朱留鑫，楊建，司東明，路永坤，李鵬飛，楊建軍

河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450001

蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid haemorrhage，SAH)是臨床上常見的一種腦血管疾病，多由顱內(nèi)動脈瘤破裂、腦動脈畸形、高血壓、外傷等因素造成，患者發(fā)病年齡低，致殘、致死率極高，每10萬人中有7.2～10.5人患此病，約占中風的5%，嚴重威脅人類健康[1-2]。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展和臨床經(jīng)驗的積累，患者死亡率和致殘率有所下降。因動脈瘤破裂出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙的發(fā)生率較高，SAH患者遭受持久的心理和身體影響[3]。早期腦損傷(early brain injury，EBI)和腦血管痙攣是蛛網(wǎng)膜下腔出血的主要并發(fā)癥[4]。研究表明，EBI的主要原因有神經(jīng)炎癥反應和氧化應激，最終導致神經(jīng)元損傷和死亡[5-6]。目前，通過藥物抑制劑或基因干預技術(shù)抑制炎癥反應已成為治療SAH所致腦損傷的一種策略。紅花具有多種功能，已有千年的栽培和用藥歷史，常用于治療各種疾病，如婦科、心血管、腦血管疾病以及瘀血、骨質(zhì)疏松癥等[7-9]。研究表明，紅花的主要有效成分紅花多糖具有抗氧化、抗癌、降血壓、抗凝血、抗感染及增強免疫等作用[10-15]?；诖?，本實驗探討紅花多糖對蛛網(wǎng)膜下腔出血模型大鼠早期腦損傷的保護作用。

1 材料

1.1 動物50只4～6月齡健康成年雄性SD大鼠，體質(zhì)量300～350 g，購自斯萊克實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(滬)[2017-005]。動物實驗方案經(jīng)河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院動物實驗倫理委員會審批通過，倫理批號：DWLL202007011。按需給予食物和水，定期更換墊料、清理和消毒。

1.2 藥物與試劑紅花(河北省安國市遠光藥業(yè)有限公司，批號：0467191601)；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)溶液、碘化丙啶(propidium iodide，PI)、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)(北京索萊寶科技有限公司，貨號：C0065、P8080、E8040)；抗白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)抗體、抗腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)抗體、抗IL-1β抗體、抗IL-18抗體(美國Abcam公司，貨號：ab233706、ab183218、ab216995、ab243091)；半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白水解酶1(caspase1)抗體、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)抗體、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)抗體、β-actin抗體、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)二抗(美國Santa Cruz公司，貨號：sc-398715、sc-134306、sc-514414、sc-8432、sc-358798)；活性氧(reactive oxygen species，ROS)測定試劑盒(化學熒光法)、脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導的缺口末端標記法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay，TUNEL)細胞凋亡原位檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號：E004、G001-4)；PierceTMBCA蛋白定量試劑盒(美國Pierce公司，貨號：23225)。

1.3 儀器全自動酶標儀(美國 Thermo Fisher Scientific公司，型號：Synergy HTX)；CO2培養(yǎng)箱(德國 Binder 公司，型號：C170)；超薄切片機(德國 Leica 公司，型號：EMUC7)；垂直電泳槽(美國 Bio-Rad公司，型號：MiniProtein)。

2 方法

2.1 紅花多糖溶液的制備將干燥紅花200 g在 2 L 水中充分浸泡后煎煮1 h，共煎煮4次。將濾液混合濃縮至總體積的1/4后，加入體積分數(shù)95%乙醇，用醇沉法沉淀得到紅花多糖(safflower polysaccharide，SPS)，200 g·min-1離心5 min，將SPS溶解于去離子水中，用乙醇沉淀2次。采用硫酸-苯酚法測定SPS含量，純度可達76.05%，用PBS將SPS配制成濃度為40 g·L-1的溶液。

2.2 SAH模型建立、動物分組與給藥隨機從50只SD大鼠中選取15只為假手術(shù)組，其余大鼠建立SAH動物模型[16]，具體如下：以40 mg·kg-1的劑量腹腔注射1%戊巴比妥麻醉大鼠后，進行常規(guī)備皮和消毒，在大鼠頸部進行手術(shù)切口，充分暴露右側(cè)總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，將頸外動脈向遠端橫切后將3-0單絲尼龍縫合線置于內(nèi)部，通過頸內(nèi)動脈插入并推進直至感覺到阻力。將縫合線進一步推進約3～5 mm進行動脈穿孔并產(chǎn)生SAH，停留10 s后拔出尼龍線。假手術(shù)組大鼠除了不刺破血管壁外，其余操作均與造模大鼠一致。將造模成功的30只大鼠隨機分為模型組和紅花多糖組，每組15只。紅花多糖組大鼠給予400 mg·kg-1的紅花多糖溶液灌胃，假手術(shù)組和模型組灌胃給予等體積生理鹽水，每天1次，持續(xù)14 d。

2.3 SAH大鼠神經(jīng)系統(tǒng)評分通過對大鼠自主運動、運動協(xié)調(diào)、身體活動和軀體感覺等評估SAH大鼠的神經(jīng)功能[17]。根據(jù)改良Garcia評分，對觸電反應、肢體對稱性、本體感覺、攀爬、自發(fā)活動、前肢伸展等6項測試進行評分，并測量總分，得分越低表明損傷越嚴重。一個獨立的觀察者進行所有的評估。

2.4 SAH大鼠腦水腫評估每組取10只大鼠，于末次給藥24 h后斷頭處死，取整個大腦并直接稱其質(zhì)量。大鼠的大腦在100 ℃脫水24 h后，稱其干質(zhì)量。

腦含水量的百分比=(濕質(zhì)量-干質(zhì)量)/濕質(zhì)量×100%

2.5 ROS測定每組取5只大鼠，于末次給藥 24 h 后麻醉斷頭處死，分離腦組織。取每只大鼠的新鮮腦組織0.5 g，按質(zhì)量體積比120的比例加入PBS，對大鼠腦組織進行勻漿。勻漿液在4 ℃下 1 000 r·min-1離心10 min，取上清，取1 mol·L-1DCFH-DA 10 μL和上清液190 μL混合于96孔板中，190 μL上清液中加入10 μL PBS作為對照。樣品在3 ℃、480 nm激發(fā)波長和520 nm發(fā)射波長下孵育30 min后，用熒光分光光度法檢測ROS的水平，ROS水平以熒光強度/克蛋白表示。

2.6 Western Blot檢測相關(guān)蛋白表達水平將儲存于-80 ℃的大鼠腦組織剪成小塊，加入RIPA裂解液(含0.2 % SDS)進行裂解，然后在4 ℃下 14 000 g 離心10 min。收集細胞總蛋白，并加入1×SDS上樣緩沖液。以牛血清白蛋白為標準物測量蛋白質(zhì)含量后進行SDS-PAGE電泳，然后電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，并在室溫下用PBST和5%BSA封閉 1 h。加入一抗(IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-18、 cleaved caspase 1、NLRP3、ASC稀釋比例為1500，β-actin稀釋比例為11 000)，4 ℃孵育過夜。然后加入HRP二抗(稀釋比例為1500)，在室溫下孵育1 h。使用ECL Western印跡試劑盒對膜顯色，Image J軟件分析，并用光密度測定法計算目的蛋白與β-actin蛋白條帶的比值。

2.7 熒光染色于末次給藥24 h后麻醉斷頭處死，分離腦組織。大鼠腦部組織切片，加入體積分數(shù)3%過氧化氫液，PBS連續(xù)沖洗3次，每次3 min；滴加濃度為0.1%檸檬酸鈉通透液，4 ℃孵育2 min；向切片滴加1 g·L-1PI蓋住組織，放置在4 ℃冰箱中。常溫下進行45 min復溫，PBS沖洗3次，并加入 1 mg·L-1DAPI染色液將標本進行覆蓋。15 min 后將多余的DAPI染色液去除，PBS清洗3次，每次 3 min。DAPI 染色完畢后加入淬滅封片劑完成封片處理，熒光顯微鏡下觀察切片細胞情況，每組5只。

PI陽性率=PI陽性細胞數(shù)/DAPI陽性細胞數(shù)×100%

2.8 TUNEL分析評估大腦皮層中細胞凋亡的嚴重程度將制備好的切片用TUNEL染色混合物處理，37 ℃下在潮濕的暗室中孵育60 min。在黑暗中于22 ℃下添加DAPI底物，孵育5 min。通過熒光顯微鏡監(jiān)測所有過程，每組5只。TUNEL陽性率是根據(jù)TUNEL染色試劑盒制造商的說明書進行的。

TUENL陽性率=TUNEL陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%

3 結(jié)果

3.1 紅花多糖對SAH大鼠神經(jīng)功能的影響與假手術(shù)組相比，模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評分降低；與模型組相比，紅花多糖組大鼠神經(jīng)功能缺損評分升高，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 紅花多糖對SAH大鼠神經(jīng)功能的影響

3.2 紅花多糖對SAH大鼠腦水腫的影響與假手術(shù)組相比，模型組腦組織含水量升高；與模型組相比，紅花多糖組腦組織含水量降低，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 紅花多糖對SAH大鼠腦水腫的影響

3.3 紅花多糖對SAH大鼠ROS的影響與假手術(shù)組相比，模型組腦組織ROS含量升高；與模型組相比，紅花多糖組大鼠腦組織ROS含量降低，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 紅花多糖對SAH大鼠ROS的影響

3.4 紅花多糖對SAH大鼠IL-6、IL-1β、IL-18和TNF-α蛋白表達水平的影響與假手術(shù)組相比，模型組IL-6、IL-1β、IL-18和TNF-α蛋白表達水平升高；與模型組相比，紅花多糖組 IL-6、IL-1β、IL-18和TNF-α蛋白表達水平降低，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1，表4。

圖1 Western Blot檢測SAH大鼠IL-6、IL-1β、IL-18和TNF-α蛋白表達

表4 紅花多糖對SAH大鼠IL-6、IL-1β、IL-18和TNF-α蛋白表達水平的影響

3.5 紅花多糖對SAH大鼠NLRP3、ASC和cleaved caspase1蛋白表達水平的影響與假手術(shù)組相比，模型組NLRP3、ASC和cleaved caspase1蛋白表達水平升高；與模型組相比，紅花多糖組NLRP3、ASC和cleaved caspase1蛋白表達水平降低，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表5，圖2。

圖2 Western Blot 檢測SAH大鼠NLRP3、ASC和cleaved caspase1蛋白表達

表5 紅花多糖對SAH大鼠NLRP3、ASC和cleaved caspase1蛋白表達水平的影響

3.6 紅花多糖對SAH大鼠神經(jīng)細胞凋亡的影響與假手術(shù)組相比，模型組TUNEL和PI陽性率顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，紅花多糖組TUNEL和PI陽性率顯著降低，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表6，圖3。

表6 紅花多糖對SAH大鼠神經(jīng)細胞凋亡的影響

圖3 各組大鼠PI染色示意圖

4 討論

蛛網(wǎng)膜下腔出血的死亡率很高，且幸存者可能存在終生損傷，這可能是顱內(nèi)壓急劇升高，腦灌注減少導致的全局性腦缺血及神經(jīng)代謝危機[18]。雖然動脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血的發(fā)生率低于缺血性中風，但它發(fā)生在較年輕的患者群體，死亡率較高，對患者生活質(zhì)量造成嚴重損害[19]。因此，在SAH的背景下，以治療神經(jīng)炎癥為目標，可減輕腦損傷并有益于提高神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者預后[20]。中醫(yī)對SAH的記載始于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，病灶部位在于腦，但其形成與心、肝、脾、腎等皆有關(guān)聯(lián)，臟腑功能衰減，氣血逆亂，在標為瘀血內(nèi)阻，風火相煽，形成本虛標實的證候。丹紅注射液[21]、大株紅景天注射液[22]、丹參川芎嗪注射液[23]等中藥可用于治療或預防SAH以及SAH后腦血管痙攣。

紅花多糖是菊科植物紅花(CarthamustinctoriusL.)的干燥花的主要有效成分之一，具有抗腫瘤、提高免疫等作用[24-25]。紅花多糖可通過抑制Wnt/β-catenin信號通路進而抑制胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲并誘導細胞周期阻滯[26]；還可降低大鼠缺血再灌注損傷組織梗死區(qū)域，抑制炎癥因子表達[27]。本研究顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠ROS含量升高，大鼠腦組織細胞凋亡，造成腦水腫；給予紅花多糖治療可顯著提升SAH大鼠神經(jīng)功能評分，降低SAH大鼠腦組織含水量、ROS含量以及細胞凋亡水平，進而對SAH大鼠腦組織發(fā)揮保護作用，抑制腦水腫。

炎性小體是先天免疫系統(tǒng)的一部分，在小膠質(zhì)細胞活化中起著核心作用，涉及感測各種環(huán)境和細胞應激信號的多聚體蛋白質(zhì)復合物[28]。NLRP3炎癥小體激活導致ASC寡聚，觸發(fā)下游銜接蛋白ASC(與CARD凋亡相關(guān)的斑點樣蛋白)的螺旋狀纖維組裝[29]。ASC可導致caspase1激活，并促進IL-1β前體的加工和成熟細胞因子IL-1β的釋放[30]。NLRP3-ASC炎性小體激活可引起細胞因子和趨化因子濃度增加[31]。本研究顯示，模型組SAH大鼠腦組織NLRP3、ASC、cleaved caspase1及炎癥因子IL-6、IL-1β、IL-18和TNF-α蛋白含量升高，給予紅花多糖治療后，蛋白表達水平顯著降低，表明紅花多糖直接抑制SAH大鼠腦部炎癥小體高表達，進而抑制其產(chǎn)物IL-6、IL-1β、IL-18和TNF-α的表達，改善大鼠腦損傷，與Chen H F等[32]研究一致。

綜上所述，紅花多糖可通過抑制NLRP3-ASC炎性小體激活介導的神經(jīng)炎癥，改善神經(jīng)功能缺損，促進受損神經(jīng)功能修復，減輕SAH引起的海馬遲發(fā)性損傷，為開發(fā)新的早期腦損傷治療藥物提供參考。