朱 清，唐明洋，黃園莉，張光輝，趙 艷

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其主要發(fā)病原因可能與長期的雌激素刺激有關(guān)[1-2]，而與雌激素關(guān)系緊密的白血病相關(guān)蛋白LRP16是從健康成人外周血淋巴細胞中克隆的基因，該基因在人類多種腫瘤細胞中高表達，且與雌二醇的調(diào)控有關(guān)[3-4]。短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA, shRNA)是可以克隆到表達載體并表達短的干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)的DNA分子，可根據(jù)靶向基因LRP16設(shè)計shRNA序列，并將其克隆到特定載體上[5]。本文旨在探討LRP16在子宮內(nèi)膜癌中的表達及其與臨床病理特征的關(guān)系；通過RNA干擾下調(diào)人子宮內(nèi)膜癌細胞株(Ishikawa, ISK)中LRP16基因的表達，分析其對子宮內(nèi)膜癌細胞增殖、侵襲和遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2015年1月～2016年12月蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科存檔的子宮內(nèi)膜癌組織160例，術(shù)后經(jīng)常規(guī)病理組織檢查證實均為雌激素依賴型(即子宮內(nèi)膜樣癌)；另選取60例正常子宮內(nèi)膜組織(為子宮內(nèi)膜活檢或其他良性疾病中獲取)作對照。本實驗經(jīng)蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.2 細胞株及主要試劑人子宮內(nèi)膜癌細胞株ISK、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒，購自上海吉瑪公司。LRP16-shRNA表達載體(Santa Cruz Biotechnology, Inc.sc-149046-SH)；DMEM(高)培養(yǎng)液、胎牛血清(Hyclone)、PBS平衡液；LRP16抗體(Abcam公司、ab122688)；β-actin抗體(Abcam公司、ab8229)。Lipofectamine 2000、Trizol試劑，購自Invitrogen公司。CCK-8試劑、Transwell小室，購自上海碧云天公司。結(jié)合基質(zhì)膠Matrigel購自BD公司。

1.3 方法

1.3.1免疫組化 標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定，連續(xù)4 μm厚切片，脫蠟，免疫組化采用EliVision染色。切片在檸檬酸鹽溶液中121 ℃ 3 min進行抗原修復(fù)，自然冷卻后在3%H2O2溶液中靜置10 min，添加一抗LRP16兔抗人60 ℃ 1 h，PBS沖洗3次×3 min，二抗37 ℃ 30 min，PBS沖洗后DAB顯色，蘇木精復(fù)染后經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，鏡下觀察。結(jié)果以胞質(zhì)或胞核內(nèi)出現(xiàn)黃色顆粒為陽性信號，對細胞染色強度和陽性細胞百分比進行綜合評分[6]。使用Image-Pro Plus軟件進行圖像分析，以累積光密度(integrated optical density， IOD)/面積值判斷LRP16蛋白的表達。

1.3.2細胞培養(yǎng) 在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)ISK細胞，細胞貼壁生長。每2～3天傳代1次。傳代時先棄去舊培養(yǎng)基，用PBS洗滌2～3次，加入胰蛋白酶消化細胞，加入培養(yǎng)基吹打細胞，重置細胞液接種于培養(yǎng)瓶。實驗選取對數(shù)生長期的細胞。

1.3.3shRNA干擾載體構(gòu)建 shRNA序列：siLRP16組：5′-GATCCCGCAGCGGGAGGAACATTACT TCAAGAGAGTAATGTTCCTCCCGCTGCTTTTTTGGAA A-3′；對照組：5′-AGCTTTTCCAAAAAAGCAGCGG GAGGAACATTACTCTCTTGAAGTAATGTTCCTCCCGC TGCGG-3′。

1.3.4細胞轉(zhuǎn)染及分組 將ISK細胞按3×105個/孔接種于6孔板，待細胞密度達70%～80%時按Lipofectamine 2000試劑說明書進行轉(zhuǎn)染，孵育48 h，將siLRP16(50 nmol/L)轉(zhuǎn)染入ISK細胞。轉(zhuǎn)染4 h后換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。實驗分組：實驗組(轉(zhuǎn)染siLRP16)、陰性對照組(轉(zhuǎn)染無序RNA)、空白對照組(不轉(zhuǎn)染)。

1.3.5Western blot法 轉(zhuǎn)染后48 h收集各組細胞提取的蛋白，經(jīng)10%聚丙烯胺凝膠分離。制備分離膠和積層膠，每孔加入等量蛋白樣本電泳和封閉。將膜置于一抗(LRP16稀釋比為1 ∶200；β-actin稀釋比為1 ∶500)中，振蕩2 h后放置4 ℃冰箱過夜；放入TBST溶液中洗膜3次×10 min，在二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，稀釋比為1 ∶2 000)中溫和振蕩2 h，置于TBST溶液中洗膜3次×10 min。加入化學(xué)發(fā)光底物A+B，用凝膠成像儀掃描入計算機，結(jié)果用Quantity One軟件分析，以LRP16蛋白與β-actin蛋白條帶平均值的比值表示，實驗重復(fù)3次。

1.3.6RT-PCR 細胞轉(zhuǎn)染后48 h，用Trizol試劑提取各組細胞總RNA，用紫外分光光度計定量。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)取5 μg總RNA進行。LRP16基因引物序列：上游5′-CCGCAGCGACATCACCAAGC-3′，下游5′-TCCGGCACTCGTCGGTAAGC-3′；β-actin引物序列：上游5′-AAAGACCTGTACGCCAACAC-3′，下游5′-GTCATACTCCTGCTTGCTGAT-3′。PCR擴增反應(yīng)后取5 μL PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳30 min，在紫外燈下觀察DNA條帶，并用凝膠圖像處理系統(tǒng)進行拍照、灰度值分析。

1.3.7CCK-8實驗 選取對數(shù)生長期的細胞，將細胞密度調(diào)整為每毫升5×104個細胞，接種于96孔板中，每孔中放置150 μL細胞液孵育24 h后轉(zhuǎn)染，分別于24、48、72、96、120 h向各孔內(nèi)加入20 μL的CCK-8試劑繼續(xù)培養(yǎng)6 h。在450 nm處用酶標(biāo)儀測定各孔的光密度(optical density, OD)值，實驗重復(fù)3次。

1.3.8Transwell細胞侵襲和遷移實驗 侵襲實驗：將每孔50 μL結(jié)合基質(zhì)膠均勻地鋪在Transwell小室膜上，各組細胞轉(zhuǎn)染48 h后將細胞消化成細胞懸液，細胞密度調(diào)整為每毫升4×105個細胞，將Transwell小室中200 μL細胞懸液置于24孔板培養(yǎng)基中，24 h后取出Transwell小室，用棉簽擦拭濾膜上層細胞經(jīng)甲醇固定20 min，0.1%結(jié)晶紫溶液染色20 min，于顯微鏡下計數(shù)每膜15個隨機視野下透過膜的細胞數(shù)平均值，每組設(shè)3個小室，實驗重復(fù)3次。遷移實驗Transwell小室膜上不鋪結(jié)合基質(zhì)膠，其余步驟同侵襲實驗。

2 結(jié)果

2.1 子宮內(nèi)膜癌和正常子宮內(nèi)膜組織中LRP16蛋白的表達LRP16蛋白主要定位于細胞質(zhì)或細胞核。免疫組化結(jié)果顯示，正常子宮內(nèi)膜組織中細胞質(zhì)或細胞核內(nèi)陽性減弱甚至陰性，子宮內(nèi)膜癌組織中細胞質(zhì)或細胞核呈陽性，正常子宮內(nèi)膜組織中LRP16蛋白陽性率為13.33%(8/60)，子宮內(nèi)膜癌組織中LRP16蛋白的陽性率為86.25%(138/160)，兩組相比差異有顯著性(P<0.01，圖1)。

圖1 A.LRP16在正常子宮內(nèi)膜組織中呈陰性，EliVision法；B.LRP16在子宮內(nèi)膜癌組織中呈陽性，EliVision法

2.2 子宮內(nèi)膜癌中LRP16表達與臨床病理特征的關(guān)系本組結(jié)果顯示：子宮內(nèi)膜癌中LRP16表達與組織學(xué)分級、FIGO分期、肌層浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)：FIGO分期越晚(Ⅰ+Ⅱ：79.45%、Ⅲ+Ⅳ：91.95%)、肌層浸潤越深(≤1/2肌層：80.00%、>1/2肌層：91.11%)、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：76.00%、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：90.91%)的子宮內(nèi)膜癌中LRP16蛋白的陽性率越高；LRP16表達與患者年齡無關(guān)(表1)。

2.3 Western blot法檢測LRP16蛋白表達與正常子宮內(nèi)膜組織相比，子宮內(nèi)膜癌中LRP16蛋白表達明顯增高(圖2)，兩組相比差異有顯著性(P<0.01)。細胞轉(zhuǎn)染后48 h，實驗組與空白對照組和陰性對照組相比，LRP16蛋白表達明顯增加，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=15.38，P<0.01，圖3)。

2.4 RT-PCR檢測LRP16 mRNA表達細胞轉(zhuǎn)染后48 h，實驗組LRP16 mRNA表達水平與陰性對照組和空白對照組比較均明顯降低，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=521.36，P<0.01，圖4)。

表1 子宮內(nèi)膜癌中LRP16表達與臨床病理特征的關(guān)系

圖2 Western blot法檢測LRP16蛋白在不同子宮內(nèi)膜組織中的表達

圖3 Western blot法檢測ISK細胞轉(zhuǎn)染前后LRP16蛋白的表達

圖4 RT-PCR檢測LRP16 mRNA的表達：與實驗組比較，**P<0.01

2.5 轉(zhuǎn)染siLRP16對子宮內(nèi)膜癌細胞增殖的影響CCK-8檢測結(jié)果顯示，ISK細胞siLRP16轉(zhuǎn)染后24、48、72、96、120 h的抑制率分別為4.8%、16.4%、38.1%、44.5%和 52.6%，與陰性對照組相比，實驗組細胞增殖減慢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖5)。

圖5 CCK-8實驗檢測轉(zhuǎn)染siLRP16對ISK細胞增殖的影響

2.6 轉(zhuǎn)染siLRP16對子宮內(nèi)膜癌細胞侵襲和遷移的影響Transwell小室實驗顯示，實驗組與空白對照組和陰性對照組相比，細胞的侵襲和遷移能力均明顯降低。侵襲實驗結(jié)果顯示，實驗組穿過基膜的細胞數(shù)量為41.0±6.5，與空白對照組(115.2±6.9)和陰性對照組(117.3±5.4)相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖6)。遷移實驗結(jié)果顯示，實驗組穿過基膜的細胞數(shù)量為54.3±6.9，與空白對照組(176.2±5.6)和陰性對照組(125.8±2.6)相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖6)。

3 討論

將子宮內(nèi)膜癌根據(jù)與雌激素受體的關(guān)系分為兩種類型[7]：(1)非雌激素依賴性，常發(fā)生于萎縮的內(nèi)膜上，多見于老年絕經(jīng)后女性；(2)雌激素依賴性，常發(fā)生于年輕、圍絕經(jīng)期婦女，長期無拮抗的雌激素刺激可能是其主要發(fā)病因素，常由不典型增生發(fā)展而來[8]。因此，尋找新的雌激素相關(guān)靶基因及其生物學(xué)功能的研究，在分子水平上對子宮內(nèi)膜癌的研究具有重要的診斷和治療價值。

LRP16基因是1999年解放軍總醫(yī)院采用限制性標(biāo)記基因組掃描及cDNA末端快速擴增技術(shù)發(fā)現(xiàn)的新的人類基因[9-10]。該基因cDNA全長980 bp。基因表達的高通量序列分析表明，該基因在人類多種腫瘤細胞中的表達水平明顯高于其正常組織，尤其是雌激素依賴性腫瘤中高表達。研究發(fā)現(xiàn)LRP16基因是雌激素信號通路上的核蛋白因子應(yīng)答基因，與雌激素依賴性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[11]。雖然LRP16的組成序列己經(jīng)明確，但在其功能調(diào)控以及在人體的作用研究尚少，本實驗著重探討LRP16基因調(diào)控子宮內(nèi)膜癌增殖和侵襲、轉(zhuǎn)移的規(guī)律，以促進腫瘤病因?qū)W的發(fā)展。

為探討LRP16對子宮內(nèi)膜癌生物學(xué)功能是否具有調(diào)控作用，本實驗檢測LRP16在子宮內(nèi)膜癌及正常子宮內(nèi)膜組織中的表達。免疫組化檢測結(jié)果顯示：LRP16蛋白在子宮內(nèi)膜癌中的表達(86.25%)明顯高于正常子宮內(nèi)膜組織(13.33%)，兩者相比差異有顯著性(P<0.01)，提示LRP16蛋白的陽性率隨著子宮內(nèi)膜組織向癌組織進展明顯增加。本組還采用Western blot及RT-PCR檢測驗證了該結(jié)果；且LRP16表達與子宮內(nèi)膜癌組織學(xué)分級、FIGO分期、肌層浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)，也提示LRP16 mRNA與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展明顯相關(guān)。CCK-8檢測LRP16 mRNA被干擾前、后子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖情況，結(jié)果顯示與陰性對照組相比較，LRP16 mRNA被干擾后子宮內(nèi)膜癌細胞倍增時間明顯延長。Transwell小室實驗?zāi)苣M腫瘤細胞消化基質(zhì)，并穿越屏障侵襲遷移的過程。實驗結(jié)果顯示LRP16 mRNA被干擾后，能夠穿越屏障的實驗組細胞與陰性對照組相比較明顯減少，這表明子宮內(nèi)膜癌細胞侵襲和遷移能力受到抑制，說明LRP16 mRNA與子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖和侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

圖6 轉(zhuǎn)染siLRP16對ISK細胞侵襲和遷移能力的影響

本組發(fā)現(xiàn)LRP16基因表達與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，圍繞LRP16基因的各種基因檢測、干預(yù)方法將成為強有力的生物學(xué)檢測工具，對子宮內(nèi)膜癌高危人群的篩查、合理治療、預(yù)后評估及隨訪有指導(dǎo)意義。LRP16基因相關(guān)靶基因和信號通路影響子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展的確切機制，還有待進一步研究。