魏 雪，章如松，李 穎，馮翠云，張明超，夏秋媛，饒 秋，馬恒輝

活體供腎移植是終末期腎臟病(end-stage renal disease, ESRD)患者理想的治療手段。雖然活體供者在術(shù)前已按照相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行充分的臨床評(píng)估[1]，但在實(shí)際工作中仍然發(fā)現(xiàn)部分供者的腎存在不同程度的病理改變[2-3]，并且其病變程度與術(shù)后移植腎的腎功能恢復(fù)存在差異。供腎零點(diǎn)活檢(time-zero renal biopsy, TO-RBx)為供腎的取舍、分配及術(shù)后移植腎腎功能預(yù)后的判斷等，提供重要的組織病理學(xué)依據(jù)，是術(shù)前評(píng)估供腎質(zhì)量的重要手段[3]。為盡可能減少移植器官缺血時(shí)間、保證移植效果，快速病理診斷的意義重大?？焖倮鋬銮衅m然制片時(shí)間短，但組織結(jié)構(gòu)及細(xì)胞形態(tài)清晰程度一般，易出現(xiàn)人為假象，無法為切片質(zhì)量良好提供穩(wěn)定性。本科室在實(shí)際工作中反復(fù)摸索和實(shí)踐，利用HT-3超聲波快速組織處理儀對(duì)常規(guī)手工快速石蠟制片方法加以改進(jìn)，效果良好，現(xiàn)將這兩種技術(shù)方法的應(yīng)用與比較介紹如下。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本隨機(jī)選取2019年1月～2020年12月東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院國家腎臟疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心存檔的30例TO-RBx標(biāo)本，供者入選標(biāo)準(zhǔn)為自愿捐獻(xiàn)者，未見明顯捐獻(xiàn)禁忌證。其中男性13例，女性17例，平均年齡(45.87±6.93)歲。本實(shí)驗(yàn)獲我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1腎穿刺 TO-RBx標(biāo)本經(jīng)術(shù)前供腎獲取，常規(guī)灌洗，修整完畢后進(jìn)行，用16 G活組織檢查針在供腎下極負(fù)壓穿刺，獲取長(zhǎng)0.5～1.0 cm，直徑1 mm的腎組織1～2條，置于生理鹽水紗布，立即送檢。穿刺組織定位皮質(zhì)，以皮質(zhì)、髓質(zhì)交界區(qū)為分界線，將皮質(zhì)區(qū)2/3長(zhǎng)度定義為取材切割點(diǎn)，2/3皮質(zhì)區(qū)作為實(shí)驗(yàn)組用于制備超聲波處理快速石蠟切片；近髓質(zhì)1/3皮質(zhì)區(qū)與髓質(zhì)區(qū)共同作為對(duì)照組，用于制備手工快速石蠟切片。本組設(shè)定實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的依據(jù)：TO-RBx的主要觀察對(duì)象是腎小球及腎小管間質(zhì)病變。

1.2.2超聲波處理快速石蠟制片 (1)將腎組織浸泡于HT-3病理分析前處理專用試劑，開啟超聲波快速組織處理儀，加熱至55 ℃，處理2次，各15 min。(2)將組織(置于塑料包埋盒內(nèi))轉(zhuǎn)入加熱至62 ℃石蠟缸內(nèi)，開啟超聲波處理，浸蠟15 min。(3)石蠟包埋制成蠟塊，切取2 μm厚切片脫蠟水洗，分別行HE、PAS、PASM和Masson染色，封固，具體實(shí)驗(yàn)方法參考《臨床技術(shù)操作規(guī)范·病理學(xué)分冊(cè)》進(jìn)行[4]。

1.2.3手工快速石蠟制片 (1)將腎組織浸泡于10%中性福爾馬林中固定10 min。(2)梯度乙醇脫水：75%乙醇20 min，90%乙醇20 min，95%乙醇10 min，100%乙醇20 min。(3)用擦鏡紙將組織包好后，放入氯仿Ⅰ 10 min、氯仿Ⅱ 10 min。(4)石蠟Ⅰ 30 min，石蠟Ⅱ 30 min。(5)石蠟包埋制成蠟塊，切取2 μm厚切片脫蠟水洗，分別行HE、PAS、PASM和Masson染色[5]，封固。

1.3 結(jié)果判斷切片均由兩名副主任以上醫(yī)師采用雙盲法閱片，依次在顯微鏡下觀察腎小球、腎小管、間質(zhì)及血管等成分的變化并進(jìn)行評(píng)估。標(biāo)本以顯微鏡下見腎小球數(shù)>7個(gè)，至少存在2條動(dòng)脈，為活檢合格標(biāo)本[5]。

2 結(jié)果

2.1 HE染色實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組切片組織結(jié)構(gòu)均完整、細(xì)胞形態(tài)良好、層次分明，切片厚度均勻、平坦無折、無脫片。細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)染色對(duì)比清晰，色彩鮮艷、透亮、組織變性程度較輕(圖1)。

2.2 特殊染色實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組切片均能夠準(zhǔn)確顯示腎小球系膜、基膜等各種形態(tài)改變，多種組織成分對(duì)比鮮明。PAS染色示細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)、基膜及系膜基質(zhì)呈玫紅色(圖2)。PASM染色示細(xì)胞核呈藍(lán)色，基膜及系膜基質(zhì)呈黑色，免疫復(fù)合物呈紅色(圖3)。Masson染色示細(xì)胞核呈黑色，基膜及膠原纖維呈藍(lán)綠色，纖維蛋白、免疫復(fù)合物(類纖維素)呈桔紅色(圖4)。

2.3 超聲波處理快速石蠟制片實(shí)驗(yàn)組診斷結(jié)果：腎小球輕微病變10例(33.3%)，腎小球節(jié)段性硬化8例(26.7%)，腎小管急性損傷30例(100%)，腎小管萎縮(明確等級(jí)，輕～重)3例(10%)，血管玻璃樣變及硬化1例(3.3%)，間質(zhì)纖維化(明確等級(jí)，輕～重)1例(3.3%)，間質(zhì)炎癥(明確等級(jí)，輕～重)1例(3.3%)。

圖1 實(shí)驗(yàn)組(A)、對(duì)照組(B)的組織結(jié)構(gòu)均清晰、細(xì)胞形態(tài)完整、色彩明艷、背景干凈，HE染色 圖2 實(shí)驗(yàn)組(A)、對(duì)照組(B)基膜、腎小管基膜及系膜基質(zhì)均呈粉紅色，PAS染色 圖3 實(shí)驗(yàn)組(A)、對(duì)照組(B)基膜、腎小管基膜均呈黑色，PASM染色 圖4 實(shí)驗(yàn)組(A)、對(duì)照組(B)基膜均呈綠色，Masson染色

2.4 手工快速石蠟制片對(duì)照組診斷結(jié)果：腎小球輕微病變6例(20%)，腎小球節(jié)段性硬化5例(16.7%)，腎小管急性損傷28例(93.3%)，腎小管萎縮(明確等級(jí)、輕～重)3例(10%)，血管玻璃樣變及硬化1例(3.3%)，間質(zhì)纖維化(明確等級(jí)，輕～重)1例(3.3%)，間質(zhì)炎癥(明確等級(jí)、輕～重)1例(3.3%)。

2.5 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組對(duì)比分析實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組診斷結(jié)果為腎小球輕微病變的符合率為86.7%(26/30)，腎小球節(jié)段性硬化的符合率為90%(27/30)，腎小管急性損傷的符合率為93.3%(28/30)；腎小管萎縮、血管玻璃樣變及硬化、間質(zhì)纖維化及間質(zhì)炎的符合率均高達(dá)100%(30/30)。兩種制片方法腎穿刺組織中差異主要表現(xiàn)為腎小球病變的判讀，實(shí)驗(yàn)組腎小球血管襻開放及系膜僵硬更多見。兩種制片方法見腎小管上皮細(xì)胞隨缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，其損傷程度也相應(yīng)加重，兩者差異無顯著性。

3 討論

為盡可能減少移植器官冷缺血時(shí)間，以防加重腎缺血再灌注的損傷，故對(duì)供腎TO-RBx的制片速度及質(zhì)量要求非常嚴(yán)格。直接冷凍制片法制片時(shí)間較短，但制片質(zhì)量不能提供良好的穩(wěn)定性，故有可能影響病理診斷結(jié)果的判讀。手工快速石蠟制片法病理診斷結(jié)果相對(duì)準(zhǔn)確，但制片時(shí)間較長(zhǎng)(約3 h)。超聲波處理快速石蠟制片法，鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞形態(tài)完整，無明顯的收縮現(xiàn)象；具有較高的制片時(shí)效性和穩(wěn)定性，耗時(shí)僅約50 min。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)超聲波處理快速石蠟制片診斷與手工快速石蠟制片診斷結(jié)果基本相符。超聲波處理快速石蠟制片組織處理試劑的快速替代過程時(shí)間較短，易導(dǎo)致試劑替換不徹底，與手工快速石蠟制片相比，其更易表現(xiàn)為腎小球血管襻開放及系膜僵硬。無論采用何種制片方法，腎小管的形態(tài)學(xué)改變都是客觀存在的，因?yàn)楣┠I缺血導(dǎo)致腎小管急性損傷難以避免，會(huì)對(duì)診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性造成干擾，但多數(shù)情況下這些差異不明顯，且這些干擾因素也不是供腎移植取舍的決定因素[6]。

本科室已將超聲波處理快速石蠟制片技術(shù)應(yīng)用于胃腸鏡及穿刺類活檢組織標(biāo)本，其制片質(zhì)量與常規(guī)石蠟切片質(zhì)量差異較小，符合病理診斷的要求。其制作的切片應(yīng)用于免疫組化檢測(cè)組織內(nèi)多種抗原，特異性高；其應(yīng)用于分子生物學(xué)檢測(cè)，能較好地反應(yīng)核酸和蛋白。初步明確超聲波處理快速石蠟制片方法，可以制備高質(zhì)量的胃腸鏡及穿刺活檢組織蠟塊，免疫組化及基因檢測(cè)與常規(guī)石蠟切片處理方法結(jié)果一致。目前，超聲波處理快速石蠟制片技術(shù)已常規(guī)應(yīng)用于胃腸道及穿刺類活檢組織，而應(yīng)用于制備其它不同類型活檢組織及手術(shù)切除標(biāo)本還在不斷探索和創(chuàng)新中，具體的組織處理程序及時(shí)間還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

目前，國內(nèi)鮮有報(bào)道超聲波處理快速石蠟制片技術(shù)應(yīng)用于供腎TO-RBx的可行性研究。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)超聲波處理快速石蠟制片與手工快速石蠟制片HE染色及特殊染色結(jié)果一致，可應(yīng)用于臨床腎臟病理診斷，與何昌桓等[7]報(bào)道一致。HT-3超聲波快速石蠟制片在現(xiàn)有的技術(shù)上進(jìn)行改進(jìn)，其使用的病理分析前處理專用試劑是集固定、脫水和透明三種作用于一體，是以乙醇為主并加入多種生物組織保護(hù)劑的環(huán)保型混合試劑，不含甲醛、二甲苯等物質(zhì)，對(duì)人體無毒、無害，整個(gè)組織處理的過程只需重復(fù)使用混合試劑2次。其主要原理是利用超聲波強(qiáng)大的穿透性及非電離性作用，增加細(xì)胞的滲透性和溶劑分子的穿透力，增加試劑與組織間液體的擴(kuò)散、滲透和交換的頻率，從而縮短制片時(shí)間。處理的組織結(jié)構(gòu)清晰、核質(zhì)對(duì)比清楚、背景干凈；制片效果與手工快速石蠟制片接近，無明顯差異，且可以長(zhǎng)期保存，未見明顯理化形態(tài)改變，達(dá)到優(yōu)質(zhì)HE切片的制片要求[4]。本科室后期將進(jìn)一步分析比較超聲波處理快速石蠟制片所制備的腎組織蠟塊，其免疫組化以及基因檢測(cè)結(jié)果，與手工快速石蠟制片結(jié)果的符合率。