蘇學軍，裘可，范文赟

（泰州職業(yè)技術學院藥學院，江蘇泰州 225300）

蕎麥殼是加工蕎麥粉時產生的主要副產品，約占蕎麥總重量的1/3（張嵐等，2016）。長久以來，蕎麥殼除少量用作土壤基肥、輔助飼料及枕芯填充物外（印鑫等，2018），其余被視為農業(yè)廢棄物而遭拋棄。研究發(fā)現，蕎麥殼中含有多種生物活性物質，作為主要成分之一的蕎麥殼黃酮（FOBH）具有預防和治療糖尿病、清除自由基、調節(jié)脂肪代謝、誘導癌細胞凋亡、改善微循環(huán)等功效（李鵬程等，2017；王昱儒等，2017；路靜靜等，2016；Ren等，2003）。在畜牧業(yè)生產中，黃酮是一種多功能性飼料添加劑，可以促進動物生長和生產，增強機體免疫及抗氧化能力，提高畜禽繁殖性能（劉瑞雪等，2021；劉帥等，2021）。研究表明，在AA 肉仔雞日糧中添加750 mg/kg 艾蒿黃酮，喂飼22～ 42 d，能極顯著提高肉仔雞的平均日增重，降低料重比，改善肉品質（江陽等，2021）；給肉仔雞飼喂適量的黃芪黃酮，可以改善腸道的微生物菌群，促進腸道健康（梁英等，2012）；甘草黃酮可作為替抗產品用于產氣莢膜梭菌引起的雞壞死性腸炎的治療（劉宗爭等，2019）；妊娠母豬飼料中添加200 mg/kg大豆黃酮可顯著增加仔豬的初生窩重和窩健仔數，顯著提高妊娠母豬的血清IgG 含量及SOD 活性，增強母豬的抗氧化能力（張琦琦等，2019）。因此，探索一種安全高效的FOBH 提取技術，對于飼料工業(yè)的發(fā)展具有積極意義。氧化石墨烯（GO）是具有二維片層結構的氧化碳化合物，作為一種新型催化劑，應用于天然活性成分提取時能夠催化水解植物細胞壁，降低纖維素的結晶度及晶粒尺寸，提高目標組分的浸出速率和提取效率（王博文等，2017；王欣，2015）。目前，關于GO 輔助乙醇提取FOBH 的研究鮮見報道，因而本試驗設計單因素及正交試驗對提取工藝條件進行優(yōu)化，旨在提供一種FOBH 提取新技術，亦為蕎麥殼資源的開發(fā)利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 甜蕎麥殼，泰州市永安洲；蘆丁標準品，上海源葉生物科技有限公司；單層氧化石墨烯，蘇州恒球科技有限公司；醋酸鈉、三氯化鋁與無水乙醇均為市售分析純。

1.2 主要試驗儀器 BJ-150 多功能粉碎機（德清拜杰電器有限公司）；TDL-60B 離心機（上海安亭科學儀器廠）；TU-1810 紫外可見分光光度計（北京普析儀器有限公司）；HH-S1 數顯恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠）；LRH-250F 型生化培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 FOBH 的提取 取60 ℃下鼓風烘干后的蕎麥殼若干，粉碎過40 目篩，干粉密封于干燥器內備用。稱取4 g 蕎麥殼粉末放入三口燒瓶內，加入一定量的提取溶劑及GO，在預設溫度下，水浴回流提取一定時間。完成提取后，以4000 r/min 離心分離15 min，得到含FOBH 的上清液，收集后待測。

1.3.2 FOBH 提取量的測定 參考曾俊等（2020）采用的AlCL3比色法測定FOBH 的提取量。精密移取質量濃度為201 μg/mL 的蘆丁標準品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 于25 mL 比色管中，再分別移入1.5%的AlCL3溶液4 mL，1 mol/L NaAc 溶液4 mL，繼續(xù)添加質量分數50%的乙醇至刻度，顯色反應20 min，在415 nm 處測定系列顯色液的吸光度，得吸光度A 與蘆丁濃度C 之間的回歸方程為A=0.0301C+0.0411，R2=0.9995。精密移取1 mL 蕎麥殼提取液，按前述步驟加入顯色劑顯色，測定吸光度，根據回歸方程計算提取液中FOBH 濃度，并按下式計算FOBH 提取量。

式中：Y 為FOBH 提取量，mg/g；K 為稀釋倍數；C 為計算求出的提取液中FOBH 的濃度，μg/mL；V 為提取劑的體積，mL；m 為蕎麥殼干粉的質量，g。

1.3.3 GO 輔助乙醇提取FOBH 的單因素試驗以FOBH 的提取量為指標，研究提取時間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）、提取溫度（50、60、70、80、90℃）、GO 添加量（0、0.4、0.8、1.2、1.6 mg/g）、乙醇質量分數（30%、40%、50%、60%、70%）和料液比（1:10、1:15、1:20、1:25、1:30 g/mL）對提取量的影響。

1.3.4 正交試驗設計 選取提取溫度、GO 添加量、乙醇質量分數、料液比作為四因素，基于L9（34）正交試驗設計表設計試驗方案并優(yōu)化提取工藝條件，因素與水平設計見表1。

表1 試驗因素與水平

1.4 統計分析 通過Excel 2017 進行試驗數據整理，使用SPSS 22.0 軟件進行方差分析，Duncan’s 法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 提取方法對比 采用水提（WE ）、GO 輔助水提（GOWE ）、醇提（ET）、GO 輔助醇提（GOET）4種方法提取FOBH。提取溶劑為蒸餾水和質量分數為50%乙醇，料液比1:20 g/mL，GO 添加量0.4 mg/g，70 ℃水浴回流提取1.5 h。由圖1 可知，乙醇用作提取劑更利于FOBH 的溶出，且在提取劑中添加GO后，水提和醇提獲得的黃酮提取量均有一定程度的增加，但以GOET 法效果最好。因此，采用GOET 法提取FOBH，進一步優(yōu)化提取工藝條件。

圖1 不同提取方法對比

2.2 單因素試驗

2.2.1 提取時間對FOBH 提取量的影響 由圖2可知，隨著提取時間的延長，在1.5 h 之前提取量上升較快，至1.5 h 后趨于平緩。這是因為提取初期黃酮在細胞壁內外有較大的濃度差，擴散速度快，但當提取達一定時間后，提取劑中FOBH 的濃度趨于飽和，提取量就變化不大，綜合考慮選擇1.5 h 比較經濟。

圖2 提取時間對FOBH 提取量的影響

2.2.2 提取溫度對FOBH 提取量的影響 由圖3可知，提取量隨著溫度的升高而增大，當溫度到達80 ℃后，提取量有所減小。升高溫度可增大傳質擴散系數，降低相際傳質阻力，使得黃酮更易增溶于提取劑中。但若提取溫度過高，非目標組分的溶出增多，且有可能會影響黃酮的穩(wěn)定性，故適宜的提取溫度選為80 ℃。

圖3 提取溫度對FOBH 提取量的影響

2.2.3 GO 添加量對FOBH 提取量的影響 圖4表明，隨著GO 添加量的增多，FOBH 的提取量先增大后減小，其最大值出現在GO 添加量為1.2 mg/g時，說明GO 能在一定濃度范圍內提高目標物的得率。這可能是由于熱回流提取時，GO 片狀結構的鋒利側邊會不斷切割、刺入細胞壁（涂育松等，2016），而遭到物理破壞的細胞壁則容易被提取劑穿透。同時，GO 表面大量的酸性基團，能使細胞壁的骨架成分纖維素發(fā)生水解（王博文等，2017），溶出阻力大大降低，加快了細胞內黃酮的釋放。但GO 的比表面積大，提取時若GO 量過多，會造成GO 對FOBH 的吸附量增加，導致提取量降低，故GO 添加量選擇1.2 mg/g 為宜。

圖4 GO 添加量對FOBH 提取量的影響

2.2.4 乙醇質量分數對FOBH 提取量的影響 圖5 表明，FOBH 的提取量隨乙醇質量分數的增大而增大，在50%時達到最大值，之后提取量降低。這可能是由于質量分數為50%乙醇溶液的極性與FOBH 的極性最為相似，黃酮在此濃度下更易溶出。因此，選擇質量分數為50%的乙醇提取較為合適。

圖5 乙醇質量分數對FOBH 提取量的影響

2.2.5 料液比對FOBH 提取量的影響 由圖6 可見，當料液比為1:10～1:15 g/mL時，提取量呈上升趨勢。料液比增大后，蕎麥殼粉與提取劑之間的接觸更充分，有利于FOBH 的溶出。但料液比的增大，會使提取劑中GO 濃度降低，從而削弱GO的催化作用，提取量又表現出下降趨勢，故料液比選擇1:15 g/mL 較適宜。

圖6 料液比對FOBH 提取量的影響

2.3 正交試驗結果 由表2 可以看出，各因素對FOBH 提取量的影響大小順序為A（提取溫度）>D（料液比）>B（GO 添加量）>C（乙醇質量分數）。由表3 可知，4 個因素對提取量的影響均表現為極顯著。本試驗優(yōu)化得到的最佳工藝組合為A3B2C1D3，即提取溫度90 ℃，GO 添加量1.2 mg/g，乙醇質量分數40%，料液比1:20 g/mL。

表2 正交試驗結果

表3 方差分析結果

2.4 驗證試驗 為了驗證提取工藝的穩(wěn)定性，在最佳工藝組合A3B2C1D3條件下進行3 次平行試驗，得到FOBH 提取量的平均值為（7.39±0.02）mg/g，RSD 為0.33%，表明該工藝穩(wěn)定可行。在上述最優(yōu)提取工藝條件下，若不添加GO，進行3 次乙醇回流提取，提取量平均值為（6.20±0.03）mg/g，GO 輔助醇提取后提取量增大了1.19 mg/g。

3 結論

本試驗結果表明，氧化石墨烯輔助乙醇提取FOBH 的最優(yōu)工藝條件為：提取溫度90 ℃，GO 添加量1.2 mg/g，乙醇質量分數40%，料液比1:20 g/mL，提取時間1.5 h。此條件下，FOBH 的提取量為7.39 mg/g，比乙醇回流提取提高了1.19 mg/g，表明GO 輔助乙醇提取FOBH 工藝的高效性。本工藝研究為FOBH 開發(fā)成飼料添加劑提供了可能，同時為蕎麥殼資源的綜合利用提供了一定的理論依據。