王 婷，張志華，羅芳梅，王方杰，劉 淼，郭麗娜

0 引言

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是以關(guān)節(jié)滑膜炎和關(guān)節(jié)外病變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)的慢性、進(jìn)行性、自身免疫性疾病，全球平均發(fā)病率約為1%，我國(guó)約為0.3%～0.4%，首選治療方法是藥物治療[1]。臨床研究表明，將甲氨蝶呤(Methotrexate，MTX)與糖皮質(zhì)激素聯(lián)用可更好地控制RA的進(jìn)程，緩解炎癥相關(guān)癥狀[2-3]。臨床中已將MTX與糖皮質(zhì)激素短期聯(lián)用作為RA的一線療法[4]。但MTX和Dex的體內(nèi)分布的選擇性差，非特異性分布可導(dǎo)致骨髓抑制、胃腸道功能失調(diào)、肝腎損傷等不良反應(yīng)，且長(zhǎng)期高劑量使用不良反應(yīng)加重[1,5]。RA作為一種慢性疾病需長(zhǎng)期給藥，藥物不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)增加。因此，構(gòu)建新型的遞藥系統(tǒng)成為一個(gè)重要的研究方向。在RA過(guò)程中，快速增殖的滑膜組織需要大量養(yǎng)分，因此會(huì)產(chǎn)生大量的新生血管；同時(shí)，在炎性環(huán)境的刺激下，血管內(nèi)皮相互牽拉，在血管內(nèi)皮間會(huì)形成約700 nm寬的縫隙[6]。因此，納米制劑可利用類似腫瘤組織中的EPR效應(yīng)，被動(dòng)靶向至炎性關(guān)節(jié)處，減少非靶部位的藥物濃度。目前已有許多關(guān)于RA納米遞藥系統(tǒng)的研究[7-11]，但僅可包載單一藥物，難以實(shí)現(xiàn)藥物的共遞送，尚無(wú)共遞送MTX和糖皮質(zhì)激素用于治療RA的相關(guān)報(bào)道。

多巴胺(Dopamine，DA)是一種神經(jīng)遞質(zhì)，其可在堿性條件下發(fā)生氧化自聚，形成聚多巴胺(Polydopamine，PDA)，且易進(jìn)行表面修飾，具有良好的生物相容性和生物可降解性，其可被谷胱甘肽還原酶還原，實(shí)現(xiàn)谷胱甘肽還原酶響應(yīng)的藥物釋放[12-13]，可作為一種良好的藥物載體。PDA不僅能保護(hù)組織免受自由基的損傷，而且增強(qiáng)了中性粒細(xì)胞改善急性炎癥的能力[14]。RA的病變部位是一個(gè)慢性炎癥的微環(huán)境，采用PDA作為藥物載體實(shí)現(xiàn)載藥的同時(shí)，也對(duì)炎癥部位的自由基進(jìn)行清除，緩解RA的炎癥微環(huán)境，輔助一線藥物治療。與物理包裹相比，采用化學(xué)鍵合的方式載藥通常具有較高的載藥量，且可防止藥物的提前釋放[15]。已有大量研究將聚合物與藥物鍵合后通過(guò)自組裝的方式制得了高載藥量的納米粒[16]。因此，本研究選擇PDA作為納米藥物遞送系統(tǒng)的載體，制備MTX/Dex@PDA NPs，研究結(jié)果將為藥物的共遞送提供新思路，課題組后期可在其表面修飾唾液酸(Sialicacid，SA)[17]、葉酸(Folic acid，F(xiàn)A)[7-9]等靶向配體，實(shí)現(xiàn)藥物主動(dòng)靶向遞送至病灶部位。

1 材料與儀器

1.1 主要材料 MTX(上海源葉生物科技有限公司，純度98%)，Dex(上海源葉生物科技有限公司)，丁二酸酐(SA，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，多巴胺鹽酸鹽(DA·HCl，上海畢得醫(yī)藥科技有限公司)，二甲亞砜(DMSO)，氨水，碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)，4-二甲氨基吡啶(DMAP)，二氯甲烷，甲醇，葡聚糖凝膠LH-20，柱層析硅膠(100～200目，300～400目)。

1.2 主要儀器 LCMS-8060液相色譜質(zhì)譜儀[島津儀器(蘇州)有限公司]，UV-2600紫外可見分光光度計(jì)[島津儀器(蘇州)有限公司]，AVANCEⅢ 400M核磁共振波譜儀(美國(guó)BRUKER公司)，CP225D型電子天平(德國(guó)Sartorius公司)，納米粒徑電位分析儀(馬爾文儀器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 MTX-DA的合成、純化及表征

2.1.1 MTX-DA的合成 將60 mg DA·HCl (0.316 mmol)溶于10 ml DMSO中，并加入50 μl氨水，在30 ℃下攪拌2 h，為反應(yīng)體系1。另將72 mg MTX(0.158 mmol)和60.6 mg EDC·HCl (0.316 mmol)溶于5 ml DMSO中，在30 ℃下攪拌2 h，為反應(yīng)體系2。在體系2中先后加入19.3 mg DMAP (0.158 mmol)和反應(yīng)體系1，在30 ℃中攪拌24 h，即得MTX-DA，其合成路線見圖1。

圖1 MTX-DA合成路線

2.1.2 MTX-DA的純化 在15 ml MTX-DA終反應(yīng)溶液中緩慢加入300 ml二氯甲烷，并不斷攪拌，可觀察到有黃色沉淀析出。抽濾，收集沉淀。將沉淀用4 ml甲醇復(fù)溶，然后將溶液用濾膜過(guò)濾。將濾液采取濕法上樣，進(jìn)行葡聚糖凝膠柱層析，以甲醇洗脫，正丁醇醋酸水溶液監(jiān)測(cè)，收集目標(biāo)洗脫液，并將多余洗脫劑旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得黃色油狀液體12.9 mg，產(chǎn)率為11.27%。

2.1.3 MTX-DA的全波長(zhǎng)掃描 將MTX、DA與MTX-DA分別用甲醇配成濃度約為5 mg/ml的稀溶液，使用紫外可見分光光度計(jì)在200～800 nm區(qū)間掃描，得到三者的紫外吸收光譜。MTX-DA、MTX和DA的紫外吸收光譜如圖2，DA在300 nm左右有1個(gè)小的吸收峰，MTX在250～300 nm左右有2個(gè)相近的寬峰，而MTX-DA中出現(xiàn)了MTX和DA的峰形的疊加，初步證明目標(biāo)產(chǎn)物是MTX和DA的鍵合物。

圖2 MTX、DA和MTX-DA的紫外掃描光譜圖

2.1.4 MTX-DA的1H NMR表征 將MTX用氘代DMSO配成濃度為20～30 mg/ml的稀溶液，將DA與MTX-DA分別用氘代甲醇配成濃度為20～30 mg/ml的稀溶液，使用核磁共振波譜儀測(cè)得三者的1H NMR譜圖。

將MTX、DA和MTX-DA的1H NMR譜圖相疊加得到圖3。DA在溶劑氘代甲醇中無(wú)法顯示出氨基、羥基的活潑氫，但可以看出δ 6.77、6.74、6.61的峰是來(lái)源于DA苯環(huán)上的3個(gè)特征氫。MTX的溶劑是氘代DMSO，在δ 8.78、7.81、6.80出現(xiàn)峰信號(hào)，δ 8.78左右是MTX活潑氫的特征峰，推測(cè)δ 6.80是MTX苯環(huán)的特征信號(hào)。而在MTX-DA中δ 8.58處的峰信號(hào)能與MTX的特征峰δ 8.78對(duì)應(yīng)；δ 7.80的峰信號(hào)與MTX的δ 7.81處對(duì)應(yīng)；MTX-DA中δ 6.90、6.70和6.49是來(lái)自MTX與DA苯環(huán)上的特征氫。1H NMR譜圖也證實(shí)MTX與DA成功偶聯(lián)。

圖3 MTX、DA及MTX-DA的1H NMR譜圖

2.1.5 MTX-DA的MS表征 將MTX-DA用甲醇配成濃度為50 ppm左右的極稀溶液，利用質(zhì)譜儀從MS譜圖上確認(rèn)MTX-DA的分子量。MS鑒定(圖4)表明，在負(fù)離子模式下，其中主峰[M-H]-=723.295 10，與1個(gè)MTX和2個(gè)DA分子偶聯(lián)的分子質(zhì)量M=724.72吻合。根據(jù)基團(tuán)分析，MTX的2個(gè)羧基分別與DA的氨基反應(yīng)合成酰胺鍵。

圖4 MTX-DA的MS譜圖

實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，MTX與DA成功偶聯(lián)，反應(yīng)比例為MTX∶DA=1∶2。按照基團(tuán)和分子量分析，MTX與DA成功通過(guò)酰胺反應(yīng)鍵合。

2.2 Dex-SA-DA的合成、純化及表征

2.2.1 Dex-SA-DA的合成 將100 mg Dex(0.254 mmol)、15.52 mg DMAP(0.127 mmol)和50.84 mg SA(0.508 mmol)溶于5 ml丙酮溶液中。密封，在25 ℃下反應(yīng)0.5 h。反應(yīng)完畢后，在50 ℃下旋蒸除去丙酮溶劑。將產(chǎn)物溶解于10 ml無(wú)水乙醇中，隨后不斷加入60 ℃純化水至產(chǎn)生沉淀。加熱回流使沉淀溶解。自然冷卻，在4 ℃下過(guò)夜自然結(jié)晶。在60 ℃下烘干得Dex-SA[18]。本品為白色針狀晶體73 mg，產(chǎn)率為58.12%。

將上一步所得的白色針狀晶體溶解于3.35 mlDMSO中，加入33.82 mg EDC·HCl (0.176 mmol)，在30 ℃下反應(yīng)2 h。將33.45 mg DA·HCl (0.176 mmol)溶解在4 ml DMSO中，并加入35 μl氨水，在30 ℃下攪拌反應(yīng)2 h。將2個(gè)反應(yīng)溶液合并，加入17.96 mg DMAP (0.147 mmol)，在30 ℃下反應(yīng)24 h，得Dex-SA-DA，其合成路線見圖5。

圖5 Dex-SA-DA的合成路線

2.2.2 Dex-SA-DA的純化 在反應(yīng)液中加入80 ml純水，用80×3 ml乙酸乙酯萃取3次，用無(wú)水硫酸鈉干燥有機(jī)層，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙酸乙酯，收集濃縮產(chǎn)物。將產(chǎn)物以少量甲醇溶解，100～200目硅膠拌樣，以300～400目硅膠裝柱，干法上樣，以二氯甲烷-甲醇(15∶1)洗脫，二氯甲烷-甲醇(10∶1)作為展開劑監(jiān)測(cè)，收集洗脫液，旋蒸除去洗脫劑，得30 mg無(wú)色油狀液體，Dex-SA與DA反應(yīng)產(chǎn)率為32.29%。兩步反應(yīng)終產(chǎn)率為18.74%。

2.2.3 Dex-SA-DA的全波長(zhǎng)掃描 將Dex、DA、SA與Dex-SA-DA分別用甲醇配成濃度約為5 mg/ml的稀溶液，使用紫外可見分光光度計(jì)在200～800 nm區(qū)間掃描，得到各自的紫外吸收光譜。

將Dex-SA-DA、Dex、DA及SA以適量甲醇溶解，在紫外可見分光光度計(jì)下掃描得圖6，SA在檢測(cè)波段無(wú)明顯吸收，Dex在240 nm左右有一寬峰，DA在285 nm左右有一小的吸收峰。Dex-SA-DA中出現(xiàn)了Dex和DA的峰形的疊加，Dex與DA二者之間沒(méi)有能夠相互反應(yīng)的基團(tuán)，初步判定Dex先和SA通過(guò)酯鍵鍵合為Dex-SA，Dex-SA和DA通過(guò)酰胺反應(yīng)鍵合。

2.2.4 Dex-SA-DA的1H NMR表征 將Dex、DA、Dex-SA分別用氘代甲醇配成濃度約為20～30 mg/ml的稀溶液，將Dex-SA-DA用氘代DMSO配成濃度在20～30 mg/ml的稀溶液，使用核磁共振波譜儀測(cè)得各自的1H NMR譜圖。

將DA、Dex、Dex-SA與Dex-SA-DA的1H NMR譜圖重疊得圖7，Dex的譜圖中δ 7.43的d峰，6.31的dd峰和6.10的s峰，是來(lái)自2個(gè)雙鍵上的特征氫。Dex-SA的譜圖中，δ 7.45、6.31和6.10處的峰與Dex的特征峰對(duì)應(yīng)，所以Dex-SA中Dex的結(jié)構(gòu)依然存在。由于氘代甲醇無(wú)法顯示活潑氫，所以無(wú)法確認(rèn)SA的羧基。Dex-SA-DA中，溶劑氘代DMSO可顯示出活潑氫，δ 8.74、8.67、7.96處的氫來(lái)自氨基或者羥基，δ 7.96、7.32、6.63處對(duì)應(yīng)于Dex雙鍵上的特征峰；此外，δ 6.43的d峰、6.23的d峰和6.01的s峰是來(lái)自DA苯環(huán)上的3個(gè)特征氫，表明Dex-SA-DA中Dex和DA存在。

圖7 DA、Dex-SA、Dex及Dex-SA-DA的1H NMR譜圖

2.2.5 Dex-SA-DA的MS表征 將Dex-SA與Dex-SA-DA用甲醇配成濃度為50 ppm左右的極稀溶液，利用質(zhì)譜儀從MS譜圖上確認(rèn)兩者的分子量。Dex-SA的MS譜圖(圖8)顯示，在正離子模式下，主峰[M+H]+=493.217 99，Dex-SA的分子質(zhì)量M=492.53，從分子質(zhì)量上確證，最終確定Dex-SA成功合成。Dex-SA-DA的MS譜圖(圖9)顯示，在正離子模式下，主峰[M+H]+=628.284 85，Dex-SA-DA的分子質(zhì)量M=627.67，在分子質(zhì)量上確證。

圖8 Dex-SA的MS譜圖

圖9 Dex-SA-DA的MS譜圖

2.3 MTX/Dex@PDA NPs的制備 將3.2 ml MTX-DA反應(yīng)液和2.8 ml Dex-SA-DA反應(yīng)液先后加入25 ml 10 mM的Tris緩沖液與5 ml乙醇的混合溶液中，在30 ℃的溫度下攪拌24 h，溶液逐漸變?yōu)榛液谏玫組TX/Dex@PDA NPs。

2.4 MTX/Dex@PDA NPs的放置穩(wěn)定性 制得MTX/Dex@PDA NPs放置24 h未出現(xiàn)絮積或沉淀，表明制備的納米粒性質(zhì)較穩(wěn)定。

2.5 MTX/Dex@PDA NPs的粒徑分布 取制備好的MTX/Dex@PDA NPs溶液，用超純水稀釋至能透光，再取1 ml稀釋后的納米粒溶液注入樣品池中，加蓋后放入粒徑儀中進(jìn)行粒徑、電位的測(cè)量。MTX/Dex@PDA NPs平均粒徑為(295.8±3.69) nm，電位為(-30.5±0.49) mV，表明納米粒大小均一，其粒徑分布見圖10。

圖10 MTX/Dex@PDA NPs的粒徑分布

3 討論

3.1 化學(xué)鍵合載藥 考慮到MTX-DA酰胺鍵較穩(wěn)定，本研究探索使用容易斷裂的其他化學(xué)鍵如亞胺鍵進(jìn)行連接，如采用MTX與DA的另一類似物3,4-二羥基苯甲醛(3,4-Dihydroxy benzlaldehyde，DHB)進(jìn)行席夫堿反應(yīng)來(lái)合成MTX-DHB，但由于席夫堿反應(yīng)條件苛刻，無(wú)水無(wú)氧的條件難以控制，采用TLC監(jiān)測(cè)顯示未能成功合成MTX-DHB，有待探索MTX與DA類似物的其他化學(xué)成鍵方式。因Dex無(wú)法直接與DA成鍵，本研究選擇DA的類似物3,4-二羥基苯丙酸(3,4-dihydroxy benzene propanoic acid，DHPA)與Dex反應(yīng)，以酯鍵連接合成Dex-DHPA。但在預(yù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)該方案的反應(yīng)原理與預(yù)期并不相符，分離純化困難。之后改用SA作為橋梁，先合成Dex-SA，再用Dex-SA與DA反應(yīng)為Dex-SA-DA。經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)此方案簡(jiǎn)單易行，且易于純化，最后本研究采用了此種方案。鍵合藥是否能釋放MTX與Dex來(lái)發(fā)揮靶向治療作用尚需通過(guò)后期體內(nèi)外相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

3.2 MTX/Dex@PDA NPs 本研究采用MTX-DA及Dex-SA-DA的反應(yīng)液初步制備了MTX/Dex@PDA NPs，雙載藥納米粒常溫下放置24 h 穩(wěn)定，粒徑均一。研究結(jié)果表明，DA可通過(guò)化學(xué)鍵合的方式作為共遞送藥物的納米載體。課題組將對(duì)雙載藥納米粒制備時(shí)的反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度和反應(yīng)體系等進(jìn)一步優(yōu)化，并對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的表征，以用于課題組后續(xù)制備SA、FA等修飾的多功能靶向納米遞藥系統(tǒng)。

4 結(jié)論

MTX/Dex@PDA NPs的粒徑均一，制備方法簡(jiǎn)單，可作為藥物共遞送的新思路，也為構(gòu)建聯(lián)合治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的多功能靶向納米遞藥系統(tǒng)提供了實(shí)踐依據(jù)。