吳學(xué)敏 汪翊靈 陳如敬 陳秋勇 王隆柏 車勇良 嚴(yán) 山 劉玉濤 周倫江＊

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/福建省畜禽疫病防治工程技術(shù)研究中心 福州 350013；2.閩侯縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局畜牧獸醫(yī)站 福建閩侯 350100）

偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）是一種神經(jīng)性皰疹病毒，可感染多種哺乳動(dòng)物，包括反芻動(dòng)物、食肉動(dòng)物和嚙齒動(dòng)物，導(dǎo)致易感動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病[1-2]。豬是PRV的天然宿主，偽狂犬?。≒seudorabies，PR）對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害性大，具有高度隱性感染的特點(diǎn)，可引起持續(xù)性感染，特別是耐過的母豬呈長期帶毒生產(chǎn)[3]。2011年以來，我國許多規(guī)模化豬場(chǎng)暴發(fā)了PR，主要表現(xiàn)為豬群PRV-gE抗體陽性率顯著升高，普遍出現(xiàn)母豬流產(chǎn)、仔豬神經(jīng)癥狀和病死率高等臨床情況，近幾年還相繼發(fā)現(xiàn)免疫PR疫苗的養(yǎng)豬場(chǎng)發(fā)生偽狂犬病，并分離到新的PRV流行毒株[4-6]，相關(guān)研究表明，新分離的PRV毒株出現(xiàn)了變異，而經(jīng)典毒株的疫苗未能完全保護(hù)新型強(qiáng)毒力PRV的感染[7-10]。PRV已發(fā)現(xiàn)16種囊膜蛋白，其中11種功能性囊膜蛋白，gD（US6）為糖基化蛋白，是PRV的主要免疫原之一，在病毒感染細(xì)胞至復(fù)制生長過程中起著重要的作用，也最先被機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別引起免疫應(yīng)答[11-12]。研究表明，gD蛋白抗體是主要中和抗體之一，能夠充分中和PRV，且不存在補(bǔ)體時(shí)也能有效中和[13]。本研究對(duì)福建省閩侯縣發(fā)生疑似PR的豬場(chǎng)進(jìn)行PRV分離鑒定，再對(duì)新分離PRV毒株gD基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過測(cè)序比對(duì)分析，探究豬偽狂犬病病毒gD基因的遺傳進(jìn)化規(guī)律，為PR預(yù)防和控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與病毒 PK-15細(xì)胞由本研究室保存，用于病毒分離和傳代培養(yǎng)；偽狂犬病病毒參考毒株Fa株由本研究室保存。

1.2 病料與病毒分離 從福建省閩侯縣某豬場(chǎng)采集疑似PRV感染豬的腦、肺、脾臟和肝臟組織，參考文獻(xiàn)[7]的方法，處理病料并接種于PK-15細(xì)胞，將發(fā)生病變的細(xì)胞傳至3～4代，待細(xì)胞70%發(fā)生病變時(shí)收獲病毒液，凍存于-80℃，備用。

1.3 主要試劑 病毒核酸提取試劑盒、PCR擴(kuò)增高保真酶Mix、GC Buffer等均購自北京全式金公司；DMEM培養(yǎng)基和胰酶購自HyClone公司；犢牛血清購自杭州四季青公司；瓊脂糖、10×TAE緩沖液購自北京索萊寶公司。

1.4 引物設(shè)計(jì)合成 參考GenBank中PRV基因序列（NC_006151），設(shè)計(jì)擴(kuò)增gE基因保守序列的引物和gD基因的引物，序列分別為gE-F：5'-AACTATGGCATGACCGCCAA-3'，gE-R：5'-GTGGAGAAGAAGAGTCCGGC-3'；引物gD-F：5'-ATGATGATGGTGGCGCGCGAC-3'，gD-R：5'-TTATTGTTCTTCTGCGATGGTGGCGAG-3'。引物由鉑尚生物技術(shù)公司合成，兩對(duì)引物預(yù)計(jì)擴(kuò)增的片段大小分別為612 bp和1 100 bp。

1.5 PCR檢測(cè)鑒定 按照病毒核酸提取試劑盒說明書提取組織上清液和病毒培養(yǎng)液的病毒DNA作為模板，以Fa株的核酸作為陽性對(duì)照，用gE引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳觀察鑒定。

1.6 gD基因擴(kuò)增 以分離的病毒DNA為模板，用gD引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃復(fù)性45 s，72℃延伸45 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束，取5μL于1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果，并將目的條帶膠回收，送上海鉑尚生物技術(shù)公司測(cè)序。

1.7 gD基因序列及氨基酸序列分析 將測(cè)序結(jié)果用DNAStar軟件中SeqBulider程序推導(dǎo)對(duì)應(yīng)的氨基酸序列，挑選GenBank中登錄的具有代表性的15個(gè)毒株使用MEGA 5.05和MegAlign軟件進(jìn)行同源性比對(duì)分析，并構(gòu)建遺傳進(jìn)化分析樹，探究它們的親緣關(guān)系。選取的毒株為Fa株（AY196984）、Min-A株（AY169694）、La株（AY174090）、SA215株（DQ367438）、FZ株（EF645837）、TJ株（KJ789182）、LC株（MF434034）、FJ-Y21株（MK922107）、HNXY株（MN003373）、Anhui-ZJ1株（MK922121）、Kaplan株（AJ271966）、Becker株（AY368490）、NiA3株（KU900059）、Yangsan株（AY217094）和疫苗毒Bartha株（KY398733）。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒分離鑒定 于PK-15細(xì)胞上穩(wěn)定傳代的病毒，待接種48 h后可見細(xì)胞變圓，出現(xiàn)合胞體，約70%細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)收起，進(jìn)行PCR檢測(cè)鑒定，以Fa株作為陽性對(duì)照，結(jié)果見圖1，分離到的病毒與陽性對(duì)照在600 bp處出現(xiàn)明顯條帶，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，與GenBank中PRV-gD基因序列一致，表明分離的病毒為PRV，命名為FJMH1907b。

圖1 PCR鑒定電泳圖

2.2 gD基因擴(kuò)增結(jié)果 以分離的病毒FJMH1907b株和Fa株核酸為模板，PCR擴(kuò)增gD基因，結(jié)果見圖2，均在1 100 bp處出現(xiàn)預(yù)期條帶，將條帶回收送檢測(cè)序。

圖2 gD基因PCR擴(kuò)增電泳圖

2.3 gD核苷酸序列比對(duì)分析 將FJMH1907b株gD基因片段擴(kuò)增測(cè)序結(jié)果，與GenBank中收錄的15株P(guān)RV對(duì)應(yīng)核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，由構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹可見，新分離FJMH1907b毒株與國外Kaplan毒株及疫苗毒Bartha株不屬于一個(gè)大的分支上，與國內(nèi)FJ-Y21株、Anhui-ZJ1株、LC株及TJ株同屬一個(gè)小分支上（見圖3）。

圖3 PRV-gD基因核苷酸序列遺傳進(jìn)化樹

2.4 gD基因推導(dǎo)氨基酸序列比較 將gD基因推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行比較分析，結(jié)果顯示（見圖4）推導(dǎo)出對(duì)應(yīng)氨基酸共369aa，差異較大的區(qū)域集中在aa278～aa282，存在連續(xù)氨基酸缺失或增加，另aa287、aa341存在A-V和P-Q互換；部分毒株個(gè)別氨基酸也存在突變，主要變化有A105V、I121V、R276K、F323L、S355P，其中疫苗毒Bartha株的aa81存在N突變成S，新分離FJMH1907b株的aa271存在R突變成Q。

圖4 gD基因推導(dǎo)氨基酸序列比較

2.5 gD基因推導(dǎo)氨基酸序列比對(duì)分析 將gD基因推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹顯示（見圖5），與核苷酸序列的比對(duì)結(jié)果相似，新分離FJMH1907b毒株處于相對(duì)獨(dú)立分支，與國外Kaplan毒株及疫苗毒Bartha株不屬于一個(gè)大的分支上，與國外Becker毒株、NiA3株也不在一個(gè)分支上，與國內(nèi)Fa株、FZ株、FJ-Y21株、Anhui-ZJ1株、LC株及TJ株同屬一個(gè)較小分支上。

圖5 PRV-gD氨基酸序列遺傳進(jìn)化樹

2.6 gD氨基酸同源性比較分析 根據(jù)推測(cè)的氨基酸序列，采用MAGE軟件比對(duì)獲得PRV gD蛋白氨基酸同源性比對(duì)矩陣，結(jié)果顯示（見圖6）：新分離FJMH1907b毒株與其它參考毒株的同源性為87.7%～100%，與國外毒株的同源性為87.7%～99.7%，其中與疫苗毒Bartha株的同源性僅87.7%、韓國Yangsan株為99.7%；與國內(nèi)Fa株、FJ-Y21株、TJ株、Anhui-ZJ1株及LC株同源性為100%。

圖6 gD氨基酸序列同源性矩陣

3 討 論

PRV為線性雙股DNA病毒，基因全長約150 kb，其中G+C含量高達(dá)73%，編碼的囊膜蛋白中有11種是糖偶聯(lián)蛋白，包括gL、gH、gB、gC、gN、gD、gI和gE蛋白等，大部分與病毒的入侵感染和復(fù)制生長增殖密切相關(guān)，部分也直接參與宿主的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體[1,2,14-15]。gD蛋白也是主要免疫原性糖蛋白之一，是病毒感染過程所必需的，具有高度保守性，是機(jī)體中和抗體的目標(biāo)蛋白之一[11]。gD蛋白氨基酸序列分析和蛋白空間構(gòu)象研究表明，gD蛋白具有跨膜區(qū)、細(xì)胞膜結(jié)合位點(diǎn)和信號(hào)肽區(qū)的典型免疫活性特性[16]。自2011年以來，我國出現(xiàn)新的PRV流行毒株，陸續(xù)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)新毒株毒力基因和抗原保護(hù)性基因均出現(xiàn)一定的變異，也給該病的防控帶來新的挑戰(zhàn)[17]。部分規(guī)模化豬場(chǎng)的豬群PRV-gE抗體陽性率顯著升高，出現(xiàn)母豬流產(chǎn)、仔豬神經(jīng)癥狀和死亡率升高等情況，甚至還發(fā)現(xiàn)部分免疫PR疫苗的豬場(chǎng)發(fā)生偽狂犬病，并分離到新的PRV流行毒株。相關(guān)研究表明，新分離的PRV毒株出現(xiàn)了變異，而經(jīng)典毒株的疫苗未能完全保護(hù)新型強(qiáng)毒力PRV的感染[8-10]。

本研究對(duì)新分離的PRV毒株FJMH1907b株的gD基因核苷酸序列和對(duì)應(yīng)氨基酸序列與參考毒株進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果顯示福建新分離FJMH1907b毒株與疫苗毒Bartha株不屬于一個(gè)大的分支上，且兩者對(duì)應(yīng)的氨基酸序列同源性為87.7%，這可能是導(dǎo)致該豬場(chǎng)偽狂犬病免疫失敗而發(fā)病的原因之一，或PRV經(jīng)典毒株疫苗對(duì)新型毒株不能提供完全保護(hù)。PRV gD蛋白具有高度保守性，氨基酸序列比對(duì)分析結(jié)果顯示，不同地域分離的毒株具有一定差異，主要集中在aa278～aa282位置存在連續(xù)氨基酸缺失或增加，以及在aa276、aa287、aa341存在R-K、A-V和P-Q互換，新分離FJMH1907b株gD蛋白氨基酸也存在上述變化，同時(shí)在aa271存在R突變成Q。因此，本研究對(duì)PRV gD基因核苷酸序列和對(duì)應(yīng)氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，gD蛋白較保守，但存在一定地域差異性，與徐志文等研究結(jié)果一致[16]；與國外Bartha株存在較大的差異，兔源gD蛋白多抗血清對(duì)不同PRV毒株交叉中和效價(jià)差異不顯著[18]，或許PRV gD蛋白個(gè)別氨基酸的突變不會(huì)引起其抗原性重大改變，但新分離FJMH1907b株gD基因及對(duì)應(yīng)氨基酸序列的比對(duì)分析結(jié)果，結(jié)合目前豬場(chǎng)PRV的流行情況，對(duì)該病的防控應(yīng)因地制宜，定期做好病原學(xué)和血清學(xué)監(jiān)測(cè)，合理安排疫苗免疫。