李艷，晉小軍*，張迎芳，厚建霞，王霞，蒙俊杰

1(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州，730070)2(卓尼縣創(chuàng)信種植專業(yè)合作社，甘肅 甘南，747602)

百合為百合科百合屬(Lilium)植物的干燥鱗莖，味甘性寒，歸心、肺經(jīng)，研究表明百合有皂苷類、黃酮類、酚酸甘油酯類、氨基酸類、生物堿類和多糖類等化學(xué)成分，具有廣泛的藥理作用，如止咳祛痰、清心安神、抑菌、降血糖、抗氧化[1-3]。百合也可用于食療。蘭州百合(L.davidiivar.unicolor)是川百合(L.davidii)的變種[4]，《甘肅新通志》中記載：清光緒時(shí)，蘭州百合“種者漸多，得利甚優(yōu)”[5]。作為我國(guó)西部地區(qū)大面積種植的食用百合，其色白味甘、低纖維，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，不僅可以食用，也可進(jìn)行藥療和觀賞，是我國(guó)食用百合的最佳品種。

李瑞琴等[6]對(duì)蘭州百合的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)進(jìn)行分析測(cè)定，發(fā)現(xiàn)蘭州百合的品質(zhì)指標(biāo)均優(yōu)于文獻(xiàn)記載。劉湘丹等[7]對(duì)不同來源的百合藥材進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)及分析，結(jié)果表明蘭州百合浸出物顯著高于其他品種百合。LI等[8]利用拉曼光譜法對(duì)蘭州百合的質(zhì)量進(jìn)行了評(píng)價(jià)，證明了蘭州百合富含多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，與其他品種相比有許多不同的優(yōu)勢(shì)。但是對(duì)于蘭州百合的研究目前均在栽培種植及與其他品種的對(duì)比方面，關(guān)于種植年限對(duì)蘭州百合的質(zhì)量以及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的影響未見報(bào)道。種植年限不僅影響口感和藥用價(jià)值，還影響生產(chǎn)投入和經(jīng)濟(jì)效益。市場(chǎng)上關(guān)于商品百合的最佳種植年限魚龍混雜，因此確定一個(gè)最佳的采收年限對(duì)蘭州百合的生產(chǎn)有著重大意義。

本實(shí)驗(yàn)選取市場(chǎng)上出現(xiàn)的，其大小可以作為商品百合的3～7年生蘭州百合，2020版《中國(guó)藥典》中規(guī)定：在測(cè)定百合多糖及水溶性浸出物含量基礎(chǔ)上，增加氨基酸的種類和含量、總黃酮、Regaloside A 3個(gè)指標(biāo)。本文對(duì)收集的不同生長(zhǎng)年限蘭州百合的質(zhì)量進(jìn)行比較分析，以期為選擇適宜的采收時(shí)間提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品采自甘肅省蘭州市西固區(qū)，為3～7年生栽培品，經(jīng)甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)中草藥栽培與鑒定系晉小軍研究員鑒定均為百合科植物蘭州百合。樣品經(jīng)超純水洗凈后，放入45 ℃烘箱干燥，粉碎、過60目篩，在4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

蘆丁對(duì)照品(批號(hào)X16A11C111251含量以95%計(jì))，上海源葉生物科技有限公司；無(wú)水葡萄糖對(duì)照品(批號(hào)20200612)、王百合苷A(批號(hào)C16D11S134691；含量≥98%)，上海源葉生物科技有限公司；甲酸銨、氨基酸標(biāo)樣，Sigma-Aldrich (St.Louis, MO, USA)公司，氨基酸在使用前于-70 ℃下貯存；乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、0.1%(體積分?jǐn)?shù))磷酸水溶液、乙腈(色譜純)，均為國(guó)產(chǎn)試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；Agilent 6470三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)，安捷倫科技有限公司；Agilent 1260 Infinity色譜柱(‖EC-C18,4.6 mm×150 mm，4 nm)，安捷倫科技有限公司；Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z色譜柱(2.1 mm×100 mm，2.7 μm)，安捷倫科技有限公司；UV3100紫外-可見檢測(cè)器，大連依利特分析儀器有限公司；UPH-I-10T超純水機(jī)，成都優(yōu)普儀器設(shè)備有限公司；SB25-12DTD超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；HWS-24電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；101-1AB電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 基本成分測(cè)定

水分依照2020版《中國(guó)藥典》[9]第四部通則0832第2法(烘干法)對(duì)15批百合樣品進(jìn)行測(cè)定分析，15批百合樣品水分含量均符合藥典規(guī)定；浸出物根據(jù)2020版《中國(guó)藥典》水溶性浸出物測(cè)定法(通則2201)項(xiàng)下的冷浸法進(jìn)行測(cè)定分析；多糖的測(cè)定按照2020版《中國(guó)藥典》百合多糖的測(cè)定方法，在580 nm的紫外波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，以吸光度A為縱坐標(biāo)，濃度C為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程A=17.897C-0.545,R=0.999 1。

1.3.2 總黃酮的測(cè)定

1.3.2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取蘆丁10 mg，加入60%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶解，于100 mL容量瓶中定容即得。

1.3.2.2 供試品溶液的制備

參照李紅娟[10]的方法并稍作修改。取1 g樣品粉末，置于50 mL容量瓶，加入70%乙醇30 ml進(jìn)行超聲提取，提取功率為350 W，溫度70 ℃，時(shí)間45 min，提取次數(shù)為2次，合并濾液作為提取液。

1.3.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取對(duì)照品溶液0、1、2、3、4、5 mL，分別置于10 mL容量瓶中，分別加入60%乙醇5、4、3、2、1、0 mL，加入50 g/L NaNO20.3 mL，放置5 min，加入10 g/L Al(NO3)30.3 mL，放置6 min，加入40 g/L NaOH 4 mL后用60%乙醇定容到10 mL，放置15 min。在506 nm 下測(cè)定吸光度，縱坐標(biāo)A為吸光度，濃度C為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程A=51.114C-0.027 2，R=0.999 1。

1.3.3 王百合苷A的測(cè)定

1.3.3.1 供試品溶液的制備

參照袁志鷹等[11]的方法制備。

1.3.3.2 色譜條件

Agilent 1260 Infinity ‖ EC-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，4 nm)；流動(dòng)相：V(0.1%磷酸水溶液)∶V(乙腈)=85∶15；流速1 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣體積2 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)312 nm。Regaloside A 保留時(shí)間約為5.2 min。色譜圖見圖1。

a-王百合苷A標(biāo)準(zhǔn)品;b-蘭州百合樣品圖1 蘭州百合中王百合苷A的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC diagram of Regaloside A in Lanzhou lily

1.3.3.3 線性關(guān)系考察

精密量取王百合苷A對(duì)照品置于量瓶中，加入80%乙醇溶解，搖勻，配成質(zhì)量濃度為20、40、60、80、100、120 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。按照“1.3.3.2”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)Y，對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)X，得到王百合苷A回歸方程為Y=3.924 2X-40.012，R=0.999 2，在20～120 μg/mL線性關(guān)系良好。

1.3.4 氨基酸總量及組分分析

1.3.4.1 供試品溶液的制備

參照聶慧等[12]的方法制備。

1.3.4.2 色譜條件

色譜柱：Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z，2.1 mm×100 mm，2.7 μm。流動(dòng)相A為含20 mmol/L甲酸銨水溶液，pH=3，流動(dòng)相B為20 mmol/L水相甲酸銨，pH=3，溶于V(乙腈)∶V(水)=9∶1溶液，梯度洗脫：0～11.5 min ，100% B～70% B;11.5～12 min，70%B～100% B；流速為0.50 mL/min，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量為1 μL。

1.3.4.3 質(zhì)譜檢測(cè)條件

電離模式：ESI正離子模式，干燥氣溫度330 ℃，氣體流速13.0 L/min，霧化器35 psi，鞘氣溫度390 ℃，鞘氣流速12 L/min，毛細(xì)管電壓1 500 V，噴嘴電壓0 V。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，SPSS 23.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長(zhǎng)年限對(duì)蘭州百合水溶性浸出物及多糖含量的影響

不同生長(zhǎng)年限蘭州百合多糖和水溶性浸出物的測(cè)定結(jié)果見表1。由表1可知，不同生長(zhǎng)年限蘭州百合水溶性浸出物含量為49.26%～56.69%，均高于藥典規(guī)定，其中6年生蘭州百合浸出物含量最高，為56.69%，7年生最低，為49.26%。隨著生長(zhǎng)年限的增加，浸出物呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)。所有蘭州百合樣品除3年生和4年生，其余均符合藥典所規(guī)定百合多糖的含量，其中6年生多糖含量最高，5年生和6年生差異不顯著(P>0.05)。

表1 不同生長(zhǎng)年限蘭州百合水溶性浸出物和多糖測(cè)定結(jié)果 單位：%

2.2 生長(zhǎng)年限對(duì)蘭州百合總黃酮及王百合苷A含量的影響

由圖2可以看出，不同生長(zhǎng)年限蘭州百合中總黃酮及王百合苷A含量存在顯著差異。其中總黃酮的含量整體呈增加趨勢(shì)，以6年生蘭州百合含量最高，含量為4.44 mg/g顯著高于其他生長(zhǎng)年限(P<0.05)，3年生蘭州百合總黃酮含量最低，含量為1.88 mg/g。而王百合苷A的含量為0.63～0.97 mg/g，6年生蘭州百合王百合苷A含量顯著高于其他生長(zhǎng)年限(P<0.05)，3年生、5年生和7年生蘭州百合的王百合苷A含量差異不顯著(P>0.05)。

圖2 不同生長(zhǎng)年限蘭州百合中總黃酮及王百合苷A含量變化圖Fig.2 Changes of total flavonoids and Regaloside A contents in Lanzhou lily from different growth years注：不同字母標(biāo)注表示差異顯著(P<0.05)

2.3 生長(zhǎng)年限對(duì)氨基酸總量及組分的影響

西固區(qū)所產(chǎn)蘭州百合含有豐富的氨基酸，由表2可知，不同生長(zhǎng)年限的蘭州百合樣品均含有18種相同的氨基酸，包括蘇氨酸(Thr)、苯丙氨酸(Phe)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)等8種人體必需氨基酸，總氨基酸(total amino acid，TAA)的含量為20.73～31.61 mg/g，其中6年生蘭州百合氨基酸含量最高，為31.61 mg/g，含量最低的為7年生蘭州百合，氨基酸總量為20.73 mg/g。隨著生長(zhǎng)年限的增加，蘭州百合氨基酸的總量先增加后減少。

從氨基酸組成分析，不同生長(zhǎng)年限的蘭州百合中氨基酸種類和含量高低順序基本一致，排在前4位的均為谷氨酸(Glu)、丙氨酸(Ala)、酪氨酸(Tyr)、天冬氨酸(Asp)，這4種氨基酸為蘭州百合的主要氨基酸。蘭州百合中必需氨基酸(essential amino acids，EAA)的含量為4.06～5.62 mg/g，其中含量最高的為6年生蘭州百合，其次為4年生和7年生蘭州百合，含量最低的為3年生蘭州百合；非必需氨基酸(non-essential amino acids，NEAA)的含量為16.11～25.99 mg/g，其中6年生含量最高，7年生最低，不同生長(zhǎng)年限的蘭州百合中非必需氨基酸含量在氨基酸總量中的占比為77.75%～84.84%，為蘭州百合主要氨基酸。由表3得知，3～7年生蘭州百合樣品的必需氨基酸/非必需氨基酸(E/N)的值為17.87%～28.62%，顯著低于60%，必需氨基酸/總氨基酸(E/T)的值為15.16%～22.25%，顯著低于40%，不符合理想蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)[13]。

2.4 必需氨基酸比例與模式譜的比較

根據(jù)1973年世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)和聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(Food and Agriculture Organization，F(xiàn)AO)提出的評(píng)價(jià)食物的必需氨基酸模式，如果食物中必需氨基酸種類組成比例越接近FAO/WHO氨基酸模式要求，則這種食物中蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值越高，越符合人體機(jī)理需求[14]。食品蛋白質(zhì)中，根據(jù)人體的需要及其比例關(guān)系相對(duì)不足的氨基酸稱為限制氨基酸，在限制氨基酸中缺乏最多并且氨基酸評(píng)分最低的稱為第一限制氨基酸[15]，它會(huì)嚴(yán)重影響人體對(duì)蛋白質(zhì)的吸收。由表3可知，與氨基酸模式譜比較，不同生長(zhǎng)年限的蘭州百合第一限制氨基酸均為Val，僅有Phe+Tyr符合 +FAO/WHO +提出的理想模式，其余均不符合氨基酸模式譜規(guī)定，因此，在食用蘭州百合時(shí)要搭配食用富含Val的食物[16]。

表2 不同生長(zhǎng)年限蘭州百合氨基酸含量及組成對(duì)比分析 單位：mg/g

表3 必需氨基酸比例與氨基酸模式譜的比較 單位：%

3 結(jié)論與討論

本研究主要對(duì)西固區(qū)不同生長(zhǎng)年限蘭州百合質(zhì)量和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值進(jìn)行評(píng)價(jià)和分析，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，種植年限對(duì)蘭州百合質(zhì)量及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值影響較大。6年生多糖含量最高，3年生最低，這與張之鵬[17]研究不同栽培年限對(duì)鐵皮石斛多糖含量影響基本一致，可能與植物的代謝作用消耗能源物質(zhì)有關(guān)。浸出物前6年呈增加趨勢(shì)，第7年開始減少，這與蒙古黃芪水溶性浸出物含量變化一致[18]。總黃酮的含量隨著種植年限的增加，整體呈增加趨勢(shì)，與相關(guān)文獻(xiàn)記載一致[19]。而對(duì)于王百合苷A，6年生的含量最高。不同生長(zhǎng)年限蘭州百合所含氨基酸種類相同，含量則以6年生最高，3年生最低，說明蘭州百合氨基酸種類受種植年限的影響較小，但其含量受影響較大。氨基酸的變化可能與蘭州百合生理生化作用和生長(zhǎng)進(jìn)程有關(guān)[20]，前幾年生長(zhǎng)處于旺盛階段，有利于氨基酸的轉(zhuǎn)化；當(dāng)生長(zhǎng)至第7年時(shí)，生長(zhǎng)進(jìn)程變緩慢，植物新陳代謝能力變?nèi)酰焕诎被岬霓D(zhuǎn)換和吸收。

西固區(qū)所產(chǎn)不同生長(zhǎng)年限蘭州百合所含氨基酸種類齊全，含有18種，其中包含了8種成人必需氨基酸。NEAA/TAA比率為77.75%～84.84%，蘭州百合氨基酸總量中非必需氨基酸占比較大，含量最高的是谷氨酸，谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，可以通過與其配體依賴的同源受體相互作用而發(fā)揮作用，在人體代謝上有著重大意義[21]；其次含量較高的為酪氨酸和丙氨酸，酪氨酸經(jīng)過一系列催化氧化最終形成黑色素。酪氨酸是酪氨酸酶單酚酶功能的催化底物，是最終形成優(yōu)黑素和褐黑素的主要原料。在美白化妝品研發(fā)中，可以通過研究合成與酪氨酸競(jìng)爭(zhēng)的酪氨酸酶，抑制酪氨酸酶的活性，清除自由基而達(dá)到美白的功效[22]。丙氨酸用于預(yù)防腎結(jié)石、協(xié)助葡萄糖代謝，有助緩和低血糖，改善身體能量。可見蘭州百合中含量較高的幾種氨基酸均具有較好的開發(fā)價(jià)值。

生長(zhǎng)年限對(duì)蘭州百合質(zhì)量和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值影響較大。3年生和4年生蘭州百合多糖不符合2020版《中國(guó)藥典》規(guī)定；6年生蘭州百合各成分含量顯著高于其他生長(zhǎng)年限(P<0.05)，5年生次之；生長(zhǎng)7年的蘭州百合所測(cè)成分含量均顯著下降(P<0.05)，低于5年生和6年生，說明蘭州百合生長(zhǎng)7年后質(zhì)量和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值降低，并且百合鱗莖出現(xiàn)分化，商品率下降。綜合各項(xiàng)指標(biāo)，若以生產(chǎn)投入和經(jīng)濟(jì)效益為標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)選擇5年生；若以食用價(jià)值和保健功效為標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)選擇6年生蘭州百合，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值顯著優(yōu)于其他生長(zhǎng)年限。另外，本研究?jī)H選取了一個(gè)產(chǎn)地進(jìn)行不同生長(zhǎng)年限蘭州百合質(zhì)量進(jìn)行比較分析，來源單一，植物在生長(zhǎng)過程中產(chǎn)地和栽培條件均可能對(duì)其質(zhì)量產(chǎn)生影響。