趙榮敏

（石家莊職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與藥品工程系，河北石家莊 050081）

大豆分離蛋白（SPI）是大豆中重要的營養(yǎng)成分之一，在實(shí)際生產(chǎn)中具有廣泛的應(yīng)用（Wang等，2017）。SPI 本身具有比較高的乳化活性和抗氧化能力，在一定程度上可以用于改善乳狀液的穩(wěn)定性。然而，由于加熱溫度、酸堿度以及離子強(qiáng)度等因素，SPI 的穩(wěn)定性受到影響（Wang等，2019）。水包油乳狀液通常是一種熱力學(xué)不穩(wěn)定的多相體系，容易產(chǎn)生聚集、聚結(jié)以及絮凝等現(xiàn)象，因此通?？梢酝ㄟ^添加穩(wěn)定劑，例如兩親性聚合物和固體顆粒等，避免油相和水相之間發(fā)生相分離。

多糖是廣泛應(yīng)用于許多食品膠體和乳劑配方的功能性成分，為天然聚合物。由于其與蛋白可以產(chǎn)生納米或微觀結(jié)構(gòu)（聚集和凝膠），因此通?？梢愿淖兪称纺z體的流變性能，影響食品產(chǎn)品的紋理和穩(wěn)定性（Porfiri 和Wagner，2018）。作為一種天然的陰離子多糖，亞麻籽膠（FG）是從亞麻籽或殼中提取出來的一種優(yōu)質(zhì)物質(zhì)。因其良好的親水效果對食品工業(yè)存在巨大應(yīng)用潛力。研究發(fā)現(xiàn)，加入FG，在較高的pH 條件下，可以降低凝膠形成速度，有助于形成致密的三維凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，同時提高凝膠強(qiáng)度，在研究FG 吸附在乳清蛋白表面的電位變化時發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)G 含負(fù)電荷的多糖部分與蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，主要通過影響兩者之間的靜電相互作用來維持乳液的穩(wěn)定性（Khalloufi等，2009）。目前，主要是通過油水界面層的吸附動力學(xué)和膨脹黏彈性特性來研究蛋白質(zhì)與多糖之間的相互作用。然而，SPI/FG 溶液在不同多糖濃度下的交聯(lián)聚集與乳液乳化性之間的關(guān)系尚不清楚。本研究的目的是評估FG 濃度對SPI/FG 溶液交聯(lián)聚集及其乳狀液穩(wěn)定性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑 大豆油，購于河南滎陽陽光油脂集團(tuán)有限公司。FG 為國產(chǎn)食品級，購于新疆綠旗企業(yè)有限公司。SPI，購自北京奧博克生物科技有限公司，其蛋白質(zhì)含量為85%，水分含量為7%，灰分含量為3.2%。其他試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器設(shè)備 FE20 pH計(jì)，梅特勒-托利儀器（上海）有限公司；AH-PILOT 型均質(zhì)機(jī)，安拓思納米有限公司；L9 紫外-可見光分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司；Nano ZS-90 zeta 電位儀，英國馬爾文公司；BT-9300Z 激光粒度分布儀，深圳市力達(dá)信儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 SPI/FG 溶液的制備 溶液的制備參考Liu等（2013）的方法，并進(jìn)行適當(dāng)修改。在25 ℃下配制0.5%的SPI 溶液，4 ℃保存12 h 以上，以確保完全溶解。然后添加濃度為0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%的FG，將SPI/FG 溶液混合攪拌30 min，用0.01 M NaOH 調(diào)節(jié)pH 至7.0，4 ℃保存過夜。

1.2.2 SPI/FG 溶液總巰基和二硫鍵的測定 總巰基含量的測定依據(jù)Simplicio 等（1991）的方法：取1 mL 混合溶液加入8 mL 的Tris-甘氨酸，均質(zhì)后10000 r/min 離心15 min（4 ℃）。取上清液4.5 mL 加入0.5 mL 10 mM Ellman's 試劑，并以含有4.5mL Tris-甘氨酸和0.5 mL 10 mM Ellman's 試劑作為對照，避光反應(yīng)30 min后，于412 nm 處利用紫外分光光度計(jì)測量吸光值。巰基含量的計(jì)算采用13600 M/cm 的摩爾吸光系數(shù)進(jìn)行表示，蛋白含量使用雙縮脲法測定。

二硫鍵的測定參考Pérez-mateos 等（1997）方法略作修改：取樣品2 g，分別與10 mL 的0.6 mol/L NaCl+8 mol/L 尿素（SD）（原子比3：40）和0.5 mol/L β-巰基乙醇、0.6 mol/L NaCl 和8 mol/L 尿素混合，pH 值調(diào)至7.0（SE）。混合并均質(zhì)，4 ℃靜置1 h，10000 r/min 離心15 min。用SE 溶液中蛋白含量與SD 溶液中蛋白質(zhì)含量之間表示二硫鍵含量。

1.2.3 乳液的制備 為了制備水包油乳液，將SPI溶液和FG（0%～0.4%）的樣品溶解在0.01 mol/L磷酸鹽溶液中（pH 7.0），室溫下500 r/min 攪拌3 h。然后與大豆油按照9：1 的質(zhì)量比進(jìn)行混合，于15000 r/min 下均質(zhì)2 min，得到待測乳液。

1.2.4 乳化活性（EAI）和乳化穩(wěn)定性（ESI）的測定 將制備好的乳液立即從距離管底部0.5 cm處取50 μL 新鮮乳狀液加入至含5 mL 0.1% SDS溶液的試管中，振蕩混勻后在500 nm 處測定吸光值記作A0，取均質(zhì)10 min 后的乳狀液重復(fù)上述步驟記作A10。EAI（m2/g）及ESI（%）由以下公式計(jì)算得出：

式中：2 為2 倍；2.303 為換算系數(shù)；C 為蛋白濃度；φ 為乳狀液中油相的體積分?jǐn)?shù)（V/V，本試驗(yàn)的油相體積分?jǐn)?shù)為0.2）；L 為比色皿光徑（本試驗(yàn)選用光徑為1 cm 的比色皿）；D 為稀釋倍數(shù)（本試驗(yàn)的稀釋倍數(shù)為100）；A0、A10分別為乳狀液0 min和10 min 時在500 nm 處的吸光值。

1.2.5 乳液粒徑的測定 調(diào)整蛋白質(zhì)濃度為10 mg/mL 并進(jìn)行測定。利用激光粒度儀測定乳液粒徑的大小。測定具體參數(shù)設(shè)置如下：物質(zhì)折射率為1.520，介質(zhì)為水，介質(zhì)折射率為1.333。

1.2.6 乳液Zeta 電位的測定 將待測樣品放入樣品池，采用Zeta 電位儀進(jìn)行電位測試，以評估靜電相互作用。測試參數(shù)為散射角90°，平衡時間60 s，測試溫度25 ℃。

1.2.7 乳液光學(xué)顯微鏡的測定 從底部吸取新鮮乳液200 μL 置于載玻片上，選擇光學(xué)顯微鏡觀察，用4×鏡頭尋找視野，后于10×鏡頭下進(jìn)行微觀結(jié)構(gòu)的觀察。

2 結(jié)果分析

2.1 不同濃度FG 對SPI/FG 溶液總巰基的影響SPI 富含巰基，極易被外界自由基攻擊并轉(zhuǎn)化為分子間或分子內(nèi)二硫鍵，導(dǎo)致蛋白質(zhì)交聯(lián)聚集。如圖1 所示，與對照組相比，F(xiàn)G 添加可以顯著降低巰基的含量（P <0.05），說明FG 的添加對SPI 結(jié)構(gòu)的展開具有顯著的抑制作用。而且，F(xiàn)G 為0.2%時巰基含量達(dá)到最低（P <0.05），原因可能是FG帶負(fù)電荷的羧基與SPI 中的巰基基團(tuán)相互作用，導(dǎo)致SPI/FG 溶液中巰基含量降低。然而，較高的FG 濃度（0.3%和0.4%）則又增加巰基的含量（P >0.05）。這可能是因?yàn)檩^高濃度的FG 促進(jìn)了蛋白質(zhì)鏈的展開，致使巰基含量呈現(xiàn)上升的趨勢。

圖1 不同濃度FG 對SPI/FG 溶液總巰基的影響

2.2 不同濃度FG 對SPI/FG 溶液二硫鍵的影響 二硫鍵的變化通?？梢杂脕肀碚鞯鞍踪|(zhì)交聯(lián)的情況，從而可以得出蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。圖2 所示的是不同濃度FG 對SPI 二硫鍵含量的影響。當(dāng)FG 濃度為0%～ 0.2%時，二硫鍵含量顯著增加（P <0.05），這可能是由于FG 的添加可以增強(qiáng)體系間的疏水相互作用，使得蛋白分子間發(fā)生聚集，同時巰基之間彼此靠近，發(fā)生-SH/S-S 間交換反應(yīng)，形成二硫鍵（Yongsawatdigul 和Sinsuwan，2007）。而在FG 含量為0.3%和0.4%時，二硫鍵含量均顯著降低（P <0.05），這可能是因?yàn)樵谳^高的FG 濃度下，F(xiàn)G 可以與大部分蛋白質(zhì)發(fā)生一定的相互作用，因此蛋白質(zhì)之間的巰基不能發(fā)生相互作用而產(chǎn)生二硫鍵，從而降低二硫鍵的含量。

圖2 不同濃度FG 對SPI/FG 溶液二硫鍵的影響

2.3 不同濃度FG 對SPI/FG 乳液EAI 和ESI 的影響 從表1 中可以看出，隨著FG 濃度的增加，乳液EAI 顯著增強(qiáng)（P <0.05）。這可能是FG 對乳液中的脂肪顆粒產(chǎn)生了很好的包裹作用并且阻止了脂肪顆粒之間的聚集。另一方面，F(xiàn)G 有良好的乳化性，能促進(jìn)蛋白質(zhì)和脂肪間的相互作用，形成穩(wěn)定性良好的乳液。而且，F(xiàn)G 的添加有效的改善了乳液的乳化穩(wěn)定性，F(xiàn)G 濃度為0.2%時效果更好?？赡苁且?yàn)镕G 的添加增強(qiáng)了乳液的靜電斥力，使更多的蛋白質(zhì)聚集在油滴周圍，可以抑制顆粒聚集（Liu等，2018），增強(qiáng)穩(wěn)定性，另一個原因可能是FG 的添加增強(qiáng)了乳液的黏度，改變油滴的添加比例，使穩(wěn)定性增強(qiáng)。從表中可以看出，低濃度的FG 使乳液穩(wěn)定性增強(qiáng)，較高濃度的FG 則降低了乳液的穩(wěn)定性。在添加量為0.4%時乳液穩(wěn)定性最差。這可能是因?yàn)榈蜐舛鹊腇G 吸附在油滴表面，填充界面縫隙，增強(qiáng)了乳液的穩(wěn)定性，而隨著FG 濃度的增加，蛋白質(zhì)開始與游離出來的FG 發(fā)生反應(yīng)發(fā)生聚集，乳液變得不穩(wěn)定。

表1 不同濃度FG 對SPI/FG 乳液EAI 和ESI 的影響

2.4 不同濃度FG 對SPI/FG 乳液平均粒徑的影響 蛋白質(zhì)粒徑的大小與蛋白質(zhì)的水合特性有密切聯(lián)系，直接影響著SPI 的加工品質(zhì)。圖3 表示為不同濃度下FG 對SPI 平均粒徑的影響。從圖中可以看出，隨著FG 濃度的增加，SPI/FG 乳液體系的平均粒徑呈下降的趨勢。原因可能是適量的FG可以與SPI 發(fā)生相互作用，阻止了蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)聚集，蛋白粒徑較小。而在較高的FG 濃度下（0.3%和0.4%），SPI 的粒徑顯著增大（P <0.05）。通常SPI 粒度增大的主要原因是蛋白氧化以及二硫鍵水平的增加，與上文二硫鍵結(jié)果一致。但此處粒度增大還可能是因?yàn)镾PI-FG 之間發(fā)生吸附作用而產(chǎn)生聚集，使蛋白質(zhì)粒徑變大。綜上，在FG 濃度為0.2%時，體系粒徑較小。

圖3 不同濃度FG 對SPI/FG 乳液平均粒徑的影響

2.5 不同濃度FG 對SPI/FG 乳液Zeta 電位的影響 Zeta 電位的測量可以用來描述膠體顆粒之間的靜電相互作用。靜電相互作用在蛋白交聯(lián)聚集過程中表現(xiàn)斥力，蛋白質(zhì)分子中幾乎所有的帶電基團(tuán)都分布在蛋白質(zhì)分子表面，Zeta 電位如果是負(fù)值，表明蛋白質(zhì)呈負(fù)電荷。如圖4 所示，隨著FG濃度的增加，Zeta 電位的絕對值逐漸增加（P <0.05），表明蛋白質(zhì)所帶負(fù)電荷逐漸增加，蛋白質(zhì)展開程度增加。這可能是因?yàn)镕G 與SPI 發(fā)生相互作用使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露，這與本文表面疏水性結(jié)論一致。然而，隨著FG 濃度的繼續(xù)增加，Zeta 電位的絕對值又逐漸降低。此時可能是因?yàn)镕G 濃度過大，導(dǎo)致于SPI 的負(fù)電荷不均衡，發(fā)生了靜電斥力，反而促進(jìn)了蛋白質(zhì)之間發(fā)生聚集，導(dǎo)致表面電荷量反而降低。

圖4 不同濃度FG 對SPI/FG 乳液Zeta 電位的影響

2.6 不同濃度FG 對SPI/FG 乳液光學(xué)顯微鏡的影響 顯微觀察可以進(jìn)一步顯示乳液的液滴大小以及乳液聚集或絮凝的情況。圖5 展示了添加不同濃度FG后，SPI/FG 乳液光學(xué)顯微鏡的變化。從圖中可以看出，添加FG 使所有處理組液滴變得致密且均一，液滴直徑均比對照組小。并隨著FG 濃度的增加，液滴直徑先顯著減小后又略微增大，且在FG濃度為0.2%時液滴直徑最小。這可能是因?yàn)镕G 濃度為0.2%時，油滴被完全包裹并均勻分布以形成穩(wěn)定的乳液；在FG 濃度增加至0.3%和0.4%時，液滴直徑略微增大。說明高濃度的FG 會導(dǎo)致乳液發(fā)生絮凝。并且光學(xué)顯微鏡結(jié)果與粒徑結(jié)果一致。

圖5 不同濃度FG 對SPI/FG 乳液光學(xué)顯微鏡的影響

3 結(jié)論

適當(dāng)濃度的FG 可以抑制蛋白之間的交聯(lián)聚集并提高乳液的乳化特性。加入FG后，SPI 巰基含量先降低后增加，二硫鍵含量與之相反。在濃度為0%～0.2%時SH 能抑制蛋白質(zhì)的展開，削弱蛋白質(zhì)-水相互作用，并形成均勻一致的乳液，且在濃度為0.2%時效果最顯著；但是，在濃度為0.3%和0.4%時，這些特性有所削弱。因此，適當(dāng)控制FG 的濃度，可以得到乳化效果較好的SPI/FG 乳液。