chǎn)后子宮復(fù)舊不全的病理機(jī)制復(fù)雜，與細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、子宮內(nèi)膜纖維化等密切相關(guān)。

子宮內(nèi)膜發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)，革蘭氏陰性菌合成的毒性物質(zhì)細(xì)菌脂多糖（LPS）誘導(dǎo)粒細(xì)胞、子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子，通過相應(yīng)的受體啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，激活核因子κB（NF-κB），引起TNF-α轉(zhuǎn)錄增多[8]。在子宮修復(fù)不全中，NF-κB可調(diào)控TNF-α的產(chǎn)生，而TNF-α釋放增加又促進(jìn)了NF-κB的磷酸化，使NF-κB進(jìn)一步激活，從而延續(xù)炎癥反應(yīng)的復(fù)雜環(huán)路調(diào)節(jié)，導(dǎo)致最初的炎癥信號進(jìn)一步放大，加重子宮炎癥反應(yīng)，生成大量NO，使纖溶酶原激活劑含量升高、使溶酶體和激肽等釋放，導(dǎo)致血量增多[9]。本研究結(jié)果顯示，益母草顆粒組大鼠血清TNF-α水平低于模型組（P＜0.05），表明益母草顆?？赡芡ㄟ^減少炎癥因子TNF-α分泌，減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)產(chǎn)后子宮復(fù)舊不全大鼠子宮的恢復(fù)。

TGF-β1被認(rèn)為是最重要的促纖維化因子之一，是纖維化發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵啟動(dòng)因子，能刺激子宮內(nèi)膜組織上皮細(xì)胞數(shù)目增加，誘導(dǎo)其向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變[10]。Smad蛋白是TGF-β1作用的直接底物，TGF-β1與特異性受體結(jié)合激活TGF-β1/Smad信號通路，促使成纖維細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）沉積，誘導(dǎo)組織纖維化。既往研究[11-12]已證實(shí)，宮腔粘連患者粘連組織中TGF-β1和Smad3上調(diào)，提示TGF-β1/Smad3通路激活可促進(jìn)子宮內(nèi)膜纖維化。本研究結(jié)果顯示，益母草顆粒組大鼠子宮組織TGF-β1表達(dá)水平低于模型組（P＜0.05），表明益母草顆粒可能通過抑制子宮組織TGF-β1表達(dá)，進(jìn)而減輕子宮粘連，從而修復(fù)大鼠產(chǎn)后子宮復(fù)舊不全。

COX-2是一種前列腺素合成酶，被認(rèn)為是快速反應(yīng)基因，在正常情況下不表達(dá)，但在細(xì)胞受到各種刺激如炎癥介質(zhì)、生長因子、細(xì)胞因子、促癌劑等的誘導(dǎo)下迅速合成，參與炎癥過程和腫瘤的發(fā)生[13]，還參與介導(dǎo)PGI2和TXA2的生成，進(jìn)而調(diào)控凝血過程[14]。在子宮內(nèi)膜，COX-2高表達(dá)可能與局部血管生成、細(xì)胞的增生和抑制免疫監(jiān)督有關(guān)。在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，COX-2抑制劑可以減少細(xì)胞移動(dòng)、細(xì)胞黏附和腫瘤侵襲[15]。本研究結(jié)果顯示，產(chǎn)后子宮復(fù)舊不全大鼠子宮組織COX-2表達(dá)水平升高，經(jīng)益母草顆粒處理后，其子宮組織COX-2表達(dá)水平降低，表明COX-2參與修復(fù)子宮復(fù)舊不全過程，而益母草顆?？上抡{(diào)COX-2表達(dá)，促進(jìn)大鼠產(chǎn)后子宮的恢復(fù)。

綜上所述，益母草顆?？捎行Ц纳拼笫螽a(chǎn)后子宮復(fù)舊不全，其機(jī)制可能與抑制子宮組織COX-2、TGF-β1表達(dá)及降低血清TNF-α水平有關(guān)，與桃紅四物湯療效相當(dāng)。