高騰美，常娟，楊涵月，常銀霞 ，魏硯明，張越

（1.山西中醫(yī)藥大學中藥與食品工程學院，山西太原 030619；2.山西大學化學化工學院，山西太原 030006）

黃芩是一種已被證實具有良好抗菌作用的中藥材，其提取物黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素具有抑菌、抗病毒、增強畜禽免疫力的作用（姜希紅等，2020；崔巍，2020；辛文妤等，2013；李景松等，2013；李國忠等，2012）。研究表明，黃芩素和漢黃芩素是黃芩中真正起藥效作用的物質，但其需要經腸道菌群水解成苷元黃芩素和漢黃芩素才可以發(fā)揮作用（陳麗艷等，2011；Yim等，2004；車慶明等，2001）。然而，黃芩素和漢黃芩素為疏水性強的脂溶性化合物（白榮等，2020），多元醇、水等常見藥用溶劑無法有效溶解黃芩素和漢黃芩素，進而無法達到良好的抑菌效果，更無法添加到畜禽飲用水中促進畜禽健康生長。而且直接使用黃芩素和漢黃芩素又易氧化失活，進而影響其藥效。

微乳作為一種新型藥物載體具有分散性高、增溶效果好和生物黏附性強等優(yōu)點（王春龍等，2008）?？诜罂山浟馨凸芪眨瑥亩朔走^效應及大分子通過胃腸道上皮細胞膜時的障礙（張正全等，2001），并能提高藥物的生物利用度，影響藥物的代謝和分布，延長藥物的體內循環(huán)時間及提高組織靶向性（柯學等，2010；王春龍等，2008）。

黃芩超臨界提取物主要以黃芩素、漢黃芩素為主，還含有少量的黃芩黃酮II 和千層紙素A。本文采用聚氧乙烯蓖麻油做油相，非離子表面活性劑做乳化劑，短鏈脂肪醇為助乳化劑將黃芩超臨界提取物制成微乳劑，考察黃芩超臨界提取物微乳劑的體外抑菌性能，以及對畜禽生長性能的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備 7071 超臨界CO2萃取裝置（美國ASI公司）；HL-5L+1L超臨界CO2萃取裝置（廣州浩立生物科技有限公司）；e2695 高效液相色譜儀，配備2998 PDA 檢測器（美國Waters 公司）；pH-0770A 培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器有限公司）；16100S-212 立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；Cary50 型-紫外分光光度計（美國Varian 公司）。

1.2 藥物與試劑 黃芩藥材購自山西元和堂中藥有限公司（產地：山西，批號：200201），經山西中醫(yī)藥大學中藥學院中藥與食品工程學院藥用植物教研室鑒定為唇形科植物黃芩的干燥根；黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素、千層紙素A、黃芩黃酮II 對照品均購自上海源葉生物科技有限公司；聚氧乙烯蓖麻油、司盤80、吐溫20 購自北京百奧萊博科技有限公司；瓊脂粉、蛋白胨、牛肉膏購自北京博星生物科技有限公司；供試菌株：大腸桿菌標準菌株CMCC（B）44102、金黃色葡萄球菌標準菌株CMCC（B）26003 購自上海魯微科技有限公司；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑為分析純。

1.3 黃芩超臨界CO2提取及含量測定 通過單因素試驗，對黃芩超臨界萃取溫度、萃取壓力、黃芩粒徑、夾帶劑乙醇的量等工藝參數進行了優(yōu)化。通過高效液相色譜測得其各成分百分含量，色譜條件參考申潔等（2019）方法做了適當修改：Thermo BDSHYPERSIL C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.1%甲酸水（A）-甲醇（B）-乙腈（C），以0.1%甲酸水-甲醇-乙腈為流動相進行梯度洗脫，0 min（80/15/5，V/V/V）、8 min（60/34/6，V/V/V）、25 min（37.5/55/7.5，V/V/V）、35 min（26/66/8，V/V/V）、45 min（10/80/10，V/V/V）。柱溫：30 ℃；DAD 檢測波長：278 nm；流速1 mL/min；進樣量：20 μL。

1.4 黃芩超臨界微乳劑的制備及穩(wěn)定性考察 為了增加藥物的溶解性，提高生物利用度?；趪鴥韧馑幍浼跋嚓P安全性數據，進行配方組分的選擇。通過對超臨界提取物溶解性評價，篩選出聚氧乙烯氫化蓖麻油為油相，選用司盤80、吐溫20 非離子表面活性劑為主表面活性劑，異丙醇為助表面活性劑。通過對各組分進行相圖研究，確定兩相區(qū)及微乳液區(qū)域，在此基礎上對配方進行優(yōu)選。并用動態(tài)光散射測定了油包水和水包油兩種微乳劑的粒徑。將制備的黃芩自微乳制劑于5、20 ℃恒溫箱、-20℃冰箱中冷藏條件下避光貯存8周，觀察其外觀。

1.5 微乳劑體外抑菌試驗 選取畜禽易感的大腸桿菌革蘭氏陰性菌和金黃色葡萄球菌革蘭氏陽性菌為研究對象，采用濾紙片法和倍比稀釋法測定黃芩不同成分抑菌圈直徑和最小抑菌濃度（MIC），分析黃芩成分抑菌活性，并測定黃芩超臨界微乳劑和水提物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長曲線。

1.5.1 培養(yǎng)基的制備 固體培養(yǎng)基制備（郝林等，2016）：準確稱取蛋白胨1.0 g，牛肉膏0.5 g，氯化鈉0.5 g，加水加熱溶解，再加入瓊脂粉1.5 g，繼續(xù)攪拌加熱至完全融化，補足蒸餾水至100 mL，以10%NaOH 溶液調節(jié)pH 至7.2～7.4，趁熱過濾，分裝于三角瓶內，121 ℃高壓蒸汽鍋中滅菌20 min，備用。液體培養(yǎng)基：除不加瓊脂粉，其他制作方法同固體培養(yǎng)基。

1.5.2 菌懸液的制備 將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別用固體培養(yǎng)基進行菌種斜面活化，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，分別將每個菌種挑取菌苔置液體培養(yǎng)基，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，控制菌液濃度達到105～ 106cfu/mL 后待用。

1.5.3 黃芩提取液抑菌效率 本試驗對黃芩不同提取物抑菌活性的研究采用濾紙片和抑菌圈法，供試細菌菌懸液濃度為105～ 106cfu/mL。藥敏濾紙片的制備：將直徑為6 mm 的滅菌濾紙片分別浸于黃芩超臨界微乳劑（含藥1.4%）、黃芩水提物（含藥1.4%）、空白微乳劑和生理鹽水中，靜置30 min 取出晾干備用。將滅菌的固體培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿內，在無菌條件下吸取供試菌液體0.1 mL滴在固體培養(yǎng)基表面，涂布均勻，將藥敏濾紙片貼于培養(yǎng)基表面，于培養(yǎng)箱中37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。測定抑菌圈直徑，每個平皿重復3次，無菌生理鹽水和空白微乳劑為陰性對照。

1.5.4 黃芩提取物及幾種單體最低抑菌濃度的測定 為進一步對黃芩提取物及各單體的抑菌活性、抑菌能力和抑菌機理進行研究。采用微量稀釋法對黃芩提取物和黃芩6 種單體的最小抑菌濃度（MIC）進行測定。取黃芩水提物、黃芩超臨界微乳劑（含藥量）、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素、千層紙素A、黃芩黃酮II 標準品各3.0 mg，對不溶于水的成分滴入少量DMSO 溶解，隨后加入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基配制成濃度為3.0 mg/mL 的溶液，備用。參照Peng 等（2011）方法，以96 孔板測定其最小抑菌濃度。首先向96 孔板3～11 列每孔加入100 μL 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，向第1、2 列分別對應加入上述所配制的溶液200 μL，從第2 列吸去100 μL 至第3 列如此連續(xù)倍比稀釋至第10列，取100 μL 棄去，使各孔濃度依次為原液濃度的1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256。向2～11 列分別加入大腸桿菌菌液100 μL。另取96孔板加入血清肉湯培養(yǎng)基以及金黃色葡萄球菌，方法同上。搖勻37 ℃培養(yǎng)24 h，取出觀察細菌生長情況，以肉眼觀察無細菌生長為最低濃度。

1.5.5 生長曲線的測定 為進一步探討抑菌機制，研究兩種提取物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌生長的影響。參考郭麗麗等（2019）的方法進行測定，具體簡述如下：配制與菌種相對應的液體培養(yǎng)基，分別取100 mL 裝入3 個250 mL 錐形瓶中，并標記為1、2、3號，121 ℃高壓滅菌20 min，冷卻后接種入1 mL 適宜濃度（105～ 106cfu/mL）的菌懸液。向1、2 號錐形瓶中分別加入等體積的適量提取物原液和2 倍稀釋液，使其終濃度達到1×MIC 和1/2×MIC，以加有等體積生理鹽水的3 號液體培養(yǎng)基為對照。將錐形瓶置于37 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)24 h，期間每隔2 h 在無菌條件下取樣，在600 nm 波長處測定并記錄吸光度OD值，重復3次，然后以時間為橫坐標，OD 平均值為縱坐標繪制供試菌的生長曲線。

1.6 雞的生長性能試驗 為評價黃芩超臨界微乳劑對畜禽的抗菌和生長促進作用，以白羽肉雞作為試驗對象，考察在肉雞飼喂水中添加黃芩微乳劑對其生長性能的影響。

試驗動物：每個劑量組選擇1 日齡健康、體重接近的白羽肉雞50羽，隨機分成5組，每組10 個重復。試驗期為42 d，常規(guī)飼養(yǎng)，21 日齡換料?；A日糧為專門訂制的不含抗生素的肉雞飼料，具體黃芩添加量、添加劑型和肉仔雞日增重和料肉比見表2。

1.7 統(tǒng)計學分析 用SPSS19.0 統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，Ducan’s 法對各重復指標進行多重比較，數據以“平均值±標準誤”表示，P <0.05表示差異顯著，P >0.05 表示差異不顯著。

2 結果

2.1 黃芩超臨界CO2提取工藝及含量測定 黃芩超臨界CO2最佳提取條件為：萃取溫度45 ℃、萃取壓力25 Mpa、黃芩目數40 目、夾帶劑95%乙醇的量為每克黃芩0.75 mL。將夾帶劑和黃芩提前拌勻放置過夜，可以大大縮短提取時間。對于1 L 萃取釜1 h 即可萃取完，收集萃取液減壓濃縮、冷凍干燥得黃芩超臨界CO2提取物，100 g 黃芩可得0.677 g超臨界萃取物。萃取物中以黃芩苷元為主，主要有黃芩素和漢黃芩素，還有少量的黃芩黃酮II 和千層紙素A，通過高效液相色譜測得其各成分百分含量依次為42.1%、36.5%、2.9%、8.4%，色譜圖見圖1。

圖1 黃芩超臨界液相色譜圖

2.2 黃芩超臨界微乳劑的制備及穩(wěn)定性考察圖2 為黃芩超臨界微乳劑配方的擬三元相圖，左下角為表面活性劑和油相的混合物（表面活性劑與油相比例為3：10 質量比）；右下角為水；頂角為助表面活性劑（異丙醇）。典型的配方如圖2 左下角所示，經過虛線（加水稀釋），可以逐漸由油包水向水包油微乳液轉變，最終達到右下角的狀態(tài)，兩種狀態(tài)溶液均呈半透明均相液體，無可見的懸浮物和沉淀。藥品成品為油包水微乳液，在使用稀釋過程仍保持微乳液狀態(tài)，但轉變?yōu)樗?。一方面是用起來方便，另一方面進入動物體內也可以讓藥物以納米級液滴分散，提高藥效。

圖2 黃芩超臨界微乳劑擬三元相圖

用動態(tài)光散射測定油包水和水包油兩種微乳劑的粒徑，結果顯示都是在60 nm 粒徑以下的微乳液狀態(tài)，完全符合微乳劑10～100 nm 的要求。將制備的黃芩自微乳制劑于5、20 ℃條件下避光儲存8周后，其外觀仍保持均相透明，無藥物析出或分層現(xiàn)象，藥物含量及粒徑也無明顯變化。說明微乳劑熱穩(wěn)定性高。將制備的黃芩自微乳制劑于-20 ℃條件下儲存8 周后，其外觀仍保持均相透明，無藥物析出或分層現(xiàn)象，藥物含量及粒徑也無明顯變化。說明微乳劑耐寒穩(wěn)定性高。隨后的試驗中采用在35 g 聚氧乙烯蓖麻油中加入10 g 司盤80，5 g 吐溫20，攪拌混合均勻，再加入34 g 異丙醇，攪拌混合均勻，加入3.5 g 黃芩CO2超臨界提取物，攪拌混合至外觀澄清透明，制備得到黃芩超臨界微乳劑。

2.3 黃芩提取液抑菌性分析 由表1 可以看出，與陰性對照相比，黃芩超臨界微乳劑和黃芩水提物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑菌作用。黃芩超臨界微乳劑對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用強于黃芩水提物，黃芩超臨界微乳劑和黃芩水提物對金黃色葡萄球菌的抑菌作用強于大腸桿菌。

表1 黃芩提取物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈 mm

2.4 黃芩提取物及幾種單體最低抑菌濃度的測定試驗結果顯示，黃芩水提物對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為3 mg/mL，對大腸桿菌最低抑菌濃度為20.5 mg/mL；黃芩超臨界微乳劑對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌最低抑菌濃度為0.187、0.093 mg/mL。黃芩中各成分的抑菌效果大小依次為黃芩素＞漢黃芩素、黃芩黃酮II＞黃芩苷＞漢黃芩苷和千層紙素A。因此，黃芩超臨界微乳劑對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用和抑菌效果明顯強于黃芩水提物。對大腸桿菌的最低抑菌濃度僅為傳統(tǒng)黃芩水提取物（主要成分黃芩苷54.7%和漢黃芩苷15.6%）濃度的1/110；對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度僅為傳統(tǒng)黃芩水提取物濃度的1/32。

2.5 生長曲線的測定 從生長曲線圖3、圖4 可以看出，對照組金黃色葡萄球菌正常生長，有明顯的遲緩期、對數期、穩(wěn)定期。金黃色葡萄球菌經濃度為0.093 mg/mL 的黃芩超臨界微乳劑和3.0 mg/mL 的黃芩水提物作用后，生長均受到明顯抑制，600 nm 處的吸光度值在整個培養(yǎng)時間內幾乎無明顯變化，菌體停止生長，說明黃芩超臨界微乳劑、黃芩水提物對金黃色葡萄球菌的抑菌效果顯著。當黃芩超臨界微乳劑、黃芩水提物的濃度減少為1/2 MIC 值時，可以看出此條件下菌體僅有少量繁殖，且生長速率和濃度明顯低于對照組，說明菌體的部分生長活性受到了抑制。微乳劑和黃芩水提物對大腸桿菌生長的影響，也有類似金黃色葡萄球菌的結果。

圖3 黃芩超臨界微乳劑對金黃色葡萄球菌生長曲線影響

圖4 黃芩水提物對金黃色葡萄球菌生長曲線影響

2.6 雞生長性能的測定 由表2 可知，空白組（即只喂基礎日糧）和陽性對照組（即抗生素組鹽酸林可霉素）相比料肉比基本相當；C 組黃芩超臨界微乳劑飲水式與A 組黃芩原粉拌基礎日糧和B組黃芩水提物飲水式相比，C 組黃芩超臨界微乳劑飲水式料肉比最低。試驗各組1 日齡雞體重相近，與對照組相比無顯著性差異（P >0.05）；試驗各組21 日齡雞體重較對照組均有不同程度的提高，其中黃芩超臨界微乳劑飲水C1組、黃芩原粉A1組和黃芩水提飲水B2組較對照組分別提高了13.21%、5.87%和4.91%（P <0.05）；試驗各組1～ 21 日齡料肉比較對照組都有所降低，試驗C1組和試驗A1組較對照組分別降低了9.70%和7.27%，差異顯著（P <0.05），試驗B2組較對照組有所降低，但差異不顯著（P >0.05）；除A3組和B3組試驗各組42 日齡雞體重較對照組均有不同程度提高，試驗C1組、試驗A1組和試驗B2組較對照組分別提高了19.51%、6.06%、0.56%（P <0.05）；試驗大多數組22～ 42 日齡料肉比較對照組有降低的趨勢，試驗C1組和試驗A1組較對照組分別降低了16.75%、7.11%（P <0.05），試驗B2組較陽性對照組有所降低，但差異不顯著（P >0.05）。從雞的生長性能看黃芩超臨界微乳劑飲水組效果最好，雞的飲水中添加0.01%的黃芩超臨界微乳劑即可獲得很好的生長性能，說明微乳劑型使藥物呈納米級分散有利于雞的消化吸收，可以促進雞的生長發(fā)育。黃芩水提物的生物利用度較低，且與相同濃度的自微乳劑相比，差異性顯著，也說明黃芩苷元相比黃芩苷的生物利用度更高。

表2 黃芩不同劑型對肉仔雞日增重和料肉比的影響

3 結論

本試驗結果表明，微乳劑對大腸桿菌的最低抑菌濃度僅為傳統(tǒng)黃芩水提取物濃度的1/110，而對金黃葡萄球菌的最低抑菌濃度僅為傳統(tǒng)黃芩水提取物濃度的1/32。42 日齡肉仔雞生長試驗評價表明，在肉雞飼喂水中添加0.01%黃芩超臨界微乳劑，可以提高肉仔雞的增重和飼料轉化率，降低料肉比，提高養(yǎng)雞的經濟效益。在飼養(yǎng)過程中未出現(xiàn)白羽雞的死亡，表明該黃芩微乳劑兼具藥用和營養(yǎng)功效，既能預防畜禽疾病又能促進生長，作為替代抗生素的后備中草藥具有良好的應用前景。