付 強(qiáng)，趙修報(bào)，王艷，苗立中，于金枝，張莎莎，程立坤

（1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600；2.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州 256600）

噬菌體是侵襲細(xì)菌的病毒，是自然界中最為普遍和分布最廣的群體（Suttle等，2021），其必須在活菌內(nèi)寄生，有嚴(yán)格的宿主特異性。噬菌體可作為分子生物學(xué)研究的試驗(yàn)工具（Bertoglio等，2020）以及用于檢測和控制致病菌，比如噬菌體療法等（Pirnay等，2021），但在細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)中會帶來無形的威脅。本試驗(yàn)通過對噬菌體的研究，以了解其生長規(guī)律、進(jìn)化特性，為更好的利用和防治積累經(jīng)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 噬菌體樣品和菌株 大腸桿菌BL21株，污染噬菌體的發(fā)酵液。

1.2 主要試劑 SM 液：NaCl 5.8 g，MgSO4·7H2O 2.0 g，明膠0.1 g，1 mol/L Tris-HCl（pH 7.5）50 mL，加水定容至1 L，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。普通LB 瓊脂和0.7%上層半固體LB 瓊脂，按常規(guī)方法制備。Trans15K DNA Marker，北京全式金生物技術(shù)有限公司；常規(guī)限制酶EcoR V、EcoR Ⅰ等，寶生物工程有限公司。

1.3 噬菌體的分離與純化 取10 mL 變清的發(fā)酵液8000 r/min 離心10 min，獲取上清液后用0.22 μm 濾器過濾除菌后備用。取10 μL 樣品液與0.5 mL 對數(shù)生長期正常菌液混合，室溫放置10 min，將混合物與5 mL 上層半固體瓊脂混合后，立即傾倒于LB 固體培養(yǎng)基上。待凝固后，37 ℃培養(yǎng)12 h，挑取單個(gè)空斑，純化3 次。將純化的噬菌體加入甘油至30%濃度，-80 ℃保存。

1.4 最佳感染復(fù)數(shù)測定（MOI）參考張琳等（2013）的方法，將宿主菌培養(yǎng)至對數(shù)生長前期，調(diào)菌液麥?zhǔn)蠞舛葹?.5，相當(dāng)于1×108cfu/mL。按照感染復(fù)數(shù)分別為10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001 的比例，加入噬菌體純培養(yǎng)液和宿主菌，在36 ℃搖床中150 r/min 培養(yǎng)3.5 h后，12000 r/min 離心10 min收集上清液，測定噬菌體的效價(jià)。以產(chǎn)生最高噬菌體效價(jià)的MOI 為最佳感染復(fù)數(shù)。試驗(yàn)重復(fù)3次，設(shè)置不加噬菌體的宿主菌培養(yǎng)液為試驗(yàn)對照。

1.5 一步生長曲線的測定 參考 Koonjan 等(2020）方法，將宿主菌培養(yǎng)至對數(shù)生長初期（D600為0.1～0.2），按照最佳感染復(fù)數(shù)比例接種噬菌體YHphg-1，室溫吸附10 min。將混合物1 mL 離心1 min（12000 r/min），沉淀重懸于1 mL LB 培養(yǎng)基，再轉(zhuǎn)入37 ℃條件預(yù)熱的100 mL 液體培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)。同時(shí)開始計(jì)時(shí)，在0 時(shí)刻和每隔10 min 取樣一次，連續(xù)取樣120 min，取上清用雙層平板法測定噬菌體效價(jià)。以感染時(shí)間為橫坐標(biāo)，噬菌體的效價(jià)為縱坐標(biāo)，繪制一步生長曲線。試驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值。

1.6 噬菌體的測序與鑒定

1.6.1 噬菌體基因組提取 按鞠磊等（2016）的方法，取固體增殖后效價(jià)達(dá)109pfu/mL 的噬菌體液1 mL 轉(zhuǎn)移至離心管，12000 g 離心5 min，去沉淀，取上清液，加200 mL 2.5 mol NaCl 20% PEG8000混合，室溫15 min。4 ℃、12000 g 離心5 min，棄上清，再離心30 s，棄上清。加100 μL TE（pH 8.0），室溫泡30 min，振蕩溶解，加入5 μL DNase I（20 mg/μL），5 μL RNase A（20 mg/mL）和10 μL DNase I Buffer，在37 ℃水浴鍋中孵育1 h，利用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取噬菌體基因組，冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 噬菌體的限制性酶切 在預(yù)試驗(yàn)中，選用了一些限制性內(nèi)切酶消化噬菌體基因組DNA，以篩選能夠切割噬菌體基因組的限制性內(nèi)切酶。按預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，采用EcoR I、EcoR V 和Sal I 進(jìn)行酶切噬菌體基因組，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠120V 電泳25 min，觀察酶切情況并拍照留存。

1.6.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 將用EcoR V 酶切后的基因組DNA，用taq 酶72 ℃反應(yīng)10 min，最后將反應(yīng)產(chǎn)物電泳并切膠回收2～3 kb 的DNA 片段。按常規(guī)操作取回收片段與pBLUE-T 載體連接，將連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)菌DH5a中，涂麥康凱平板（Amp+）37 ℃培養(yǎng)16 h，次日挑取無色菌落，EcoR Ⅰ酶切檢測陽性菌，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒送上海生物工程股份有限公司測序。

1.6.4 統(tǒng)計(jì)繪圖與測序數(shù)據(jù)分析 利用ggplot2軟件包（Ginestet，2011）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)繪圖。使用在線Blastn 工具比較核酸序列的同源性。使用pDRAW32 軟件，選擇限制性內(nèi)切酶對噬菌體基因組進(jìn)行電子酶切。利用MEGA-X 軟件（Version 10.2），根據(jù)噬菌體核酸序列測序結(jié)果構(gòu)建進(jìn)化樹，用ggtree（v3.1.3）（Yu，2020）構(gòu)圖，參考ICTV最新公布的2019 病毒分類系統(tǒng)，完成噬菌體種屬的分類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 噬菌體的分離與純化 從感染的發(fā)酵液中成功分離并純化出1 株噬菌體，命名為YHphg-2019。噬菌斑形態(tài)為圓形，直徑3～4 mm，有暈環(huán)（圖1）。據(jù)報(bào)道，暈環(huán)的形成與噬菌體釋放的多糖解聚酶有關(guān)（Latka等，2017）。

2.2 噬菌體的最佳感染復(fù)數(shù) 從表1 中可以看出，當(dāng)MOI=0.01時(shí)，噬菌體YHphg-2019 增殖后測定得到的噬菌體效價(jià)最高，為6.7×1011pfu/mL。因此噬菌體YHphg-2019 的最佳感染復(fù)數(shù)為0.01。

表1 噬菌體YHphg-2019最佳感染復(fù)數(shù)的測定

2.3 噬菌體的一步生長曲線 由圖2 可知，噬菌體YHphg-2019 與生長對數(shù)期的宿主菌混合20 min 曲線走勢無明顯變化，即判斷該噬菌體的潛伏期約為20 min。在20～80 min，噬菌體的滴度開始增加，而超過80 min 后曲線平穩(wěn)，即判斷該噬菌體的裂解時(shí)間約為80 min，因此，可得裂解量為1.86×109pfu/mL/ 1×107cfu/mL＝186 pfu/cell，即噬菌體YHphg-2019 感染宿主菌的裂解量約為186 pfu/cell。

圖2 噬菌體YHphg-2019 的一步生長曲線

2.4 噬菌體基因組的酶切圖譜 基因組隨機(jī)文庫的構(gòu)建一般是通過超聲波法或酶切法，這里選用酶切法，3 種限制性內(nèi)切酶酶切效果如圖3 所示。

圖3 噬菌體YHphg-2019 基因組的酶切圖譜

可以看出，EcoR V 酶切后在3 kbp 處有明顯條帶，為了提高連接的成功率，選用EcoR V 的酶切產(chǎn)物用于噬菌體隨機(jī)文庫的構(gòu)建。

2.5 噬菌體基因片段的克隆及質(zhì)粒篩選 切膠產(chǎn)物克隆入pBLUE-T 質(zhì)粒中，重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ酶切后，出現(xiàn)大小不一的條帶，這里選擇4 號質(zhì)粒送交測序（圖4）。在細(xì)菌重組子的篩選方面，由于是單酶切片段連接，假陽性較高，常規(guī)方法通常為藍(lán)白斑篩選，本試驗(yàn)采用了麥康凱培養(yǎng)基，陽性菌載體編碼的β-半乳糖苷酶氨基端被插入片段打斷，無法與宿主菌E.coli DH5a 實(shí)現(xiàn)α-β 互補(bǔ)，菌落呈現(xiàn)無色（反之顯紅色），從而提高陽性檢出率。試驗(yàn)證實(shí)，雖然無法杜絕，但可有效降低假陽性。

圖4 重組質(zhì)粒酶切鑒定

2.6 測序結(jié)果分析 測序數(shù)據(jù)顯示DNA 片段大小為2608 bp，經(jīng)Blastn 比對分析，與Escherichia phage vB_EcoS_SH2（NC_047828）、Escherichia phage JMPW2（NC_041873）相似度最高，Identities值 為97.13%，與Enterobacteria phage vB_EcoS_IME167（MH051912）、Escherichia virus T1（AY216660）、Shigella virus Sfin-3（NC_049831）等菌株相似度也在90%以上。以EscherichiaphagevB_EcoS_SH2 為參考株，經(jīng)進(jìn)一步分析，測序片段主要編碼尾絲蛋白，確定屬于尾噬菌體目（Caudovirales）。

2.7 噬菌體基因組的電子酶切圖譜 使用限制性內(nèi)切酶來確定基因組大小對噬菌體的分類和相互區(qū)分具有重要意義，組間的差異可以通過酶切位點(diǎn)表現(xiàn)出來（González-Villalobos等，2021），選擇三株相似度高的噬菌體菌株進(jìn)行電子酶切，如圖5 所示。對比圖3、圖5 可以看出，在EcoR Ⅰ、EcoR V 酶切條件下，噬菌體YHphg-2019 與Escherichia phage vB_EcoS_SH2（NC_047828）表 現(xiàn)出較一致的酶切圖譜，但在Sal Ⅰ酶切條件下又存在明顯差異，反應(yīng)出種間特異性。需要說明的是，通過計(jì)算機(jī)模擬的酶切圖譜和實(shí)際效果還是有區(qū)別的。

圖5 噬菌體基因組的酶切電子圖譜

2.8 噬菌體尾絲蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹 國際病毒分類委員會（ICTV）于2020 年3 月批準(zhǔn)了最新的2019 病毒分類系統(tǒng)，新準(zhǔn)則在前一準(zhǔn)則文件的基礎(chǔ)上全面采用了十五級分類階元，分別為：域、亞域、界、亞界、門、亞門、綱、亞綱、目、亞目、科、亞科、屬、亞屬、種（Adriaenssens等，2020）。大多數(shù)噬菌體屬于有尾噬菌體目（Caudovirales），具有尾絲蛋白，能特異性識別并結(jié)合宿主菌表面的受體（Black等，2012）。較熟悉的有Myoviridae（肌尾噬菌體科）、Siphoviridae（長尾噬菌體科）、Podoviridae（短尾噬菌體科）以及新加的Drexlerviridae（科），資料顯示尾絲蛋白具有一定保守性（Koonjan等，2020），根據(jù)噬菌體尾絲核酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹，如圖6 所示。從進(jìn)化樹可以看出，長尾噬菌體科（HK446 和HK97）作為外群，噬菌體YHphg-2019 與SH2、JMPW2 等處于最近分支，結(jié)合最新的2019 病毒分類系統(tǒng)，屬于Tunavirus（屬）。

圖6 根據(jù)尾絲蛋白繪制的噬菌體家族進(jìn)化關(guān)系

3 結(jié)論

本試驗(yàn)從發(fā)酵液中分離到一株烈性噬菌體YHphg-2019，幸運(yùn)的是其宿主范圍較窄，通過輪換其他菌株減少了再次污染幾率。試驗(yàn)還證實(shí)采用麥康凱抗性板“紅白斑”篩選代替“藍(lán)白斑”篩選的可行性。

該噬菌體基因組沒有通過二代高通量測序儀測序，僅通過鳥槍法（shot-gun) 獲得部分隨機(jī)序列，來達(dá)到菌種鑒定的目的。為了提高準(zhǔn)確性，采用物理酶切和電子酶切圖譜進(jìn)行了整體基因組的比較，可看出具有一致性的同時(shí)還存在種間差異。實(shí)驗(yàn)選擇≥95%的DNA 序列同一性作為該屬物種劃分的標(biāo)準(zhǔn)（Evelien等，2017）。結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育樹和Blastn 分析，認(rèn)為噬菌體分離株YHphg-2019 屬于Duplodnaviria（域）、Heunggongvirae（界）、Uroviricota（門)、Caudoviricetes（綱）、Caudovirales（目）、Drexlerviridae（科）、Tunavirinae（亞科）、Tunavirus（屬）。