蔣 寧 林金盛 曲紹軒 李輝平 駱 昕 徐 平 李宏斌 馬 林* 顧魯同

（1江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210014；2泗洪綠康食用菌科技有限公司，江蘇宿遷 223942；3 陽(yáng)泉職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西陽(yáng)泉 045000；4江蘇省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站，江蘇南京 210036）

草菇Volvariella volvacea，隸屬于擔(dān)子菌綱Basidiomycetes 傘菌目Agaricales 小苞腳菇屬Volvariella[1]，是一種高溫型食用菌，具有較高的保健價(jià)值，在我國(guó)南方地區(qū)和東南亞國(guó)家栽培較廣[2]。據(jù)中國(guó)食用菌協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)，2019 年中國(guó)草菇總產(chǎn)量為23.43萬(wàn)t。

草菇栽培常用的原料有棉籽殼、廢棉渣、稻草、中藥渣等，近年來(lái)利用金針菇、杏鮑菇等木腐類(lèi)食用菌菌渣栽培草菇量不斷上升[3]。草菇規(guī)?；耘喾謳讉€(gè)階段，首先從20 世紀(jì)60 年代的室外生料堆式栽培，到80 年代后期的保溫房床架式栽培，之后進(jìn)入21 世紀(jì)實(shí)現(xiàn)了機(jī)械化、周年化栽培，再到目前開(kāi)始探索全方位的工廠化栽培階段[4]。

草菇工廠化栽培，通過(guò)隧道發(fā)酵有效降解培養(yǎng)料是實(shí)現(xiàn)草菇高產(chǎn)的關(guān)鍵。在同樣需要經(jīng)過(guò)培養(yǎng)料隧道發(fā)酵過(guò)程的雙孢蘑菇Agaricus bisporus生產(chǎn)中，培養(yǎng)料木質(zhì)纖維素的降解率與其酶活性呈正相關(guān)[5]。利用不同基質(zhì)栽培大球蓋菇Stropharia rugosoannulata時(shí)，胞外纖維素酶、半纖維素酶、漆酶等胞外酶活性均存在明顯差異[6]。已有文獻(xiàn)報(bào)道，菌渣中加入稻草或麥草有利于草菇培養(yǎng)料的發(fā)酵[7]，但未對(duì)最適比例進(jìn)行深入研究，尤其是適宜隧道發(fā)酵的最佳配方鮮有報(bào)道。培養(yǎng)料配方對(duì)隧道發(fā)酵過(guò)程中基質(zhì)胞外酶、產(chǎn)量等都有影響。因此，筆者從草菇生理生化的角度出發(fā)，以杏鮑菇菌渣和麥草培養(yǎng)料為研究對(duì)象，探究隧道發(fā)酵過(guò)程中草菇基質(zhì)的pH 和部分胞外酶活性的變化，以期為穩(wěn)定草菇產(chǎn)量，優(yōu)化生產(chǎn)條件，進(jìn)一步推進(jìn)草菇工廠化栽培提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

草菇菌種：V23，江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所提供。

培養(yǎng)料配方1：杏鮑菇菌渣100%；配方2：杏鮑菇菌渣90%，麥草10%；配方3：杏鮑菇菌渣80%，麥草20%；配方4：杏鮑菇菌渣70%，麥草30%。杏鮑菇菌渣的原始配方為雜木屑25%，玉米芯20%，甘蔗渣15%，麩皮25%，玉米粉5%，豆粕粉7%，輕質(zhì)碳酸鈣2%，石灰1%。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵前準(zhǔn)備

杏鮑菇采收結(jié)束后，挑選無(wú)雜菌感染的菌包，用脫袋機(jī)去除塑料袋，并將菌渣粉碎成直徑小于5 mm 的顆粒物；將麥草切割成長(zhǎng)度20 cm 左右的小段。菌渣與麥草按比例備好，分別加入4%的熟石灰，混合均勻后準(zhǔn)備發(fā)酵。

1.2.2 培養(yǎng)料隧道發(fā)酵

將混勻備用的培養(yǎng)料放入一次發(fā)酵隧道中，按照8 min/20 min的通風(fēng)頻率持續(xù)發(fā)酵2 d。一次發(fā)酵結(jié)束后將培養(yǎng)料轉(zhuǎn)入封閉的二次發(fā)酵隧道，加大通風(fēng)量將培養(yǎng)料料溫降至45 ℃（空間溫度為43 ℃），隨后降低通風(fēng)量，保持每小時(shí)1~1.5 ℃的速度增溫，至料溫達(dá)到60 ℃（空間溫度為58 ℃），恒溫保持10 h；加大通風(fēng)量降溫8 h，料溫降至50 ℃（空間溫度為48 ℃），保持通風(fēng)2~3 d，待氨氣下降到5 mg/L 以下，溫度40 ℃以下時(shí)培養(yǎng)料隧道發(fā)酵結(jié)束。

1.2.3 樣品采集

分別在一次隧道發(fā)酵前（A）、二次隧道發(fā)酵前（B）和二次隧道發(fā)酵結(jié)束后（C）采集培養(yǎng)料樣品。采用隨機(jī)取樣法，每處理取5 個(gè)點(diǎn)采集50 g，混勻，三次重復(fù)。每重復(fù)分兩份樣品：一份用于測(cè)定pH，另一份用于測(cè)定胞外酶活性。

1.2.4 培養(yǎng)料pH測(cè)定

稱(chēng)取通過(guò)2 mm 孔徑篩的供試樣品10 g，按水樣比2.5∶1加入去除CO2的蒸餾水，將樣品充分?jǐn)嚢璺稚?，放?0 min后采用玻璃電極法測(cè)定樣品pH[8]。

1.2.5 粗酶液的提取

稱(chēng)取10 mg 供試樣品，加入100μL pH 7.2~7.4的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS），充分混勻。4 ℃、3 000 r/min 離心20 min，收集上清即為粗酶液。

1.2.6 胞外酶活性測(cè)定

采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒法，分別按照上海茁彩生物科技有限公司微生物總蛋白酶（t-Pro）、半纖維素酶（Hce）、纖維素酶（CE）和木質(zhì)素過(guò)氧化物酶（LIP）ELISA 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，Rayto RT-6100 酶標(biāo)分析儀在450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各處理的OD 值，根據(jù)說(shuō)明書(shū)計(jì)算公式計(jì)算酶活性。

1.2.7 草菇產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)

培養(yǎng)料二次發(fā)酵結(jié)束后出倉(cāng)移入出菇房?jī)?nèi)，播種后進(jìn)行常規(guī)的工廠化出菇管理，分別記錄4 個(gè)配方的兩潮草菇產(chǎn)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20 軟件，計(jì)量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），兩兩比較采用Duncan-Dunnett’s T3，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH測(cè)定

由圖1 可知，培養(yǎng)料經(jīng)過(guò)一、二次隧道發(fā)酵后pH 發(fā)生了變化。4 個(gè)配方均表現(xiàn)出相同的pH 變化趨勢(shì)，即一次發(fā)酵后pH 下降明顯，pH 全部下降至8.15~8.50。二次發(fā)酵后pH 變化較小，配方1 和配方2仍為下降趨勢(shì)，但配方3和配方4卻略有上升。

圖1 供試配方料發(fā)酵過(guò)程pH變化

2.2 胞外酶活性分析

2.2.1 總蛋白酶活性的變化

培養(yǎng)料中含有豐富的蛋白質(zhì)，在隧道發(fā)酵過(guò)程中總蛋白酶活性的變化呈現(xiàn)出不同的規(guī)律。由圖2可以看出，配方1 培養(yǎng)料中總蛋白酶的活性經(jīng)過(guò)兩次隧道發(fā)酵變化很小，差異不顯著；其他3個(gè)添加麥草的配方，培養(yǎng)料經(jīng)過(guò)一次發(fā)酵后總蛋白酶活性均呈上升趨勢(shì)，且差異顯著，經(jīng)過(guò)二次發(fā)酵后，配方2的酶活性依然上升，而配方3、配方4 酶活性卻下降至2 IU/g；二次發(fā)酵結(jié)束后，配方2 的總蛋白酶活性顯著高于其他3個(gè)配方。

圖2 供試配方培養(yǎng)料發(fā)酵過(guò)程總蛋白酶活性變化

2.2.2 木質(zhì)素酶活性的變化

培養(yǎng)料在隧道發(fā)酵過(guò)程中木質(zhì)素酶活性的變化趨勢(shì)如圖3 所示。麥草含量最高的配方4 在兩次發(fā)酵中木質(zhì)素酶活性都呈上升趨勢(shì)，一次發(fā)酵前和二次發(fā)酵結(jié)束后的酶活性差異顯著；其他3 個(gè)配方的培養(yǎng)料酶活性呈先上升后下降的趨勢(shì)，其中無(wú)麥草的配方1培養(yǎng)料經(jīng)過(guò)兩次隧道發(fā)酵后酶活性從最高（0.58±0.02）U/g 降至最低（0.51±0.03）U/g，配方2和配方3培養(yǎng)料發(fā)酵過(guò)程中各時(shí)間點(diǎn)木質(zhì)素酶活性的差異不顯著。

圖3 供試配方培養(yǎng)料發(fā)酵過(guò)程木質(zhì)素酶活性變化

2.2.3 半纖維素酶活性的變化

隧道發(fā)酵過(guò)程中降解培養(yǎng)料中半纖維素的主要酶是內(nèi)切木聚糖酶，其變化趨勢(shì)如圖4 所示，4 個(gè)配方表現(xiàn)出3 種不同的變化趨勢(shì)：配方1 培養(yǎng)料的酶活性變化為先降后升，且二次發(fā)酵結(jié)束后與一次發(fā)酵前的差異不顯著；配方4 培養(yǎng)料經(jīng)過(guò)每一次發(fā)酵后酶活性均明顯地上升；配方2 和配方3 的培養(yǎng)料酶活性為先升后降，且每個(gè)取樣點(diǎn)麥草含量較少的配方2培養(yǎng)料的酶活性都顯著高于麥草含量較多的配方3。

圖4 供試配方培養(yǎng)料發(fā)酵過(guò)程半纖維素酶活性變化

2.2.4 纖維素酶活性的變化

草菇培養(yǎng)料隧道發(fā)酵過(guò)程中纖維素酶活性變化如圖5 所示，4 個(gè)配方的酶活性變化趨勢(shì)一致，均在二次隧道發(fā)酵前出現(xiàn)了酶活性最高峰，其中配方3 的培養(yǎng)料酶活性最高，為（4 414.47±184.80）U/g。在二次隧道發(fā)酵結(jié)束后，除配方4 外，其他3 個(gè)配方的培養(yǎng)料酶活性都顯著高于一次隧道發(fā)酵前。

圖5 供試配方培養(yǎng)料發(fā)酵過(guò)程纖維素酶活性變化

2.3 供試配方培養(yǎng)料栽培草菇產(chǎn)量

4 個(gè)配方培養(yǎng)料栽培草菇采收兩潮后記錄草菇總產(chǎn)量。由表1可知，配方1和配方2的總產(chǎn)量顯著高于配方3、配方4，配方1的出菇表現(xiàn)為第1潮菇產(chǎn)量最高，第2 潮菇產(chǎn)量顯著降低；配方2 的兩潮菇產(chǎn)量相當(dāng)。

表1 供試配方培養(yǎng)料栽培草菇產(chǎn)量統(tǒng)計(jì) 單位：kg/m2

3 小結(jié)與討論

試驗(yàn)表明，當(dāng)培養(yǎng)料含有杏鮑菇菌渣90%和10%的麥草時(shí)，采收兩潮菇的總產(chǎn)量最高，為（7.22±0.03）kg/m2，高于黃桂平采用純杏鮑菇菌渣栽培草菇的產(chǎn)量[9]，同樣隨著麥草比例的上升，產(chǎn)量逐漸降低。林金盛等[10]研究表明以杏鮑菇菌渣為培養(yǎng)料栽培草菇的產(chǎn)量顯著高于以稻草為培養(yǎng)料的產(chǎn)量。這說(shuō)明在草菇生長(zhǎng)過(guò)程中菌渣提供了比麥草更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，菌渣比例越低，產(chǎn)量越低。純菌渣中加入少量麥草，在隧道發(fā)酵過(guò)程中料通氣性更好，培養(yǎng)料發(fā)酵更加徹底。

草菇培養(yǎng)料隧道發(fā)酵時(shí)，除配方1外，其他配方一次隧道發(fā)酵培養(yǎng)料的半纖維素酶活性全部呈上升趨勢(shì)。以廢棉為培養(yǎng)料栽培草菇時(shí)一次發(fā)酵培養(yǎng)料的木質(zhì)纖維素酶變化同樣為上升趨勢(shì)[5]，但以秸稈為主要培養(yǎng)料栽培雙孢蘑菇時(shí)一次隧道發(fā)酵的培養(yǎng)料酶活性變化差異較大[11]，導(dǎo)致這些不同結(jié)果的原因可能與一次發(fā)酵的時(shí)間及條件相關(guān)。二次隧道發(fā)酵酶活性呈下降趨勢(shì)的較多，但在二次隧道發(fā)酵結(jié)束后，所有酶活性均高于一次發(fā)酵前。這說(shuō)明在隧道發(fā)酵時(shí)培養(yǎng)料中的微生物開(kāi)始生長(zhǎng)，并對(duì)培養(yǎng)料中的蛋白質(zhì)、木質(zhì)素、纖維素、半纖維素等分解利用，從而有利于草菇播種后菌絲的萌發(fā)生長(zhǎng)[12]。杏鮑菇菌渣中存在木質(zhì)素含量高的雜木屑，麥草的加入不僅能優(yōu)化培養(yǎng)料結(jié)構(gòu)，提高透氣性，同時(shí)會(huì)額外增加纖維素和半纖維素含量，試驗(yàn)中麥草量與木質(zhì)素酶、纖維素酶和半纖維素酶活性變化差異相關(guān)。

草菇培養(yǎng)料在兩次隧道發(fā)酵過(guò)程中pH 表現(xiàn)出一致的變化規(guī)律，即一次發(fā)酵顯著降低，二次發(fā)酵略微降低，與已報(bào)道的廢棉栽培草菇[5]和菌渣栽培雙孢蘑菇[13]規(guī)律一致。試驗(yàn)發(fā)酵前初始pH 用熟石灰調(diào)整后達(dá)pH 10~11，但二次發(fā)酵結(jié)束后的pH 為8.15~8.50，與趙書(shū)光等[14]報(bào)道的最適pH（7.5 左右）接近，這可能與本試驗(yàn)采用隧道發(fā)酵有關(guān)。

以菌渣為主要培養(yǎng)料的工廠化栽培草菇模式已是近年來(lái)草菇栽培的發(fā)展方向，隧道發(fā)酵則是工廠化栽培草菇中極為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)之一。試驗(yàn)通過(guò)分析供試配方在發(fā)酵過(guò)程的酶活性變化及栽培草菇的產(chǎn)量，篩選出最適宜配方，為工廠化栽培草菇進(jìn)一步降本增產(chǎn)、增效提供數(shù)據(jù)支持。