張會(huì)芳，宋婷婷，安 杰，楊 月，韓玉貞

腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment, TME)由腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞及基質(zhì)等構(gòu)成，在腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。腫瘤細(xì)胞激活形成的癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer-associated fibroblasts, CAF)是乳腺癌組織中的主要間質(zhì)細(xì)胞，可分泌多種細(xì)胞因子促進(jìn)乳腺癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。許多研究表明，乳腺癌細(xì)胞中TGF-β1和p53的表達(dá)與乳腺癌預(yù)后有相關(guān)性[1-2]。目前，兩者在乳腺癌間質(zhì)中的表達(dá)研究較少，且有關(guān)TGF-β1和p53在乳腺原發(fā)癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌間質(zhì)中的相關(guān)性國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。因此，本文著重探討乳腺原發(fā)癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌間質(zhì)中TGF-β1和p53的表達(dá)及預(yù)后價(jià)值，以提高臨床與病理醫(yī)師的認(rèn)識(shí)水平。

1 材料與方法

1.1 材料收集2011年1月～2016年12月濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的非特殊型浸潤(rùn)性乳腺癌160例，其有完整的隨訪資料，包括患者年齡、腫塊直徑、組織學(xué)分級(jí)、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)個(gè)數(shù)、ER、PR、HER-2、Ki-67的表達(dá)。患者均為女性，術(shù)前均未接受新輔助治療。隨訪截至2020年6月或患者死亡，中位隨訪時(shí)間為58個(gè)月。

1.2 方法采用免疫組化EnVision法染色。TGF-β1抗體購(gòu)于博奧森公司，p53抗體和二抗購(gòu)于北京中杉金橋公司。標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，將切片置于64 ℃烤箱中烘烤1 h，脫蠟至水，高溫高壓法修復(fù)抗原后晾涼，3%H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶，加入一抗TGF-β1(稀釋比1 ∶200)及p53(稀釋比1 ∶200)抗體4 ℃過夜，放置37 ℃恒溫箱中復(fù)溫30 min，PBS水洗后加二抗37 ℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，1%鹽酸乙醇分化，脫水透明，中性樹膠封固。以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照，以已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判斷腫瘤間質(zhì)的評(píng)判范圍參考文獻(xiàn)報(bào)道[3-4]等的標(biāo)準(zhǔn)，原發(fā)癌中評(píng)判為浸潤(rùn)性癌區(qū)域的腫瘤間質(zhì)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中選取被腫瘤細(xì)胞和腫瘤間質(zhì)侵占區(qū)域的腫瘤間質(zhì)，且選取視野四周均有腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)的區(qū)域。隨機(jī)觀察10個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)間質(zhì)陽(yáng)性細(xì)胞的平均值。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞著色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比進(jìn)行判斷：(1)根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞著色強(qiáng)度評(píng)分：未著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕褐色為3分；(2)陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分：<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。兩項(xiàng)得分結(jié)果相加：0～3分為陰性，4～7分為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 25.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用列聯(lián)系數(shù)法計(jì)算相關(guān)性；應(yīng)用Kaplan-Meier法繪制生存曲線并結(jié)合Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行生存過程的比較。采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行單因素和多因素分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺原發(fā)癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌間質(zhì)中TGF-β1和p53的表達(dá)TGF-β1在間質(zhì)CAF中的表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)(圖1A、B)，p53在間質(zhì)CAF中的表達(dá)定位于細(xì)胞核(圖1C、D)。TGF-β1和p53在乳腺原發(fā)癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌間質(zhì)中，表達(dá)的一致率均為87.5%。在乳腺原發(fā)癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌之間，間質(zhì)中TGF-β1的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.603，P<0.001，表1)，間質(zhì)中p53的表達(dá)也呈正相關(guān)(r=0.604，P<0.001，表2)。

圖1 A.TGF-β1在原發(fā)癌間質(zhì)中呈陽(yáng)性，EnVision法；B.TGF-β1在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌間質(zhì)中呈陽(yáng)性，EnVision法；C.p53在原發(fā)癌間質(zhì)中呈陽(yáng)性，EnVision法；D.p53在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌間質(zhì)中呈陽(yáng)性，EnVision法

表1 乳腺原發(fā)癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌間質(zhì)中TGF-β1的表達(dá)

表2 乳腺原發(fā)癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌間質(zhì)中p53的表達(dá)

2.2 乳腺癌患者預(yù)后的Cox單因素與多因素分析Cox單因素分析結(jié)果顯示：腫塊直徑(P=0.002)、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)個(gè)數(shù)(P<0.001)、ER、PR、HER-2的表達(dá)(P均<0.05)、原發(fā)癌和轉(zhuǎn)移癌間質(zhì)中p53的表達(dá)(P均<0.05)，均是患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。Cox多因素分析結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)個(gè)數(shù)(HR=3.267，95%CI：1.870～5.707)、HER-2的表達(dá)(HR=1.938，95%CI：1.161～3.233)、原發(fā)癌間質(zhì)中p53的表達(dá)(HR=4.118，95%CI：1.504～11.273)，均是患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P均<0.05，表3)。

2.3 TGF-β1和p53的間質(zhì)表達(dá)及預(yù)后分析Kaplan-Meier生存曲線結(jié)合Log-rank檢驗(yàn)顯示：在乳腺原發(fā)癌和相應(yīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌間質(zhì)中，TGF-β1的表達(dá)與預(yù)后無關(guān)(P均>0.05，圖2A、B)；p53陽(yáng)性患者的生存率低于陰性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05，圖2C、D)。在乳腺原發(fā)癌和相應(yīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌間質(zhì)中，TGF-β1陽(yáng)性和p53陰性組患者的預(yù)后好于TGF-β1和p53均陽(yáng)性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05，表4，圖2E、F)。

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，TME在乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。TME是指腫瘤存在的微環(huán)境，包括周圍的免疫細(xì)胞、血管、細(xì)胞外基質(zhì)、成纖維細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、骨髓衍生的炎癥細(xì)胞和信號(hào)分子等，具有營(yíng)養(yǎng)支持、免疫逃避、促進(jìn)轉(zhuǎn)移等作用。CAF是TME的重要組成部分，具有多種功能，包括基質(zhì)沉積和重塑以及與癌細(xì)胞的廣泛相互信號(hào)作用。

TGF-β1在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中，由最初的抑癌作用逐漸發(fā)展為促癌作用。在多數(shù)乳腺癌和其轉(zhuǎn)移灶中，TGF-β1從抑癌作用到促癌作用的轉(zhuǎn)化均與磷酸化的Smad2呈正相關(guān)，Smad通路是TGF-β1信號(hào)通路中的重要途徑。癌細(xì)胞分泌的TGF-β1有助于CAF的激活和增殖[5]，其在間質(zhì)中的表達(dá)與CAF呈正相關(guān)[6]。在乳腺癌中CAF也可分泌TGF-β1，并激活乳腺癌細(xì)胞中的TGF-β1/Smad信號(hào)通路，誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲性表型[7]，而抑制TGF-β1信號(hào)傳導(dǎo)可以減少CAF誘導(dǎo)的腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[8]，TGF-β1可以維持CAF活性狀態(tài)，也是CAF促進(jìn)乳腺癌惡化所必需的[9]。此外，對(duì)前列腺癌[10-11]、結(jié)直腸癌[12]、胃癌[13]等相關(guān)性研究中發(fā)現(xiàn)CAF中TGF-β1信號(hào)的激活與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移也密切相關(guān)。也有研究表明，腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)TGF-β1和TGF-βⅡ型受體的乳腺癌患者有更長(zhǎng)的無瘤生存期和總生存期[14]，也有研究發(fā)現(xiàn)血液中TGF-β1含量升高的乳腺癌患者有更好的預(yù)后和更少的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[15]。另有研究發(fā)現(xiàn)，CAF中TGF-β1的表達(dá)在乳腺原發(fā)癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中具有較好的相關(guān)性[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：TGF-β1在乳腺原發(fā)癌及相應(yīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌間質(zhì)中的表達(dá)呈正相關(guān)，但無論是乳腺原發(fā)癌還是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌，均未顯示間質(zhì)中TGF-β1的表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)。因此，有關(guān)TGF-β1的表達(dá)，尤其間質(zhì)中TGF-β1的表達(dá)與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系有待進(jìn)一步分析。

圖2 Kaplan-Meier生存曲線分析乳腺癌患者的預(yù)后：乳腺原發(fā)癌(A)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌(B)間質(zhì)中TGF-β1的表達(dá)與生存期的關(guān)系；乳腺原發(fā)癌(C)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌(D)間質(zhì)中p53的表達(dá)與生存期的關(guān)系；乳腺原發(fā)癌(E)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌(F)間質(zhì)中TGF-β1和p53的不同表達(dá)與生存期的關(guān)系

人類腫瘤50%以上有p53基因的突變，有研究表明p53的高表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌[17]和肝細(xì)胞癌[18]的預(yù)后不良相關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道p53的高表達(dá)是乳腺癌預(yù)后差的重要因素[19]。乳腺癌間質(zhì)中也存在p53的表達(dá)，且與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)[20-21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在乳腺原發(fā)癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌之間，間質(zhì)p53的表達(dá)呈正相關(guān)，且無論原發(fā)癌還是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌，p53的間質(zhì)表達(dá)均與預(yù)后不良相關(guān)，原發(fā)癌間質(zhì)p53的表達(dá)是判斷預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

許多研究表明，乳腺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移后，轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞仍保留原發(fā)癌細(xì)胞產(chǎn)生某些基因、蛋白的特性，如ER、HER-2等表現(xiàn)為高度的一致性[22]。一般認(rèn)為，原發(fā)癌中的CAF是正常纖維母細(xì)胞增生活化而來，與癌細(xì)胞不同，轉(zhuǎn)移癌間質(zhì)中的CAF不是轉(zhuǎn)移而來，而是由轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞周圍的纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來。本課題組前期對(duì)乳腺癌腫瘤間質(zhì)比(tumor-stroma ratio, TSR)的研究表明，原發(fā)癌與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中的TSR存在高度一致性[4]。目前，有關(guān)轉(zhuǎn)移癌間質(zhì)中CAF的TGF-β1和p53表達(dá)尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在乳腺原發(fā)癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中，TGF-β1和p53的間質(zhì)表達(dá)呈正相關(guān)，兩者在乳腺原發(fā)癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌間質(zhì)中的表達(dá)呈高度的一致性。這可能是由于原發(fā)癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞有相似的特性，而導(dǎo)致間質(zhì)TGF-β1和p53表達(dá)一致，具體機(jī)制有待進(jìn)一步分析。

TGF-β1調(diào)節(jié)信號(hào)通路中某些促癌基因的轉(zhuǎn)錄激活需要突變型p53基因的參與，突變型p53基因?qū)GF-β1信號(hào)通路有激活和加強(qiáng)作用，兩者在腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過程中有密切聯(lián)系[23-24]。在乳腺癌中TGF-β1的高表達(dá)促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展，如發(fā)生p53的突變，其促進(jìn)作用會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)[25]。其在間質(zhì)中是否具有同樣的作用，尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在乳腺原發(fā)癌和相應(yīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌間質(zhì)中，TGF-β1和p53均陽(yáng)性組與TGF-β1陽(yáng)性、p53陰性組相比，前者預(yù)后較差；提示在乳腺原發(fā)癌和相應(yīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌間質(zhì)中，TGF-β1和p53的作用與乳腺癌細(xì)胞相似，間質(zhì)CAF中p53基因突變可以促進(jìn)TGF-β1信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)乳腺癌的進(jìn)展。

表3 乳腺癌預(yù)后Cox危險(xiǎn)因素分析

表4 TGF-β1和p53的間質(zhì)表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系