段建鋒 劉亞亞 秦一統(tǒng) 張秀麗

（慶陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，甘肅慶陽 745000）

子午嶺坐落于甘肅省東部，地處陜、甘交界處，屬溫帶半濕潤氣候，年平均氣溫7.4~8.5 ℃；年無霜期110~150 d；年降水500~620 mm；年平均相對濕度63%~68%。子午嶺森林濕潤的氣候環(huán)境和豐富的腐殖質(zhì)土層，孕育了豐富的藥用植物和真菌種質(zhì)資源。該地區(qū)初步鑒定統(tǒng)計藥用植物共有101科、298種，其中豬苓、羊肚菌、猴頭菌、雙孢蘑菇、木耳等真菌最為常見[1]。微皮傘Marasmiellus是擔(dān)子菌門，層菌綱，傘菌目，小皮傘科，微皮傘屬真菌的總稱[2]。微皮傘屬約含250 個種，其中模式種為檜微皮傘Marasmiellus juniperinusMurrill[3-4]。該屬擔(dān)子果皮傘狀、臍菇狀或側(cè)耳狀，孢子印白色，世界各地均有分布。我國目前有白蓋微皮傘M.albiceps、白褐微皮傘M.albofuscus、白微皮傘M.candidus等 45 個記錄[5-7]。皮傘的藥用較多，眾多研究表明枝生微皮傘Marasmiellus ramealis和硬柄小皮傘Marasmius oreades具有抗腫瘤、抗菌、調(diào)節(jié)免疫和抗衰老等功效[8]，安絡(luò)小皮傘Marasmius androsaceus具有止痛、治療偏頭痛、風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等作用[9]。豬苓作為藥用真菌，以菌核入藥，是我國著名的傳統(tǒng)中藥材。研究分離子午嶺野生豬苓菌核組織，得到菌株Z1j2，運用形態(tài)學(xué)觀察及rDNA-ITS 分子生物學(xué)鑒定的方法鑒定該菌株（GenBank 登錄號為OL351833），并對其生物學(xué)特性進行研究，對豐富當?shù)卣婢N質(zhì)資源及后續(xù)開發(fā)利用具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試豬苓菌種：2019 年9 月于甘肅省慶陽市連家砭子午嶺林區(qū)，坐標北緯 36°02'，東經(jīng) 108°28'，海拔1 260 m，選擇單株產(chǎn)量高、新鮮、有光澤、彈性好的豬苓菌核，低溫處理后帶回實驗室用PDA 培養(yǎng)基[10]進行組織分離而得。

1.2 試驗儀器與試劑

（1）儀器：立式高壓滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、電子天平、生物安全柜、水浴鍋等。

（2）試劑：75%乙醇、無水乙醇、葡萄糖、瓊脂粉、無菌水、鹽酸金霉素溶液。

1.3 試驗方法

1.3.1 組織分離

首先將豬苓菌核清洗干凈，放入0.2%的金霉素溶液中浸一下，立即取出，用無菌棉擦干凈，然后按無菌環(huán)境操作要求，用無菌刀片從豬苓菌核中間切開，用無菌鑷子在菌核中央挑取0.5 cm 大小的菌肉若干塊，迅速將其放于制備好的PDA 培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)基上放4 塊[11]，放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，25 ℃黑暗條件下恒溫培養(yǎng)[12]。每天觀測分離得到的菌落形態(tài)與培養(yǎng)性狀，若發(fā)現(xiàn)有菌絲長出，初步分類并待產(chǎn)孢后進行純化，單孢分離純化采用平板稀釋畫線分離法[13]。

1.3.2 形態(tài)觀察

采用傳統(tǒng)鑒定方法，宏觀特征肉眼觀察、游標卡尺測量等方法，測量菌落直徑，觀察菌絲顏色。查閱文獻進行檢索、比對、初步定種；將分離純化的菌株接種到PDA 培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d 后取出，用透明膠帶的膠面輕輕接觸菌落表面，粘取一定量的菌絲體。在載玻片中央滴一滴乳酸酚棉蘭染液，將粘有菌絲體的透明膠帶完全浸入載玻片的染液內(nèi)，并固定膠帶，自然風(fēng)干后，在光學(xué)顯微鏡下觀察和測量孢子、菌絲形態(tài)及大小[14]。

1.4 ITS鑒定

1.4.1 DNA的提取

將原始菌株擴大培養(yǎng)后利用TIANGEN DNA KIT提取原始菌基因組DNA。

1.4.2 PCR擴增、純化及測序

配置PCR 反應(yīng)液（表1）混勻后在PCR 擴增儀（ABI9700）上進行PCR，反應(yīng)程序如表2。DNA 的提取、擴增產(chǎn)物的純化與測序均由通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司完成。

表1 PCR反應(yīng)體系

表2 PCR反應(yīng)程序

ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'

ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'

1.4.3 ITS序列比對分析

基于測序結(jié)果的ITS 序列，通過Chromas 軟件拼接，在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進行ITS 序列的Blast 比對，從GenBank 下載的ITS 序列（表3），依據(jù)最大似然率從檢索的結(jié)果里挑選出同源性比較高的ITS 序列，先利用ClustalX 在線軟件進行多序列比對，然后利用MEGA7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)育樹的每個分支的統(tǒng)計學(xué)顯著性分析以最大似然法進行檢驗，重復(fù)次數(shù)為1000 次，根據(jù)ident（百分比）最終確定菌株的分類地位。RensKeLandeweer 等[15]認為通過ITS 區(qū)域比對，序列相似性大于99%，鑒別為相同種；序列相似性大于95%且小于99%，鑒別為相同屬。

表3 從GenBank下載的ITS序列來源信息

1.5 菌株Z1j2生物學(xué)特性研究

1.5.1 培養(yǎng)溫度試驗

試驗設(shè)定 5 ℃、10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃等7 個溫度處理，將純化培養(yǎng)7 d 的菌種，用無菌打孔器制成直徑為0.5 cm 菌餅，接種于PDA 培養(yǎng)基中央，置于以上7 個溫度處理的恒溫培養(yǎng)箱。逐日觀察并采用十字交叉法分別測定菌落的直徑，計算菌絲平均生長速度。

1.5.2 pH試驗

PDA 培 養(yǎng) 基用 0.1 mo1/L HCl 或 NaOH 調(diào) 成 pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0等6個梯度后滅菌，制平板，將菌餅接在不同pH 的PDA平板中央，于25 ℃條件下黑暗培養(yǎng)。數(shù)據(jù)測定及計算方法同1.5.1。

1.5.3 菌株Z1j2致死溫度的測定

在刻度試管中加蒸餾水2 mL，封口并高壓滅菌，冷卻后于無菌環(huán)境中接入直徑為0.5 cm的菌餅，置于 25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃的水浴鍋加熱15 min，立即置涼水中冷卻至室溫。將處理后的菌餅接種到PDA平板上。數(shù)據(jù)測定等同1.5.1。

1.5.4 供試碳源試驗

用蔗糖、可溶性淀粉、麥芽糖、甘露醇、果糖代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基等量的葡萄糖，配制含不同碳源培養(yǎng)基，接入直徑0.5 cm 的菌餅，置于25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)。數(shù)據(jù)測定等同1.5.1。

1.5.5 供試氮源試驗

用酵母膏、尿素、硝酸銨、氯化銨、硫酸銨代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基等量的蛋白胨，配制含不同氮源培養(yǎng)基，接入直徑0.5 cm 的菌餅，置于25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)。數(shù)據(jù)測定等同1.5.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 Z1j2菌株的菌落形態(tài)特征

在PDA 培養(yǎng)基上，Z1j2 菌株的菌落為白色，絮狀，氣生菌絲發(fā)達，蓬松，菌絲具有較強的爬壁能力（圖1、圖2）。25 ℃條件下PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，菌落直徑達81 mm，基本長滿培養(yǎng)皿。在光學(xué)顯微鏡和電鏡掃描下觀察到微皮傘菌菌絲形態(tài)如圖3、圖4所示。

圖1 菌絲培養(yǎng)7 d形態(tài)（正面）

圖2 菌絲培養(yǎng)7 d形態(tài)（反面）

圖3 菌絲光學(xué)顯微鏡照片（10×40）

圖4 菌絲掃描電鏡照片（×2 000）

2.2 Z1j2菌株的ITS鑒定

為鑒定試驗中分離獲得的Z1j2 菌株與已知真菌的近緣關(guān)系，并確定其科學(xué)分類地位，利用PCR技術(shù)對分離獲得Z1j2 菌株的ITS 序列進行擴增（圖5）并測序，序列的大小為748 bp。與GenBank中已登錄的序列進行比對分析，菌株Z1j2 與微傘菌屬真菌的ITS 序列相似性達99%以上，利用最大似然率構(gòu)建微皮傘屬系統(tǒng)發(fā)育樹，從系統(tǒng)發(fā)育樹上看到菌株Z1j2 與參照序列Marasmiellussp.（KJ609164.1）聚在同一小分支中（圖6），支持率為40%，結(jié)合菌落形態(tài)和ITS 序列分析，分離獲得的Z1j2 菌株為擔(dān)子菌門Basidiomycota、傘菌目Agaricales、小皮傘科Marasmiaceae、微皮傘屬Marasmiellus真菌。

圖5 Z1j2菌株的PCR產(chǎn)物

圖6 基于ITS序列（ITS1，5.8S rDNA and ITS4）構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（最大似然率）

2.3 溫度試驗結(jié)果

由圖7 可以看出，隨著培養(yǎng)溫度升高，Z1j2 菌株菌絲平均生長速度逐漸加快，當溫度為25 ℃時菌絲平均生長速度達最大值，且與其他溫度差異顯著。培養(yǎng)溫度在25~30 ℃時菌絲生長較快，但培養(yǎng)溫度進一步升高，菌絲的生長受到抑制。

圖7 不同培養(yǎng)溫度下Z1j2菌株菌絲生長情況

Z1j2 菌株菌絲在 50 ℃，處理 15 min 就不能生長，可見菌絲致死溫度為50 ℃（圖8）。

圖8 Z1j2菌株菌絲致死溫度

2.4 pH試驗結(jié)果

由圖9 可以看出，Z1j2 菌株在試驗pH 的培養(yǎng)基上生長表現(xiàn)出差異，隨著pH 升高，菌絲的平均生長速度有下降的趨勢，可見Z1j2 菌株的菌絲生長適宜偏酸性。

圖9 不同pH下Z1j2菌株菌絲生長情況

2.5 碳源試驗結(jié)果

由表4 可知，供試6 種碳源中，以可溶性淀粉為碳源時，微皮傘菌Z1j2 菌絲生長最快，菌絲濃密，菌落邊緣規(guī)則，日平均生長速度為0.82 cm/d，顯著快于其他碳源，果糖、甘露醇、蔗糖、葡萄糖次之，麥芽糖菌絲日均長速最慢，為0.74 cm/d。綜合菌絲日平均生長速度及長勢，Z1j2 菌株固體培養(yǎng)基中的最佳碳源為可溶性淀粉。

表4 不同碳源對Z1j2菌株菌絲生長的影響

2.6 氮源試驗結(jié)果

由表5 可知，以尿素為氮源時Z1j2 菌株菌絲平均生長速度最快，日均長速為0.74 cm/d，顯著快于其他氮源，且菌絲生長粗壯濃密，邊緣規(guī)則，爬壁力強；以蛋白胨、酵母膏、硝酸銨、硫酸銨為氮源時，Z1j2 菌絲生長速度無顯著性差異，氯化銨為氮源時菌絲生長最慢。綜合菌絲平均生長速度及長勢，確定尿素為微皮傘菌Z1j2菌株菌絲生長的最佳氮源。

表5 不同氮源對Z1j2菌株菌絲生長的影響

3 小結(jié)

對子午嶺野生豬苓菌核中分離出的菌株形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果表明，該菌株（Z1j2）為微皮傘屬Marasmiellus真菌。對Z1j2 菌株的生物學(xué)特性研究結(jié)果表明，Z1j2 的最適宜生長溫度為25 ℃，極端低溫和高溫都抑制其生長，菌絲致死溫度為50 ℃。該菌株菌絲生長適宜偏酸性的培養(yǎng)基，最適碳源為可溶性淀粉，最適氮源為尿素。目前關(guān)于南方小皮傘科物種的報道居多，北方微皮傘屬物種的報道較少。子午嶺作為天然氧吧，動物、植物、微生物等種質(zhì)資源都極為豐富[16]，希望通過筆者的研究，吸引更多專家學(xué)者關(guān)注子午嶺野生中藥材和微皮傘屬等真菌物種，以便于今后開發(fā)利用更有價值的真菌資源。