穆洪云 ， 張儉偉

[1.江蘇農牧科技職業(yè)學院 ， 江蘇 泰州 225300 ； 2.勃林格殷格翰動物保健(上海)有限公司 ， 上海 靜安 200040]

在全球范圍內，蜱媒病不斷威脅著人類及犬的健康，包括我國在內，有著越來越多蜱媒病的病例。蜱蟲是多種疾病的傳播媒介，如巴貝斯蟲病、埃里希體病、無形體病、立克次體病、萊姆病等[1-2]。這些蜱媒病不僅嚴重危害犬的健康，同時還威脅著人類的生命安全。隨著氣候變暖和環(huán)境變化，以及新發(fā)和再發(fā)蜱媒病的出現，蜱媒病在國內外均已引起廣泛關注[3-4]。近幾年，在我國發(fā)現了多個人粒細胞無形體病及發(fā)熱伴血小板減少綜合征(Severe fever with thrombocytopenia syndrome,SFTS)病例，并出現了死亡病例，引起了人們越來越多的關注，也讓大家更加重視蜱及蜱媒病的預防，同時也需要更多關于蜱媒病的流行病學資料[5-7]。本調查以我國20個城市門診寵物犬為對象，進行犬常見蜱媒病的檢測，結合之前的蜱蟲種類及分布調查，以期為我國犬的蜱及蜱媒病防治提供基礎資料，為蜱媒病的正確預防提供一些思路。

1 材料與方法

1.1 血清樣本采集和處理 選定20個城市，每個城市中選擇3～5家寵物醫(yī)院，每家采集5～10份犬血液樣本，每只犬采集0.5～1.0 mL血液，分離血清，保存于-30 ℃?zhèn)溆茫鳂颖拘畔⒌怯浘幪枴?/p>

1.2 試劑與儀器 SNAP-4DX Plus檢測試劑盒，購自美國IDEXX公司；吉氏巴貝斯蟲人工感染的犬陽性血清、田鼠巴貝斯蟲人工感染的犬陽性血清和正常犬血清，均由中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所提供。血清檢測酶標儀為MOLECULAR DEVIECS，SPECTRA MAX M5。

1.3 犬的蜱媒病的檢測

1.3.1 犬感染萊姆病、無形體病和埃里希體病的檢測 按SNAP-4DX Plus檢測試劑盒說明書操作步驟進行檢測。簡述如下，取待測血清樣本約150 μL置于反應管中，加200 μL檢測試劑充分混合，混合物加入檢測裝置的樣本孔，30～60 s后樣本液到達激活孔，該孔一旦顯色，立即按下激活裝置，8 min后觀察結果。

1.3.2 犬感染吉氏巴貝斯蟲和田鼠巴貝斯蟲的血清學檢測 吉氏巴貝斯蟲的酶聯免疫吸附試驗(ELISA)方法參照參考文獻[8]建立的方法，包被抗原為大腸埃希菌重組表達的吉氏巴貝斯蟲P50抗原。

田鼠巴貝斯蟲的ELISA方法參照參考文獻[9-10]報道的方法，包被抗原為大腸埃希菌重組表達的田鼠巴貝斯蟲截短型分泌抗原(BmSA1)。

ELISA方法簡述：(1)用包被液將重組蛋白抗原稀釋至1 μg/mL，100 μL/孔，每一樣本做復孔，空白對照加GST 蛋白；(2)4 ℃，包被過夜；(3)傾去抗原液，用PBST洗滌3次，每次5 min，紙巾上拍干；(4)加封閉液，200 μL/孔，37 ℃，濕盒內封閉1 h；(5)傾去封閉液，用PBST洗滌，方法同上；(6)用PBST稀釋待檢血清(1∶100)，37 ℃，濕盒內溫育1 h；(7)傾去待檢血清，用PBST洗滌，方法同上；(8)用PBST將辣根過氧化物酶標記的二抗羊抗犬IgG 1∶4 000稀釋，100 μL/ 孔，37 ℃，濕盒內溫育1 h；(9)傾去二抗，用PBST洗滌，方法同上；(10)加入新配制的ABTS酶底物液，100 μL/孔，37 ℃，濕盒內避光反應30 min；(11)用酶標儀在波長415 nm處測OD值。選用相應的巴貝斯蟲感染的陽性血清和正常犬血清(陰性血清)作試驗對照，待測樣本OD值為復孔平均值減去GST對照孔平均值，其大于0.25判為陽性(30個正常犬血清平均OD值加上3倍標準誤)。

2 結果

2.1 樣本采集和制備 本調查中從我國20個主要城市采集樣本，涉及我國中東部16個省、直轄市，共采集到寵物犬血清562份，見表1。

表1 犬血清樣本采集和制備Table 1 Collection and preparation of blood samples from pet dogs

2.2 犬蜱媒病檢測

2.2.1 犬3種常見病的檢測 應用商業(yè)化SNAP-4DX Plus檢測試劑盒進行了萊姆病、無形體病和埃里希體病的檢測。對526份可檢測血清(562份樣本中有36份血清因分離量較少，不能檢測)的測定發(fā)現，萊姆病檢測到2份，感染率為0.38%；埃里希體病檢測到7份，感染率為1.33%；無形體病檢測到14份，感染率為2.66%。表明我國犬體均存在3種常見病，感染率較高的是無形體病和埃里希體病。來自上海、杭州等幾個城市的疾病種類較多、感染率較高，檢測結果見表2。

表2 萊姆病、埃里希體病和無形體病的血清學檢測Table 2 Serological tests for Lyme disease,ehrlichiosis and anaplasmosis

2.2.2 犬田鼠巴貝斯蟲和吉氏巴貝斯蟲病的檢測 對本次采集的全部血清樣本(562份)進行了檢測，結果如表3所示，寵物犬的田鼠巴貝斯蟲感染率為19.57%，吉氏巴貝斯蟲感染率為3.91%；20個城市中，除青島外，均有田鼠巴貝斯蟲感染，且感染率介于5.71%～60.00%，顯示了很高的感染程度；石家莊等8個城市樣本中未發(fā)現吉氏巴貝斯蟲陽性，其他12個城市感染率介于1.75%～16.67%，也顯示了普遍感染的特征。

表3 寵物犬田鼠巴貝斯蟲和吉氏巴貝斯蟲感染的ELISA檢測Table 3 ELISA detection of Babesia microti and Babesia gibsoni in pet dogs

3 討論

本項工作調查了我國20個主要城市寵物犬蜱媒病感染情況，采集了具有較多數量和地域代表性的樣本，是國內關于犬蜱媒病的一次系統(tǒng)調查，檢測了多種蜱媒病的流行情況，試驗結果可為國內寵物犬蜱蟲及蜱媒病的防控提供研究基礎，進而找到適合國內情況的蜱媒病的防控措施。

本調查中發(fā)現，我國寵物犬的常見蜱媒病中，犬埃里希體病、吉氏巴貝斯蟲病和無形體病陽性率較高，這與其他地方犬的情況相似。本調查中發(fā)現了2例萊姆病的病例，陽性率為0.38%，這與墨西哥的一項寵物犬萊姆病流行病學調查結果相近(陽性率為0.2%)，略低于韓國的一項針對于軍犬的流行病學調查(陽性率為1.1%)，但陽性率比英國(陽性率為4.5%～11.0%)和美國(陽性率為1.4%～11.6%)的幾項流行病學調查低很多[11-15]。我國自1986年首次發(fā)現東北林區(qū)人群中存在萊姆病的發(fā)生和流行以來[16],現已證實29個省(市、區(qū))的人群中存在萊姆病的感染,并從病原學上證實了其中至少有19個省(市、區(qū))存在該病的自然疫源地,人群中有萊姆病的發(fā)生和流行。目前國內有寵物犬的家庭越來越多，需要進一步研究并重視萊姆病等這些人獸共患病在寵物犬的流行病學情況。

本調查中，ELISA試驗結果表明寵物犬吉氏巴貝斯蟲的陽性率為3.91%，這與在華東地區(qū)的另一項調查結果基本一致(陽性率為3.47%)。犬巴貝斯蟲病是犬的一種重要的以蜱蟲為媒介的血液寄生蟲病，它的診斷和治療目前仍然是寵物臨床醫(yī)生面臨的巨大挑戰(zhàn)。由于蜱蟲分布范圍的擴大以及寵物犬在全球范圍的流動，導致犬巴貝斯蟲病不斷擴散。吉氏巴貝斯蟲一般是由血紅扇頭蜱、長角血蜱等蜱蟲傳播的。吉氏巴貝斯蟲是國內寵物臨床常見的血液寄生蟲病例，特別是在蜱蟲多發(fā)的區(qū)域，它可導致溶血性貧血和全身炎癥反應綜合征所導致的多器官功能障礙綜合征，嚴重時可導致患犬死亡[17-18]。ELISA調查結果顯示，20個城市中的12個發(fā)現了吉氏巴貝斯蟲陽性病例，其中福州、鄭州、廣州、深圳、西安和成都均發(fā)現2例及以上病例，結合臨床情況，這些地區(qū)應特別重視對吉氏巴貝斯蟲病的防控，特別需要寵物行業(yè)人員加強對寵主的教育，做好蜱蟲的防控。

本調查發(fā)現，寵物犬的田鼠巴貝斯蟲感染率為19.57%，分布于本調查的19個城市中。田鼠巴貝斯蟲病是一種人獸共患的寄生蟲病，1969年美國加利福尼亞州檢測到首例人感染田鼠巴貝斯蟲病例，至今已有數千例人感染巴貝斯蟲感染病例的報道，且有逐年遞增的趨勢，根據美國疾病控制與預防中心(CDC)調查數據顯示，僅在2011年，美國確診的人感染田鼠巴貝斯蟲病例就高達847例。其臨床癥狀范圍較廣，大部分患者為無癥狀感染，但一些特殊人群(如切除脾臟的人群、免疫低下患者和老年患者)則有致命危險[19]。一般情況下，田鼠巴貝斯蟲的儲存宿主是嚙齒類動物，本調查中雖然發(fā)現了大量的陽性病例，但關于犬是否是田鼠巴貝斯蟲的儲存宿主及對犬的危害還需要進一步研究來確認。

本調查發(fā)現，上海和杭州均檢測到了犬萊姆病、埃里希體病、無形體病、田鼠巴貝斯蟲病和吉氏巴貝斯蟲病這5種蜱媒病的陽性病例，可能與這2個城市蜱蟲的分布及寵物數量有關系，因此做好蜱蟲及蜱媒病的防控非常重要。寵物醫(yī)院是蜱蟲及蜱媒病防控的關鍵環(huán)節(jié)，需要寵物醫(yī)生及寵物行業(yè)的從業(yè)者重視蜱媒病的診斷及預防，進而去教育寵物主人，讓寵主意識到蜱蟲及蜱媒病的危害，只要寵主能夠按照寵物醫(yī)生的預防方案，每月進行驅蟲，就可最大程度預防某些蜱媒病的發(fā)生。