包雪園　龍麗娟　夏　清　毛路亞　劉怡欣　農清棟,2

抗生素及中藥對變異鏈球菌的體外抑菌作用初探

包雪園1龍麗娟1夏清1毛路亞1劉怡欣1農清棟1,2

（1.廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧 530200；2.廣西高發(fā)傳染病中西醫(yī)結合轉化醫(yī)學重點實驗室，廣西 南寧 530200）

目的：探究抗生素與中藥活性成分各藥物的單獨使用以及抗生素與中藥兩兩聯合使用對變異鏈球菌的體外抑菌作用，旨在為齲齒的預防或治療提供參考依據。方法：藥敏紙片擴散法（K-B法）以常用的抑菌藥物黃連供試液作為陽性對照進行分析比對，選用7種單獨藥物的抑菌作用進行初篩，篩選出具有抑菌作用的藥物后采用試管二倍稀釋法和涂布平板法測定其單獨使用時的最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC），再采用棋盤稀釋法進行抗生素與中藥聯合用藥實驗計算分級抑制濃度（FIC）指數從而判斷混合組對變異鏈球菌生長作用的影響。結果：篩選出4種具有抑菌作用的藥物，它們分別是青霉素鈉、莫西沙星、和厚樸酚和黃柏提取物的供試液對變異鏈球菌生長均有抑制作用。各種藥物對變異鏈球菌的MIC分別為黃柏：3.91±0.00 mg/mL、和厚樸酚：31.25±0.00 μg/mL、青霉素鈉：0.0625±0.00 U/mL、莫西沙星：0.25±0.00 μg/mL，MBC分別為黃柏：15.63±0.00 mg/mL、和厚樸酚：125±0.00 μg/mL、青霉素鈉：0.0625±0.00 U/mL、莫西沙星：0.5±0.00 μg/mL?？股嘏c中藥的4組聯合用藥實驗的FIC指數均為1＜FIC＜2即抗生素與中藥活性成分之間的聯合效果均為無關作用。結論：實驗表明，各個藥物單獨使用時對浮游狀態(tài)下的變異鏈球菌均存在一定程度的抑制作用，以青霉素鈉抑菌效果最優(yōu)；抗生素與中藥活性成分聯合使用的抑菌效果與各藥物單獨使用的抑菌藥物效果相近?？股刂械那嗝顾剽c對變異鏈球菌的體外抑菌作用效果最佳，為臨床用藥提供重要的借鑒依據。

抗生素；中藥；變異鏈球菌；體外抑菌

引言

在口腔感染性疾病中，齲病是一種常見的疾病，其發(fā)病率比較高，主要表現為牙齒硬組織的慢性進行性損壞。變異鏈球菌是目前被公認的最主要的致齲菌，具有較強的產酸和耐酸能力，通常黏附于牙齒表面并形成復雜的以脂類和蛋白質為主要化學成分的生物膜，通過將碳水化合物降解為酸性物質，進一步引起牙齒表面脫礦，從而導致齲病的發(fā)生[1]，嚴重威脅著人類的口腔健康。因此，本研究將嘗試篩選出具有抑菌作用的中藥或抗生素以及將它們兩兩混合以探究藥物對變異鏈球菌的抑菌作用，為臨床上防治齲病具有重要的臨床參考價值。

我國中藥藥材來源豐富，大多數具有較好的抗菌作用，且抗菌的副作用較小且不易產生耐藥性，是防治感染性疾病的一種寶貴的資源?？股貙毦囊志饔眯Ч容^明顯，據此探討多種藥物混合使用的抑菌作用是研究藥物抑菌作用的一個新方向，以達到降低藥物單獨使用時劑量過大、藥效不明顯或引起不良反應等副作用。本研究采用抗生素和中藥活性成分中各藥物的單獨使用，以及嘗試將抗生素與中藥的配伍應用探討其對變異鏈球菌的抑菌作用，并為其開發(fā)應用于齲病的預防或治療提供一定的臨床研究基礎。

1 實驗材料

1.1　主要實驗菌株及藥物

變異鏈球菌（Streptococcus Mutans ATCC 25175），購于廣東省微生物菌種保藏中心；和厚樸酚（H811215-50 mg 和厚樸酚＞98%）；中藥材黃柏；莫西沙星（M84392-250 mg 莫西沙星 98%）；青霉素鈉（H37020080-0.96 g 注射用青霉素鈉）。

1.2　培養(yǎng)基

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）（環(huán)凱生物）；營養(yǎng)肉湯（北京陸橋）。

1.3　主要實驗儀器與試劑

立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備）；生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器有限公司）；潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；二甲基亞砜（DMSO）；麥氏比濁管（比克曼生物科技有限公司）；空白藥敏紙片（比克曼生物科技有限公司）；大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基TSA（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（杭州濱和微生物試劑有限公司）；無菌脫纖維羊血（廣州鴻楊生物科技有限公司）。

2　實驗方法

2.1　培養(yǎng)基的配制與滅菌

藥敏實驗紙片擴散法（K-B法）和測定MBC試驗使用TSA培養(yǎng)基，按照說明書要求，稱取8gTSA粉末加入到容量為250 mL錐形瓶中，倒入200 mL蒸餾水。測定MIC和聯合用藥實驗所使用的培養(yǎng)基為營養(yǎng)肉湯，稱取3.8 g營養(yǎng)肉湯粉末加盛有200 mL蒸餾水的錐形瓶中。將裝有培養(yǎng)基的瓶子加塞并包扎并于121.3℃，103.46 KPa中滅菌15 min。滅菌結束，待培養(yǎng)基冷卻至56℃，TSA中加入5%羊血后倒平板，而營養(yǎng)肉湯則加入5%的羊血清后再分裝試管。

2.2　菌懸液的制備

將購買的菌株凍干粉末進行復蘇，接著進行傳代后制備菌懸液以備后續(xù)實驗使用。其中，菌懸液的制備方法為用一次性采樣棉簽挑取2～3個菌落于盛有生理鹽水的無菌試管中并對其進行研磨至均勻渾濁，讓其渾濁度與麥氏比濁管的0.5號標準管的濃度近似，此時細菌的濃度約為1108個/mL。

2.3　實驗藥液的制備

（1）和厚樸酚母液：稱取50 mg和厚樸酚溶于10 mL DMSO，配制成5 mg/mL的母液，備用。

（2）木香烴內酯母液：稱取10 mg木香烴內酯標準品溶于10 mL營養(yǎng)肉湯液體，配制成1 mg/mL的母液，備用。

（3）各中藥材母液（黃柏、訶子、升麻）：稱取50 g中藥材置于1L燒杯中，加入500 mL蒸餾水浸泡2 h，煎煮30 min后將原液轉移至200 mL燒杯，原藥材包不做處理，再加入500 mL蒸餾水煎煮30 min，合并兩次所得藥液。將合并藥液文火濃縮至1000 mg/mL，備用。

（4）青霉素鈉藥液：稱取6 mg的160萬單位青霉素鈉用100 mL等滲生理鹽水配制成100單位/mL的青霉素鈉藥液，備用。

（5）莫西沙星藥液：稱取10 mg莫西沙星溶于100 mL等滲生理鹽水，配制成0.1 mg/mL的莫西沙星藥液，備用。

（6）黃連供試液：由廣西中醫(yī)藥大學微觀形態(tài)實驗室提供，濃度為1000 mg/mL。

2.4　測定藥物體外抑菌作用

采杉紙片擴散法（K-B法）測定藥物體外抑菌作用研究。首先制備藥敏紙片，將直徑為 6 mm 的藥敏紙片分別浸泡于各實驗藥液、蒸餾水、黃連供試液，分別制成各供試液藥敏紙片、陰性對照和陽性對照，空白對照不做任何處理。藥敏紙片置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中烘干至完全干燥，隨后分別裝入無菌棕色瓶中進行密封保存?zhèn)溆谩Ｓ靡淮涡圆蓸用藓炚喝∽儺愭溓蚓木鷳乙?，在管內壁輕輕地將多余菌懸液旋轉擠掉部分液體后劃線于整個瓊脂平板表面，每次旋轉平板60°，重復兩次，最后沿平板內緣涂抹一周。確保整個平板都均勻涂布有細菌。在室溫下放置3 min～5 min至培養(yǎng)基充分吸收菌懸液的水分，隨后用無菌鑷子將各藥敏紙片以及陽性對照、陰性對照、空白對照分別貼于平板表面的不同位置上（注意紙片邊緣與平皿邊緣不得小于15 mm，每個紙片中心間距不得小于24 mm），在室溫下放置3～5min后倒置平板放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出平皿后測定各藥敏紙片抑菌圈直徑，單位用mm表示。

2.5　分別測定各單獨藥物的MIC及MBC

采用試管二倍稀釋法和涂布平板法分別測定各單獨藥物的MIC及MBC。進行MIC的測試時，首先取10支試管，依次編號為1～10并在試管中預先加入1 mL的營養(yǎng)肉湯。接著向1號管中加入1 mL的藥液，充分混勻后取出1 mL放入2號管并充分混勻，以此類推進行藥液的二倍稀釋，直到第8號管混勻后取出1 mL棄去，分別將各單獨藥物母液進行2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍等多個倍數的二倍稀釋。最后往1～8號試管各加入0.1 mL菌懸液，用移液槍吹打使其充分混勻。第9號試管僅加入0.1 mL菌懸液作為陽性對照，第10號管不加菌液和藥液作為陰性對照。將上述試管置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出并觀察結果。有細菌生長液體呈渾濁狀態(tài)，無細菌生長時液體呈透明清亮狀。用肉眼對試管進行觀察，細菌不生長的最低濃度即為該藥液的最低抑菌濃度（MIC）[2]。采用涂布平板法，將高于MIC（包括MIC）的各管培養(yǎng)物各吸取0.1 mL涂布于TSA血瓊脂平板。采用平板菌落計數法對細菌總數進行計數，平板上的菌落總數小于5CFU/皿的最低濃度即為該藥物的最低殺菌濃度（MBC）[3]。

2.6　測定抗生素與中藥活性成分聯合用藥的抑菌效果

采用棋盤稀釋法[4]測定抗生素與中藥活性成分聯合用藥的抑菌效果。預先在96孔培養(yǎng)板加入100 μL營養(yǎng)肉湯，橫向1～5孔加入等量各濃度中藥活性成分（A）50 μL，縱向A-E孔加入等量各濃度抗生素（B）50 μL。最后96孔培養(yǎng)板的各藥物濃度為1×MIC、1/2×MIC、1/4×MIC、1/8×MIC、1/16×MIC，隨后各孔加入10 μL菌懸液，每組實驗同時設置陽性和陰性對照。觀察記錄混合組的MIC。通過計算分級抑制濃度（FIC）指數[5]來測定兩者的抑菌關系。

FIC＝混合組A藥MIC/單組A藥MIC＋混合組B藥MIC/單組B藥MIC

FIC≤0.5 時，兩藥為協同作用即兩種藥物聯合作用顯著大于單獨作用活性總和；0.5＜FIC≤1 時，兩藥為相加作用即兩種藥物聯合作用的活性與單獨作用活性之和相近；1＜FIC＜2 時，兩藥為無關作用即兩種藥物聯合作用的活性與單獨作用活性相近； FIC≥2 時，兩藥為拮抗作用即兩種藥物聯合作用顯著低于單獨作用活性。

3　實驗結果與分析

3.1　抑菌藥物初篩

研究將黃連供試液作為陽性對照，同時設立陰性對照和空白對照，通過比較各單獨使用藥物對變異鏈球菌的抑菌圈大小，結果顯示，所選用的各種實驗藥物中，除了升麻、訶子和木香烴內酯對變異鏈球菌無抑制作用外，青霉素鈉、莫西沙星、黃柏以及和厚樸酚都顯示出對變異鏈球菌不同程度的抑菌作用，其中青霉素鈉的抑菌效果最佳，抑菌圈大小為51.33±0.94 mm，莫西沙星的抑菌效果次之，兩者與黃連（陽性對照）的抑菌作用相比，抑菌效果具有極顯著性差異（＜0.01）。因此，最終篩選出青霉素鈉、莫西沙星、黃柏提取、和厚樸酚共4種藥物用于進行后續(xù)實驗研究。各實驗組對變異鏈球菌的抑菌圈大小如表1所示。

表1　各實驗組對變異鏈球菌的抑菌圈大小

注：平均值用均值±標準偏差表示：將具有抑菌作用的青霉素鈉、莫西沙星、黃柏以及和厚樸酚4種中藥與黃連比較，均經過T-test統計學分析。＜0.01，具有極其顯著性差異，＜0.05，具有顯著性差異，＞0.05，無統計學意義。

3.2　確定各藥物單獨使用時藥物的MIC值與MBC值

細菌生長液體呈渾濁狀態(tài)，細菌不生長液體呈透明清亮狀。實驗重復三次，在觀察到對照組成功前提下，再觀察實驗組的渾濁情況，無細菌生長的最低濃度即為該藥液的最低抑菌濃度（MIC）。試管二倍稀釋法結果顯示，各藥物的為黃柏：3.91±0.00 mg/mL、和厚樸酚：31.25±0.00 μg/mL、青霉素鈉：0.0625±0.00 U/mL、莫西沙星：0.25±0.00 μg/mL。

將三組重復實驗中，高于MIC（包括MIC）的各管培養(yǎng)物進行涂布，平板上的菌落數小于5 CFU/皿的最低濃度即為該藥物的最低殺菌濃度（MBC）。涂布平板結果顯示，黃柏：15.63±0.00 mg/mL、和厚樸酚：125±0.00 μg/mL、青霉素鈉：0.0625±0.00 U/mL、莫西沙星：0.5±0.00 μg/mL。

由上述各單獨使用藥物的MIC值與MBC值計算MBC/MIC比值，MBC與MIC值比較接近時說明該藥可能為殺菌劑[6]。黃柏與和厚樸酚對變異鏈球菌的MBC/MIC均為4。莫西沙星對變異鏈球菌的MBC/MIC為2。青霉素鈉對變異鏈球菌的抑菌和殺菌能力大致相同。

3.3　評價聯合應用的抑菌效果

從前面的研究結果可以看出，選出2種抗生素和2種中藥對變異鏈球菌具有明顯的抑菌作用，為了減少抗生素帶來的副作用以及提升中藥的抑菌效果，故本次研究嘗試使用抗生素與中藥兩兩聯合使用進行抗菌實驗研究。

經三組重復實驗比對，4組抗生素與中藥兩兩混合使用的實驗的結果均顯示，1＜FIC＜2，抗生素與中藥活性成分的聯合效果均為無關作用即抗生素與中藥活性成分之間的聯合效果與藥物單獨使用的藥物效果相近。青霉素鈉對變異鏈球菌的抑菌效果最明顯，將繼續(xù)討論其與其它藥物的聯合作用研究，為開發(fā)青霉素的抑菌作用提供更為廣闊的研究前景。

各抗菌試驗的結果如表2、表3、表4、表5所示。

表2　黃柏與青霉素鈉聯合的抗菌試驗

表3　黃柏與莫西沙星聯合的抗菌試驗

表4　和厚樸酚與青霉素鈉聯合的抗菌試驗

表5　和厚樸酚與莫西沙星聯合的抗菌試驗

注：“-”表示無關聯作用。

4　討論

抗生素作為感染性疾病的首選藥物，對于其毒副作用一直都有爭議。本研究證明了青霉素鈉對變異鏈球菌確實存在較為明顯的抑菌效果，但抗生素易使機體產生耐藥性，凡超時、超量、不對癥使用或未嚴格規(guī)范使用抗生素都易產生毒性作用，濫用抗生素也易導致菌群失調，長期使用也易誘發(fā)其它疾病。大多數傳統中草藥有清熱解毒、抑菌殺毒的作用，并且毒副作用小。因此選擇傳統中草藥的活性成分與抗生素聯合應用，以達到降低抗生素的使用劑量，從而降低抗生素所帶來的不良反應是預防或治療變異鏈球菌引起的齲病的一個新方向。本研究成功篩選出了4種對變異鏈球菌具有顯著抑制作用的藥物，青霉素鈉的抑菌效果最明顯，莫西沙星次之，且兩者的抑菌效果均比陽性對照黃連的抑菌效果強。黃柏提取物與和厚樸酚對變異鏈球菌有抑菌效果，但抑菌效果均比陽性對照弱?？股氐囊志Ч麖姷靖弊饔么?，為達到降低藥物單獨使用時劑量過大、藥效不明顯或引起不良反應等副作用，今后對變異鏈球菌抑菌藥物的研究將從以下幾個方面著手。第一，根據抗生素與中藥的配伍原則來選擇不同的藥物聯合組合使用；第二，進一步做變異鏈球菌體外粘附作用、產酸作用的研究；第三，根據婁兵新等[7]研究發(fā)現的變異鏈球菌在形成生物膜的狀態(tài)下比其在浮游狀態(tài)下的生存能力更強，因此對預防齲病不僅要抑制變異鏈球菌浮游菌的生長還需減少其牙菌斑生物膜的形成，據此研究抑菌藥物對變異鏈球菌生物膜形成的影響也是值得探討的內容。

5 結束語

經本研究雖然證明了各藥物對菌株存在一定程度的抑制作用，但實驗僅提供了體外抑菌作用的研究結果，并未涉及體內實驗及超微結構等方面的研究，因此藥物的使用效果、其安全性如何以及相關作用機制等尚需進一步研究。

[1]周雙雙，鄭欣，周學東，等. 菌斑生物膜產堿代謝與齲病[J]. 國際口腔醫(yī)學雜志，2016，43(5): 573-577.

[2]鐘文希，梅金喜，高玉嬌. 蛇鱗草提取液體外抑菌作用研究[J]. 時珍國醫(yī)國藥，2010，21(9): 2238.

[3]肖華，葉壽山. 靈杏咳喘膠囊體外抗菌作用的實驗研究[J]. 安徽醫(yī)藥，2008，12(3): 207.

[4]婁淑琴，夏瑋，陳林梟，等. 丁香不同溶劑提取物的復配物的抑菌性研究[J]. 日用化學工業(yè)，2019，49(10): 649-655.

[5]王思彤，張彤，金曼，等. 羅伊氏菌素與兒茶素協同對變異鏈球菌的抑制作用[J]. 食品科學，2021，42(1): 67-72.

[6]張菁，呂媛，于凱江，等. 抗菌藥物藥代動力學/藥效學理論臨床應用專家共識[J]. 中華結核和呼吸雜志，2018，41(6): 409-446.

[7]婁兵新，許穎，魏莉. 丹皮酚對變形鏈球菌生物膜影響的體外研究[J]. 中國微生態(tài)學雜志，2017，29(2): 159-161.

Preliminary Study on the Antibacterial Effect of Antibiotics and Traditional Chinese Medicines onin Vitro

Objective: To explore the antibacterial effect of antibiotics and active components of traditional Chinese medicine onin vitro, in order to provide reference basis for the prevention or treatment of dental caries. Methods: The drug-sensitive paper sheet diffusion method (K-B method) used the commonly used bacteriostatic drug Huanglian test solution as a positive control for analysis and comparison. The antibacterial effects of seven individual drugs were selected for preliminary screening. After screening the drugs with antibacterial effects, the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) were measured by tube double dilution method and coated plate method, Then the combined use of antibiotics and traditional Chinese medicine was carried out by chessboard dilution method, and the graded inhibitory concentration (FIC) index was calculated to judge the effect of the mixed group on the growth of. Results: 4 kinds of drugs with antibacterial effects were screened out. They were penicillin sodium, moxifloxacin, honokiol and phellodendron extract. The test solution had inhibitory effect on the growth ofThe MIC of various drugs to Streptococcus mutans was phellodendron: 3.91±0.00 mg/mL, honokiol: 31.25±0.00 μg/mL, penicillin sodium: 0.0625±0.00 U/mL, moxifloxacin: 0.25±0 μg/mL. The MBC was phellodendron: 15.63±0.00 mg/mL, honokiol: 125±0.00 μg/mL, penicillin sodium: 0.0625±0.00 U/mL, moxifloxacin: 0.5±0.00 μg/mL. The FIC index of the four groups of combined use of antibiotics and traditional Chinese medicine was 1

antibiotics; traditional Chinese medicine; streptococcus mutans; bacteriostasis in vitro

R96

A

1008-1151(2022)06-0103-04

2022-03-23

廣西中醫(yī)藥大學2020年大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（202010600104）。

包雪園（1998－），女，廣西中醫(yī)藥大學學生，研究方向為醫(yī)學檢驗技術。

農清棟（1985－），女，廣西中醫(yī)藥大學講師，碩士，從事醫(yī)學免疫學與微生物學教學與科研工作。