阿不力米提·玉麥爾，曹續(xù)，崔智超，阿卜杜拉·玉蘇普*

1(喀什大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，新疆特色藥食用植物資源化學(xué)實(shí)驗(yàn)室，新疆 喀什，844000)2(新疆維吾爾自治區(qū)分析測(cè)試研究院，新疆 烏魯木齊，830000)

石榴(PnnicagranatumL.)屬于石榴屬(PunicaL.)植物，落葉灌木或小喬木，是一種集生態(tài)、經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益及觀賞價(jià)值與保健功能于一身的優(yōu)良果樹(shù)[1-6]。新疆石榴主要產(chǎn)于南疆的喀什、和田等地區(qū)，主要品種有喀什石榴、皮亞曼石榴等[7-8]。喀什地區(qū)夏季氣候條件對(duì)石榴的生長(zhǎng)發(fā)育有利，使得喀什石榴果實(shí)大而皮薄、營(yíng)養(yǎng)豐富、耐貯藏[5,9-10]。有研究發(fā)現(xiàn)石榴具有抗氧化和抗炎癥的功效，種植面積也在逐年擴(kuò)大[11-12]。與此同時(shí)，農(nóng)藥的使用問(wèn)題被更多地關(guān)注和重視。

目前常用于農(nóng)殘檢測(cè)的方法有液相、氣相、液質(zhì)、氣質(zhì)。前處理方法主要有液液萃取、固相萃取[13-15]，不過(guò)，這些檢測(cè)方法均有明顯的不足之處。例如：氣相色譜法靈敏度低，氣相色譜-質(zhì)譜法易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果等。QuEChERS[16-17]是目前應(yīng)用較為廣泛的一種檢測(cè)方法，其因高效、便捷、省時(shí)、試劑使用量少的顯著優(yōu)勢(shì)深受推薦。QuEChERS技術(shù)基于吸附原理，將吸附劑加入樣品提取液中，通過(guò)渦旋振蕩與基質(zhì)干擾物充分接觸，將干擾物吸附在吸附劑上，達(dá)到樣品凈化的目的[18]。關(guān)于石榴中的前處理報(bào)道較少，由于樣品含豐富的色素和礦物質(zhì)，還有較多的易揮發(fā)性物質(zhì)，存在明顯的基質(zhì)干擾效應(yīng)[19-21]。

本文在QuEChERS方法的基礎(chǔ)上，優(yōu)化了凈化步驟，并與三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用，檢測(cè)70種農(nóng)藥時(shí)方法回收率較好，可應(yīng)用于此類(lèi)樣品的農(nóng)藥殘留檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

丙酮、乙腈、正己烷(色譜純)，美國(guó)Fisher公司；結(jié)晶乙酸鈉(分析純)，天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水硫酸鎂(分析純)，上海麥克林生化科技有限公司；石墨化碳(carbon-graphitized carbon，carbon-GCB)，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；C18吸附劑，安捷倫科技(中國(guó))有限公司；乙二胺-N-丙基硅烷(primary-secondary amine，PSA)，美國(guó)Agela公司。

70種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品的濃度均為1 000 μg/mL(農(nóng)業(yè)部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的溶解度選用正己烷、丙酮溶劑配制，參照GB/T 23200.113—2018和GB 23200.8—2016方法，根據(jù)定量限的不同配成9組20 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液[22]，避光存放于-18 ℃冰箱中。

基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液：用陰性空白樣品提取液配制質(zhì)量濃度為0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)0.22 μm微孔膜過(guò)濾后供儀器分析。

1.2 儀器與設(shè)備

TSQ9000氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Thermo Fisher；BSA2202S電子天平，德國(guó)Sartorius公司；K15高速離心機(jī)，美國(guó)Sigma公司；MS3渦旋混勻器，德國(guó)IKA公司；超聲波儀，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：TG-5MS(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度270 ℃；進(jìn)樣體積1.0 μL；載氣：高純氦氣(99.99%)；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；流速1.0 mL/min。色譜柱升溫程序：柱溫40 ℃，保持1.5 min，以25 ℃/min升至180 ℃，保持1.5 min，以20 ℃/min升至280 ℃，保持6.4 min。

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：電子轟擊(electron impact ionization, EI)源；數(shù)據(jù)采集模式：?jiǎn)坞x子檢測(cè)掃描(single ion monitoring, SRM)模式；離子源溫度300 ℃；傳輸線溫度280 ℃；溶劑延遲5 min；碰撞氣：氬氣；電離能量70 eV。

1.3.3 樣品前處理

稱(chēng)取10.00 g(精確至0.01 g)樣品于50 mL具塞離心管中，加入3 mL水，再加入10 mL(1.0%體積分?jǐn)?shù)乙酸+乙腈)，渦旋混勻1 min。樣品冷凍10 min后，加入3.0 g無(wú)水MgSO4、1.0 g結(jié)晶CH3COONa，迅速加蓋渦旋混勻1 min，冰水浴超聲提取30 min，于9 500 r/min 低溫離心3 min。冷凍10 min后，取6.0 mL上清液，移入含1 000 mg MgSO4、600 mg PSA、150 mg C18、40 mg GCB的15 mL具塞離心管中，渦旋混勻1 min，以9 500 r/min低溫離心1 min，上清液經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后，供氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件優(yōu)化

2.1.1 色譜條件

將進(jìn)樣口溫度調(diào)至270 ℃，考慮到有些化合物在高溫下易分解[23-24]。程序升溫的設(shè)定不僅會(huì)影響到目標(biāo)化合物的保留時(shí)間和峰形，最重要的是還會(huì)影響到離子化效率，從而影響靈敏度。由于目標(biāo)化合物組分較多，為了在大批量檢測(cè)工作中節(jié)省時(shí)間，故選用內(nèi)徑為0.32 mm的中等極性色譜柱，其柱容量更大，優(yōu)化后的最佳升溫程序可大大縮短進(jìn)樣時(shí)間，還可以改善其峰形。

2.1.2 質(zhì)譜條件

將70種農(nóng)藥配制成2.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。農(nóng)藥化合物種類(lèi)多，結(jié)構(gòu)差異性大，將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行AUTO SRM采集得到總離子流圖(圖1)。優(yōu)化方法，選擇合適的母離子及碰撞能量，再進(jìn)行二級(jí)裂解，挑選3對(duì)合適的離子和碰撞能量。

圖1 質(zhì)量濃度均為2.0 μg/mL的70種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在SRM模式下的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram for a mixed standard solution of the 70 pesticides (2.0 μg/mL for each) in SRM mode

2.2 提取溶劑的選擇

分析農(nóng)殘最常用的提取溶劑有：甲醇、乙酸乙酯、正己烷、丙酮、乙腈、石油醚等，石油醚毒性較大；正己烷對(duì)油脂類(lèi)易被共萃取，但對(duì)極性大的農(nóng)藥很難提取出來(lái)，丙酮與水互溶，容易帶入水分對(duì)儀器以及毛細(xì)管色譜柱造成損害；乙腈對(duì)農(nóng)藥的溶解性較好，對(duì)油脂和色素等溶解性較小，提取效率最好，同時(shí)乙腈對(duì)樣品基質(zhì)有較強(qiáng)的穿透力，從而能夠獲得較高的回收率。因此，選定乙腈為70種農(nóng)藥的提取溶劑。同時(shí)，由于70種農(nóng)藥的穩(wěn)定性不同，為獲得最大的提取效率，考察加入乙酸對(duì)提取效果的影響。本文以喀什石榴為樣品基質(zhì)，在0.05 mg/kg加標(biāo)水平下對(duì)70種目標(biāo)農(nóng)藥的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，在提取劑乙腈中添加1.0%(體積分?jǐn)?shù))的乙酸，70種農(nóng)殘平均回收率較好，而僅用乙腈作為提取溶劑時(shí)，發(fā)現(xiàn)平均回收率比加入1.0%的乙酸低，其原因在于部分農(nóng)藥在乙腈中不太穩(wěn)定，加入1.0%的乙酸，使有些目標(biāo)化合物在酸性條件下抑制了羧基在溶液中電離成離子形態(tài)，從而提高了回收率。從圖2可以看出，乙酸的添加量在1.0%時(shí)，回收率最高，之后呈下降趨勢(shì)(P<0.05),因此確定添加1.0%乙酸的乙腈作為最終的提取劑(圖2)。

圖2 提取液中添加1.0%(體積分?jǐn)?shù))的乙酸對(duì)70種農(nóng)藥平均回收率的影響Fig.2 Effect of adding 1.0% acetic acid in extraction solution on average recovery of 70 pesticides

2.3 吸附劑的選擇優(yōu)化

石榴樣品基質(zhì)中含有大量色素、揮發(fā)性物質(zhì)等，在提取目標(biāo)物時(shí)，這些物質(zhì)易與待測(cè)目標(biāo)物一并提取出來(lái)，形成復(fù)雜的背景干擾和基質(zhì)效應(yīng)，若不進(jìn)一步凈化，基質(zhì)效應(yīng)的干擾會(huì)影響到檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。QuEChERS常用的吸附劑有PSA、C18、GCB等。PSA具有弱的陰離子交換能力，可除去脂肪酸、部分有機(jī)酸等；C18則在排除非極性雜質(zhì)方面效果良好；GCB對(duì)色素有強(qiáng)烈的吸附作用。本文以石榴樣品為基質(zhì)，在0.05 mg/kg加標(biāo)水平下考察了這3種吸附劑。

2.3.1 PSA添加量的選擇

在上述優(yōu)化結(jié)果的基礎(chǔ)上，以新疆石榴為試驗(yàn)對(duì)象，在6 mL提取液中分別添加100、200、300、600、1 000 mg PSA比較回收效果。結(jié)果表明，隨著PSA的加入，提取液顏色逐漸變淺，70種農(nóng)藥的平均回收率也逐漸增高，這與PSA能除去樣品的中糖分有關(guān)。當(dāng)添加量為600 mg時(shí)，平均回收率達(dá)到92%，繼續(xù)增加PSA的用量對(duì)回收率有負(fù)面的影響。故當(dāng)提取液為6 mL時(shí)，PSA的添加量為600 mg較為合適，即PSA相對(duì)于提取液的添加質(zhì)量濃度為100 mg/mL，回收率最高，之后呈下降趨勢(shì)(P<0.05)(圖3)。

圖3 PSA的添加量對(duì)70種農(nóng)藥平均回收率的影響Fig.3 Effect of addition amount of PSA on average recovery of 70 pesticides

2.3.2 C18添加量的選擇

在上述優(yōu)化結(jié)果的基礎(chǔ)上，以石榴為試驗(yàn)對(duì)象，在6 mL提取液中分別添加50、100、150、200、400 mg的C18比較回收效果。結(jié)果表明，當(dāng)經(jīng)C18的添加量為150 mg時(shí)，樣品較干凈基質(zhì)干擾減少，70種農(nóng)藥的平均回收率達(dá)到最佳，平均回收率為94%。故當(dāng)提取液為6 mL時(shí)，C18的添加量為150 mg較為合適，即C18相對(duì)于提取液的添加濃度為25 mg/mL，回收率最高，之后呈下降趨勢(shì)(P<0.05)(圖4)。

圖4 C18的添加量對(duì)70種農(nóng)藥平均回收率的影響Fig.4 Effect of addition amount of C18 on average recovery of 70 pesticides

2.3.3 GCB添加量的選擇

在上述優(yōu)化結(jié)果的基礎(chǔ)上，以石榴為試驗(yàn)對(duì)象，在6 mL提取液中分別添加5、10、20、40、60 mg的GCB比較回收效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GCB能有效去除石榴中的色素，使樣品更加澄清，從而減小對(duì)儀器的污染，當(dāng)GCB添加量為40 mg時(shí)回收率較好，平均回收率為89%，但GCB添加量逐漸增大時(shí)，其回收率明顯降低。故當(dāng)提取液為6 mL時(shí)，GCB的添加量為40 mg較為合適，即GCB相對(duì)于提取液的添加質(zhì)量濃度為6.7 mg/mL，回收率最高，之后呈下降趨勢(shì)(P<0.05)(圖5)。

圖5 GCB的添加量對(duì)70種農(nóng)藥平均回收率的影響Fig.5 Effect of addition amount of GCB on average recovery of 70 pesticides

綜上，本文最終確定以無(wú)水PSA、C18、GCB混合作為吸附劑，其添加質(zhì)量濃度分別為100、25、6.7 mg/mL。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)會(huì)對(duì)分析方法的重復(fù)性、靈敏度、準(zhǔn)確度等產(chǎn)生影響，在使用EI源時(shí)更為突出，主要表現(xiàn)為對(duì)目標(biāo)化合物的離子增強(qiáng)作用?；|(zhì)效應(yīng)=基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線的斜率，比值越接近1，則基質(zhì)效應(yīng)越小，反之亦然。以喀什石榴為樣品的基質(zhì)效應(yīng)(表1)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，石榴基質(zhì)效應(yīng)以增強(qiáng)為主，其中毒死蜱、腐霉利、丙溴磷、六六六、敵敵畏、溴氰菊酯比值在0.25～0.76有較強(qiáng)的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。吡唑醚菌酯、氧樂(lè)果、苯醚甲環(huán)唑、甲胺磷比值在1.09～1.69。通常采用的基質(zhì)效應(yīng)消除方法有3種，一是通過(guò)稀釋凈化，二是采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液做校準(zhǔn)曲線，三是采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行校正。本文使用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法來(lái)消除基質(zhì)效應(yīng)。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 檢測(cè)方法的線性范圍、檢出限

采用陰性石榴做空白基質(zhì)將農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成0.005、0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，以農(nóng)藥的質(zhì)量濃度對(duì)應(yīng)得定量離子色譜峰的面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以3倍的S/N計(jì)算檢測(cè)方法的檢出限，70種農(nóng)藥在0.005～1.0 μg/mL線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2>0.995，結(jié)果如表1所示。

表1 70種農(nóng)藥在皮亞勒瑪石榴基質(zhì)中的線性方程、基質(zhì)效應(yīng)、LOD和LOQTable 1 Linear equation, Matrix effect, LODs and LOQs of the 70 pesticides in Pialema pomegranate

續(xù)表1

2.5.2 加標(biāo)回收和精密度

向空白樣品中分別加0.01、0.05、0.1 mg/kg的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，依1.3.3處理樣品，每個(gè)水平做5個(gè)平行。按上述優(yōu)化好的方法進(jìn)行測(cè)定，基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量，計(jì)算平均回收率和精密度。結(jié)果所有農(nóng)藥的回收率均為71.6%～107.5%，精密度<11.2%，方法回收率和精密度符合農(nóng)藥殘留分析要求，如表2所示。

表2 在3個(gè)水平下的農(nóng)藥回收率及精密度(n=5) 單位：%

續(xù)表2

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

應(yīng)用該分析方法和GB 23200.113—2018方法對(duì)市場(chǎng)采購(gòu)的皮亞曼石榴，喀什甜石榴、喀什酸石榴進(jìn)行檢測(cè)。在1個(gè)石榴樣品中檢出氯氰菊酯農(nóng)藥殘留，其余均未檢出。對(duì)2種加標(biāo)樣品結(jié)果表明2種方法的檢測(cè)結(jié)果相近。

3 結(jié)論

建立了氣相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法測(cè)定石榴中農(nóng)藥殘留的方法，與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 23200.113—2018和通用的方法相比，由于目標(biāo)化合物組分較多，為了在大批量檢測(cè)工作中節(jié)省時(shí)間，故選用柱容量更大的內(nèi)徑為0.32 mm的中等極性色譜柱，選用外標(biāo)法進(jìn)行試驗(yàn)。此外優(yōu)化了凈化步驟和單離子檢測(cè)掃描模式，從而能減少了基質(zhì)干擾，提高方法靈敏度。由于部分農(nóng)藥在乙腈中不太穩(wěn)定，僅用乙腈作為提取溶劑時(shí)，發(fā)現(xiàn)平均回收率比加入1.0%(體積分?jǐn)?shù))的乙酸低，因此溶劑中加入了1.0%的乙酸。本方法準(zhǔn)確、便捷，為同類(lèi)產(chǎn)品的安全生產(chǎn)、有機(jī)產(chǎn)品申請(qǐng)和新疆本土特色食品名牌打造提供技術(shù)支持。