楊炎，夏俊，王慶，何穎琳，張勇，趙會(huì)宏，楊慧榮，4

1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院/海洋生物資源保護(hù)與利用粵港聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510642

2. 新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所/新疆畜牧科學(xué)院動(dòng)物臨床醫(yī)學(xué)研究中心，新疆烏魯木齊830000

3. 中山大學(xué)水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物研究所/廣東省水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物良種繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510275

4. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)中山創(chuàng)新中心，廣東中山528400

肌肉生長(zhǎng)抑制素（mstn，myostatin）又稱生長(zhǎng)分化因子8（gdf-8），抑制肌肉細(xì)胞的增殖與分化，是骨骼肌的生長(zhǎng)的負(fù)調(diào)控因子［1-4］。研究表明，mstn在魚類中的表達(dá)與在哺乳動(dòng)物中主在骨骼肌中的表達(dá)不同，目前已經(jīng)在魚類的多種組織中檢測(cè)到了mstn的表達(dá)［5-8］，這表明mstn在魚類中可能存在多種功能。

生肌過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，在此過(guò)程中，mstn與包括和生肌決定因子-5（myf5，myogenic factor 5）、肌分化決定因子（myod，myogenic differentiation）、肌肉生成素（myog，myogenin）、成肌調(diào)節(jié)因子（mrf4，myogenic regulatory factor 4）在內(nèi)的肌源性調(diào)節(jié)因子（mrfs，myogenic regulatore factors）在調(diào)節(jié)肌源性細(xì)胞的增殖和分化方面存在相互關(guān)系［4，9-10］，而依賴性激酶抑制因子（p21）與細(xì)胞增殖有關(guān)［11-12］。目前，人們認(rèn)為Smads 是介導(dǎo)mstn信號(hào)的介質(zhì)，Smads蛋白可以協(xié)助mstn對(duì)肌肉細(xì)胞的增殖與分化進(jìn)行調(diào)控［13-15］。一方面，mstn通過(guò)調(diào)節(jié)p21的表達(dá)來(lái)調(diào)控細(xì)胞增殖［16-18］，另一方面，mstn可以通過(guò)調(diào)控mrfs的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的分化［19-21］。

在以往關(guān)于mstn的研究中，研究對(duì)象多集中于豬、牛、羊等哺乳動(dòng)物，針對(duì)魚類的相關(guān)研究較少。斜帶石斑魚Epinephelus coioides，屬于硬骨魚綱Osteichthyes、鱸形目Perciformes、鮨科Serranidae、石斑魚亞科Epinephelinate。由于石斑魚肉質(zhì)肥美鮮嫩、高蛋白、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，是我國(guó)南方和東南亞國(guó)家和地區(qū)大力發(fā)展的經(jīng)濟(jì)魚類。因此，本研究以斜帶石斑魚為研究對(duì)象。通過(guò)石斑魚的GS 細(xì)胞系和肌肉原代細(xì)胞對(duì)mstn的功能進(jìn)行初步探究，揭示了Mstn 的亞細(xì)胞定位、Mstn 重組蛋白對(duì)mstn信號(hào)通路下游及相關(guān)基因的影響，初步推測(cè)Mstn 在斜帶石斑魚肌肉細(xì)胞增殖分化中的生理功能。

1 材料與方法

1.1 材料

斜帶石斑魚體質(zhì)量（31.6±6.7）g，體長(zhǎng)（12.8±1.0）cm，購(gòu)自廣東省海洋漁業(yè)試驗(yàn)中心；取樣時(shí)，首先用丁香酚將實(shí)驗(yàn)魚麻醉，然后用φ=75%的乙醇擦拭魚體表，迅速將部分肌肉組織取下，一部分保存至含有Sample Protector for RNA/DNA（TAKARA，Japan）的1.5 mL 中；另一部分保存至含有φ=10%雙抗（青霉素、鏈霉素）的L15 培養(yǎng)液。取樣過(guò)程所用剪刀、鑷子、刀片等用φ=75%的乙醇擦拭后全部高壓滅菌，所有的實(shí)驗(yàn)用具紫外滅菌30 min。取樣過(guò)程于超凈臺(tái)中進(jìn)行，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作均在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的相關(guān)指導(dǎo)下進(jìn)行。Mstn 重組蛋白交由金斯瑞生物科技有限公司合成，其生物活性經(jīng)肌肉原代細(xì)胞和Thermo Varioskan LUX 多功能酶標(biāo)儀測(cè)試。

1.2 肌肉原代細(xì)胞的培養(yǎng)

將取樣的肌肉組織塊用含有φ=10%雙抗的L15培養(yǎng)液清洗3 次，然后剪成1 mm×1 mm×1 mm 左右的小塊放入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，放入28 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱7～8 h。向組織塊上滴加含有φ=4%雙抗以及φ=20%胎牛血清（FBS）（Gibco，USA）的L15培養(yǎng)液后正面放入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞從組織塊爬出，補(bǔ)加培養(yǎng)液至5 mL。細(xì)胞爬滿培養(yǎng)瓶后，用胰酶（Gibco，USA）將細(xì)胞消化成細(xì)胞懸液，去掉組織塊后離心棄上清，用2.5 mL 原來(lái)的培養(yǎng)液將剩余細(xì)胞吹打均勻，轉(zhuǎn)至培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)充含φ=1%雙抗和φ=20% FBS 的L15 培養(yǎng)液至5 mL。定期在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待培養(yǎng)瓶中細(xì)胞鋪滿一層后用胰酶消化，用含φ=1%雙抗和φ=10%～20%血清的培養(yǎng)液進(jìn)行半換液培養(yǎng)。

1.3 肌肉原代細(xì)胞的增殖

1.3.1 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞增殖在5 個(gè)96 孔板中（100 μL/孔）接種細(xì)胞懸液，每孔約2 000 個(gè)細(xì)胞，24 h后用1 000 nmol/L Mstn處理，對(duì)照組用相同體積的PBS 處理，空白組不做處理，每組8 個(gè)重復(fù)。每天同一時(shí)間取出96孔板，每孔加入10 μL CCK-8溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 處的吸光度，連續(xù)5 d，然后繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.3.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期在6 孔板（1.6 mL/孔）接種細(xì)胞懸液，24 h后用1 000 nmol/L Mstn蛋白處理，對(duì)照組用相同體積的PBS處理，每組3 個(gè)重復(fù)。24 h 后用無(wú)EDTA 的胰酶消化細(xì)胞，800g離心5 min，去上清。用4 ℃的PBS清洗細(xì)胞2次，后加入250 μL PBS 重懸細(xì)胞，然后加入750 μL 4 ℃無(wú)水乙醇，4 ℃固定過(guò)夜。樣品離心去上清，用4℃PBS清洗1次，再次離心去上清。加入Rnase A 溶液20 μL，37 ℃水浴30 min。加入PI 染色液至體積分?jǐn)?shù)為50 μL/mL，緩慢并充分混勻后4 ℃避光孵育30 min，染色完成后在24 h內(nèi)完成流式檢測(cè)。

1.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與細(xì)胞轉(zhuǎn)染

為了構(gòu)建mstn的表達(dá)載體，分別用含有限制性酶切位點(diǎn)KpnI和Bamh I的引物擴(kuò)增。目的基因被插入到pEGFP-C1 載體中。引物序列見(jiàn)表1。得到的重組質(zhì)粒通過(guò)DNA 測(cè)序確認(rèn)。Ezgene Endo-Free Plasmid Kit（BioMIGA，USA）用于獲得無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒。Lipofectamine 2000（Invitrogen，USA）用于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染GS細(xì)胞。使用詳見(jiàn)相關(guān)試劑盒說(shuō)明書。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)

分別用10、100 和1 000 nmol/L 的Mstn 處理原代細(xì)胞。以PBS 處理作為對(duì)照，每組4 個(gè)重復(fù)。24 h 后用胰酶消化收集細(xì)胞，提取RNA 后利用ReverTra Ace?qPCR RT Kit（TOYOBO，Japan）反轉(zhuǎn)錄。以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，利用SYBR?Green Realtime PCR Master Mix（TOYOBO，Japan）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量，測(cè)定p21、smad3、mrf4、myod和myog的表達(dá)情況。引物序列見(jiàn)表1。使用詳見(jiàn)相關(guān)試劑盒說(shuō)明書。

表1 引物列表Table 1 List of primers

1.6 數(shù)據(jù)處理

利用Graphpad Prism 8.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，用2-△△Ct法進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（means±SD）。當(dāng)P＜0.05時(shí)，認(rèn)為具有顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 斜帶石斑魚Mstn亞細(xì)胞定位分析

為了檢測(cè)Mstn 在細(xì)胞中的定位，將pEGFPMSTN 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至GS 細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染pEGFP-C1 質(zhì)粒至GS 細(xì)胞作為對(duì)照。利用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)pEGFP-MSTN 過(guò)表達(dá)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中都觀察到了呈點(diǎn)狀分布的綠色熒光（圖1）。這表明Mstn在GS細(xì)胞中呈細(xì)胞質(zhì)分布，Mstn蛋白在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。

圖1 Mstn亞細(xì)胞定位Fig.1 Subcellular localization of Mstn

2.2 Mstn重組蛋白對(duì)肌肉原代細(xì)胞增殖的影響

為了檢測(cè)mstn對(duì)肌肉細(xì)胞增殖的影響，本研究用Mstn 重組蛋白分別刺激肌肉原代細(xì)胞1、2、3、4 和5 d，通過(guò)用酶標(biāo)儀測(cè)定肌肉原代細(xì)胞每天的A值，再繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。研究發(fā)現(xiàn)，用Mstn 重組蛋白處理的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)明顯減緩，第1天時(shí)，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的活性差異就達(dá)到了顯著性水平，并且隨著處理時(shí)間的增加，細(xì)胞活性差異進(jìn)一步擴(kuò)大（圖2a）。同時(shí)，在用Mstn重組蛋白刺激肌肉原代細(xì)胞24 h后，收集6孔板中的細(xì)胞制作細(xì)胞懸液，固定后染色，用流式細(xì)胞儀對(duì)處理后的樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比（圖2b），Mstn 重組蛋白處理后的細(xì)胞在S 期受阻，細(xì)胞周期受阻（圖2c）。

圖2 Mstn重組蛋白對(duì)肌肉原代細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effect of Mstn recombinant protein on proliferation of muscle primary cells

2.3 Mstn重組蛋白對(duì)mstn信號(hào)通路下游及相關(guān)基因的影響

為了檢測(cè)mstn對(duì)肌肉原代細(xì)胞分化的影響，本研究設(shè)計(jì)了斜帶石斑魚myod、myog、smad3、mrf4、p21等增殖分化相關(guān)的定量引物，在用不同濃度的Mstn 重組蛋白處理后，通過(guò)RT-qPCR 來(lái)測(cè)定這些基因的表達(dá)。結(jié)果如圖3所示，與對(duì)照組相比，p21mRNA 的表達(dá)隨著處理濃度的升高而上升，當(dāng)處理濃度為100 和1 000 nmol/L 時(shí)存在顯著性差異；smad3mRNA 和mrf4mRNA 的表達(dá)均隨著處理濃度的升高而上升，但趨勢(shì)并不明顯，始終不存在顯著性差異；myodmRNA和myogmRNA的表達(dá)均隨著處理濃度的升高而下降，但myodmRNA 下降趨勢(shì)并不顯著，myogmRNA 則有著明顯的下降，在處理濃度為100 和1 000 nmol/L 時(shí)存在顯著性差異。

圖3 不同濃度Mstn重組蛋白處理對(duì)mstn信號(hào)通路下游及相關(guān)基因的影響Fig.3 Effects of different concentrations of Mstn recombinant protein treatment on downstream mstn signaling pathway and related genes

3 討 論

在肌肉細(xì)胞中，mstn被認(rèn)為是抑制肌肉生長(zhǎng)的強(qiáng)負(fù)調(diào)節(jié)因子［2，13，22-23］。研究證明，mstn的負(fù)調(diào)節(jié)作用主要是抑制細(xì)胞尤其是抑制肌肉細(xì)胞的增殖和分化［16，24-27］。

在本次研究中，亞細(xì)胞定位分析結(jié)果表明，綠色熒光在細(xì)胞質(zhì)中呈點(diǎn)狀分布，表明Mstn 蛋白在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。在山羊中，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)Mstn 定位于高爾基體、質(zhì)膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜［28］，證明Mstn定位于細(xì)胞質(zhì)的結(jié)果是可靠的。

通過(guò)對(duì)mstn信號(hào)通路下游及相關(guān)基因進(jìn)行RTqPCR 檢測(cè)，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組p21、smad3和mrf4的表達(dá)量均高于對(duì)照組，而實(shí)驗(yàn)組myod和myog的表達(dá)量均低于對(duì)照組。經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，其中p21的表達(dá)量在Mstn 處理濃度為中濃度和高濃度時(shí)與對(duì)照組相比具有顯著性差異，而smad3和mrf4雖然具有升高的趨勢(shì)，但與對(duì)照組相比不具有顯著性差異，表達(dá)量下降的myod和myog與對(duì)照組相比也不具有顯著性差異。許多研究表明，Mstn 結(jié)合跨膜受體結(jié)合來(lái)觸發(fā)信號(hào)傳導(dǎo)［13-14，19，29］。在受體下游，Smads被證明是mstn信號(hào)的典型介體［13-15，30-31］，因此認(rèn)為mstn是通過(guò)經(jīng)典的Smads 信號(hào)通路起作用。Smad3轉(zhuǎn)導(dǎo)TGF-β的信號(hào)，屬于受體激活的Smads。本研究中，用Mstn 刺激肌肉原代細(xì)胞之后，我們檢測(cè)到smad3mRNA 的表達(dá)升高，進(jìn)一步證明mstn對(duì)smad3具有調(diào)節(jié)作用。Mrfs家族相關(guān)基因是肌源性調(diào)節(jié)因子，它們對(duì)肌肉細(xì)胞增殖與分化具有重要影響，在不同的發(fā)育時(shí)期按照一定的順序進(jìn)行表達(dá)，對(duì)肌肉細(xì)胞的分化進(jìn)行調(diào)節(jié)［32-33］。本研究中，在Mstn 刺激后，mrf4的表達(dá)有了一定程度的上升，myod和myog表達(dá)量有一定程度的下降。已有研究證明，mstn信號(hào)傳導(dǎo)誘導(dǎo)Smad3 磷酸化并增加Smad3 與Myod 的相互作用，同時(shí)，mstn通過(guò)作用于Smads 復(fù)合物導(dǎo)致mrfs 家族成員如myog和myod的表達(dá)量下降［19］；抑制小鼠中的mstn，發(fā)現(xiàn)mrf4表達(dá)下降［34］。因此，推測(cè)在用Mstn 刺激后，細(xì)胞內(nèi)smad3表達(dá)量上升，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)加強(qiáng)，作用于smad3下游影響細(xì)胞分化的mrfs家族，導(dǎo)致myod、myog表達(dá)量下降和mrf4表達(dá)量的上升，來(lái)促進(jìn)肌肉原代細(xì)胞的分化。

另外，用Mstn 刺激后，細(xì)胞內(nèi)的p21表達(dá)量上升。研究表明，p21是細(xì)胞增殖的抑制基因［35-37］。Mstn 可 以 抑 制 成 肌 細(xì) 胞 的 增 殖［9，38-41］。Mstn 通過(guò)上調(diào)p21的表達(dá)來(lái)抑制肌肉細(xì)胞的增殖［9］。本研究中用Mstn處理肌肉原代細(xì)胞后檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)p21表達(dá)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)的結(jié)果與已有研究相符。為了進(jìn)一步驗(yàn)證mstn對(duì)肌肉細(xì)胞增殖的影響，通過(guò)用Mstn 處理肌肉原代細(xì)胞，在酶標(biāo)儀上檢測(cè)在不同處理時(shí)間的吸光度并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖，并通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。根據(jù)生長(zhǎng)曲線可以看出，在用Mstn刺激后，細(xì)胞的增殖被抑制，這與此前研究中mstn抑制肌肉細(xì)胞增殖的結(jié)果相符［9，38-41］。而流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果也證明，被Mstn重組蛋白處理過(guò)后，細(xì)胞停滯在S 期，G2 期細(xì)胞比例減少，細(xì)胞周期受阻。因此，推測(cè)本研究中Mstn 上調(diào)細(xì)胞中p21的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞周期受阻，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞增殖受阻，證明Mstn 抑制肌肉原代細(xì)胞的增殖。

本研究以斜帶石斑魚的GS 細(xì)胞和肌肉原代細(xì)胞為研究對(duì)象，揭示了Mstn 的亞細(xì)胞定位、Mstn重組蛋白對(duì)mstn信號(hào)通路下游及相關(guān)基因及對(duì)肌肉細(xì)胞增殖的影響。證明了Mstn 在斜帶石斑魚GS細(xì)胞中呈點(diǎn)狀分布；Mstn 重組蛋白上調(diào)smad3、mrf4的表達(dá)，下調(diào)myod、myog的表達(dá)，來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化；同時(shí)Mstn 重組蛋白能上調(diào)p21的表達(dá)，抑制細(xì)胞的增殖。驗(yàn)證了Mstn 在肌肉發(fā)育過(guò)程中的生物學(xué)功能，為后續(xù)深入開(kāi)展Mstn 對(duì)魚類肌肉發(fā)育的影響研究奠定了理論基礎(chǔ)。