唐嘉誠(chéng)，包建強(qiáng),2,3*，陳彥婕，黃可承，宮萱，單錢藝

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)2(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海，201306)3(農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(上海)，上海，201306)4(上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院，國(guó)家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，上海，200233)

糖蛋白是碳水化合物基團(tuán)共價(jià)附于蛋白質(zhì)上的一類結(jié)合蛋白，組成上以蛋白為主[1]，而不同糖蛋白中，其糖所占比例差異較為明顯，占蛋白重量的2%～60%不等[2]。糖蛋白在自然界中來(lái)源廣泛，動(dòng)物、植物以及微生物中都能提取到天然糖蛋白成分。由于有著特殊生物化學(xué)作用，例如抗氧化、抗腫瘤、抗疲勞等，近年來(lái)對(duì)于糖蛋白的研究成為食品科學(xué)、免疫學(xué)、醫(yī)藥學(xué)、生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的研究熱點(diǎn)。通過(guò)了解糖蛋白的提取純化方法及結(jié)構(gòu)功能，對(duì)未來(lái)食品及藥物研發(fā)行業(yè)研究具有重要作用。本文對(duì)天然糖蛋白研究進(jìn)行概述，分析了其提取和分離純化技術(shù)以及理化表征手段，為天然糖蛋白開發(fā)利用研究提供一定借鑒。

1 糖蛋白簡(jiǎn)介

1.1 糖蛋白組成結(jié)構(gòu)

糖蛋白是指具有多分支的寡糖鏈(一般為15～20個(gè)單糖單元)與多肽鏈以共價(jià)鍵相連而成的復(fù)合物，其含量以蛋白為主[3]。糖蛋白在動(dòng)物、植物和微生物中廣泛存在，是生命活動(dòng)中一種重要大分子。

糖蛋白所含氨基酸種類較為全面，其中蘇氨酸(Thr)、絲氨酸(Ser)、賴氨酸(Lys)、羥脯氨酸(Pro)、天門冬酰胺酸(Asn)這5種氨基酸的含量較高[4]。構(gòu)成糖蛋白的單糖主要有葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖、N-乙酞葡萄糖胺以及糖醛酸等[5]，不同種類的糖蛋白，其糖所占比例也有所不同。糖鏈的存在提高了糖蛋白的親水性，一般親水性較強(qiáng)的糖蛋白含有較高的硫酸化或唾液酸化的糖鏈，能夠提高糖蛋白的總電荷，增加糖蛋白的溶解度，如糖蛋白中的黏蛋白和蛋白聚糖[6]。通過(guò)糖鏈，糖蛋白能與其他蛋白質(zhì)形成共價(jià)鍵和氫鍵相連起到結(jié)構(gòu)支架的作用。糖蛋白中糖鏈和肽鏈主要有2種結(jié)合方式：N-鏈接，糖鏈和天冬酰胺基結(jié)合；O-鏈接，通過(guò)糖苷鍵，糖基和含羥基的Lys之間相結(jié)合或是糖基和Thr或Ser的羥基相連接[7]，如圖1所示[8]。后者容易在堿性溶液中發(fā)生β-消除反應(yīng)，易被堿溶液水解,根據(jù)這個(gè)特性可以初步判斷糖肽鍵類型。

A-O-糖肽鍵；B-N-糖肽鍵圖1 O-糖肽鍵和N-糖肽鍵[8]Fig.1 O-glycopeptide linkage and N-glycopeptide linkage

1.2 糖蛋白種類

糖蛋白廣泛存在于自然界中。按照其提取來(lái)源可分為動(dòng)物源糖蛋白、植物源糖蛋白和微生物源糖蛋白。其中植物和微生物中所提取的天然糖蛋白類型較為類似。糖蛋白在機(jī)體內(nèi)承擔(dān)著重要的功能，如結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)運(yùn)、酶促反應(yīng)等，并且具有廣泛的用途，如表1所示。

表1 糖蛋白來(lái)源及分類Table 1 Resources and types of glycoprotein

不同來(lái)源的糖蛋白中氨基酸組分都較為全面，一般含有全部的氨基酸種類；組成糖鏈的單糖通常只有11種。糖蛋白其結(jié)構(gòu)種類多樣，形成了其不同的特性及類別。

從動(dòng)物原料中提取的糖蛋白主要類型為膠原蛋白以及黏蛋白：膠原蛋白種類繁多、來(lái)源廣泛，主要由3種特殊的左手螺旋多肽鏈結(jié)構(gòu)構(gòu)成，其中膠原蛋白長(zhǎng)鏈中每3個(gè)氨基酸是甘氨酸占主要部分，鏈中剩余位點(diǎn)由脯氨酸和羥脯氨酸填充，其中羥賴氨酸殘基能夠是糖類結(jié)合位點(diǎn)，易形成糖基化結(jié)構(gòu)。膠原蛋白因其肽鏈上多種反應(yīng)基團(tuán)和低抗原性，易于結(jié)合多種酶和細(xì)胞，能夠制備成多種產(chǎn)品，有廣闊的應(yīng)用前景；黏蛋白是構(gòu)成生物黏液凝膠結(jié)構(gòu)的一類大分子，其主要結(jié)構(gòu)特征為中心區(qū)域含有較多的蘇氨酸或絲氨酸，寡糖側(cè)鏈通過(guò)O-糖肽鍵與絲氨酸或蘇氨酸相連，而糖類占黏蛋白總分子質(zhì)量50%以上，故黏蛋白含有重度O-糖肽鍵結(jié)構(gòu)，因而具有較好的水溶性，可作為化妝品保濕劑和用于干眼癥的治療。

植物及微生物中主要提取糖蛋白主要類型為凝集素及伸展蛋白，相比于動(dòng)物糖蛋白，植物及微生物源糖蛋白其羥脯氨酸殘基含量有較大變化，從而影響了其糖蛋白結(jié)構(gòu)構(gòu)型，容易形成如凝集素中特殊的結(jié)合位點(diǎn)[18]：凝集素主要從植物中提取，因其含有能夠識(shí)別復(fù)雜碳水化合物結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)域，能夠與特異性糖基可逆結(jié)合，故常用作分離純化多糖和糖蛋白，目前應(yīng)用最多的是豆科凝集素，根據(jù)糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域種類分為4種不同凝集素類別；伸展蛋白富含羥脯氨酸，存在于植物細(xì)胞壁中，是一種重要的結(jié)構(gòu)蛋白，對(duì)植物中抗病，抗逆作用起到重要作用。

2 粗糖蛋白提取工藝

糖蛋白是1種結(jié)合蛋白，因其同時(shí)具有糖類以及蛋白質(zhì)的某些性質(zhì)，根據(jù)這類性質(zhì)來(lái)確定提取方法。大部分溶劑如水、稀酸、稀堿和酶解溶液都能良好溶解糖蛋白，可以根據(jù)需求以及溶劑種類和濃度等來(lái)確定提取糖蛋白的方法。而為了提高提取效率，在糖蛋白提取過(guò)程中，常用超聲輔助或微波輔助的方法，利于糖蛋白的溶出，在糖蛋白的提取過(guò)程中，要避免過(guò)酸、過(guò)堿、高溫和機(jī)械作用等不利因素影響最終糖蛋白的生物活性。

根據(jù)糖蛋白的性質(zhì)，常用的提取方法有水浸提法、酸堿提取法、鹽溶液浸提法、酶解提取法和乙醇浸提法，而有些時(shí)候也采用混合的提取方式，以獲得更高的提取效率。而根據(jù)不同物料的性質(zhì)，其提取方式也有所改變。不同的提取方法，影響提取率高低的因素不同，為了有更高的提取率，常用正交試驗(yàn)法或是響應(yīng)面試驗(yàn)法去優(yōu)化提取工藝，得出一種較優(yōu)方案，以期達(dá)到更好的提取目的。常用的提取方法如表2所示。

表2 糖蛋白提取方法Table 2 The method of glycoprotein extraction

2.1 水浸提法

糖蛋白中的糖鏈為多羥基結(jié)構(gòu)，易溶于水，而含有高度O-糖肽鍵結(jié)構(gòu)的糖蛋白在水中溶解程度更高，因此水提取法是最為普遍的提取方法之一，不同物料來(lái)源用水浸提時(shí)效果略有差異。水浸提法相比于其他方法更為經(jīng)濟(jì)，實(shí)驗(yàn)材料易得，污染少并且工藝較為簡(jiǎn)單，其氨基酸及單糖組分、理化性質(zhì)如流變性等幾乎不受影響。提取溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)和料液比，通常是水浸提法較為常見(jiàn)的考察指標(biāo)以及優(yōu)化條件。水浸提法常見(jiàn)應(yīng)用于植物糖蛋白的提取過(guò)程中，為了有更好的提取效果，常輔以超聲等實(shí)驗(yàn)條件，并結(jié)合多次提取。ZHOU等[20]采用水提醇沉法提取苦蕎糖蛋白，在450 W超聲輔助提取條件下，經(jīng)后續(xù)除雜，凍干得到粗糖蛋白，得率為2.31%。

2.2 酸堿浸提法

糖蛋白中蛋白為兩性電解質(zhì)，用偏離糖蛋白等電點(diǎn)的提取溶劑提取，根據(jù)糖蛋白的酸堿性質(zhì)選擇提取溶液，酸性蛋白采用偏堿性的溶液提取，堿性蛋白采用偏酸性溶液提取。并且酸堿溶液能夠破壞糖蛋白分子中存在的分子內(nèi)氫鍵和共價(jià)鍵，更易于溶出提取，如具有三螺旋結(jié)構(gòu)的膠原蛋白在酸堿作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄缘穆菪Y(jié)構(gòu)，而酸處理會(huì)將一些谷氨酰胺和天冬酰胺分別轉(zhuǎn)化為谷氨酸和天冬氨酸[29]，一般酸堿法適用于提取含有較多共價(jià)交聯(lián)的復(fù)雜糖蛋白，如生物黏液等。徐偉良[30]分別采用酸、堿、水、酶法提取大鯢黏液糖蛋白，結(jié)果證明堿法提取得率最高，達(dá)到3.85%。在用酸堿法提取時(shí)，要注意酸堿對(duì)于糖蛋白活性的影響，避免糖蛋白發(fā)生不可逆變性。

2.3 鹽和緩沖溶液浸提法

鹽溶液和緩沖溶中的離子能夠與糖蛋白部分結(jié)合，穩(wěn)定性高、溶解度大，一定濃度的鹽溶液可促進(jìn)糖蛋白溶解。與水浸提法相比，鹽和緩沖溶液浸提法提取效果更好，也能極大程度保證糖蛋白的生物活性，適用于一些易變性的糖蛋白提取。常用的提取液為氯化鈉溶液、磷酸鹽緩沖溶液和三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖溶液。但是在后續(xù)提純前需要進(jìn)行脫鹽處理，常用的方式是經(jīng)透析袋透析或是凝膠柱層析脫鹽操作。

2.4 酶解提取法

酶是一種對(duì)底物具有高度特異性和高度催化效能的一類生物大分子。酶解法能夠使不溶性糖蛋白分解成為可溶性的糖肽、肽和氨基酸，有較高的提取效率以及較少的污染。酶能夠特異性降解糖蛋白中一些特異性的肽鍵，有較高的得率。提取糖蛋白所采用的酶會(huì)影響所提取糖蛋白的性質(zhì)，降解糖蛋白中結(jié)構(gòu)，影響其理化性質(zhì)，如分子質(zhì)量等[31]。由于其專一性和高度選擇性，能夠一定程度上避免雜質(zhì)的引入。但是采用酶解法提取糖蛋白時(shí)，需要考慮所使用酶的種類，以及提取溫度、pH對(duì)于酶活性的影響，所需要考慮的交互作用較多，前期需要對(duì)不同的酶進(jìn)行篩選，實(shí)驗(yàn)操作較為復(fù)雜，后續(xù)需要滅酶操作等。目前對(duì)于酶解提取糖蛋白的報(bào)道較少。

2.5 其他提取法

一般為了提高糖蛋白的提取效率，常輔以其他設(shè)備進(jìn)行共同輔助提取，常見(jiàn)的是超聲輔助提取以及微波輔助提取，兩者均可提高糖蛋白的提取效率，超聲波所產(chǎn)生的空穴作用有助于其溶出過(guò)程，同樣在提取過(guò)程中需要考慮超聲及微波設(shè)備設(shè)定指標(biāo)，如頻率和功率等。王芳等[32]采用超聲輔助提取覆盆子糖蛋白，相比單一使用熱水浸提法，其糖蛋白得率提高了2.733個(gè)百分點(diǎn)。

少數(shù)糖蛋白具有醇溶性可以采用乙醇浸提法進(jìn)行提取，但是采用乙醇浸提法所花費(fèi)的試劑量大，提取周期長(zhǎng)、成本較高，一般適合用于提取特定的醇溶性蛋白，通常不單一使用乙醇浸提的方法對(duì)糖蛋白進(jìn)行提取，通常輔以其他方法，如水浸提、鹽溶液浸提等方法。KRISHNAN等[33]研究美洲可食用塊莖，采用硫酸銨沉淀，并用70%乙醇萃取，后經(jīng)過(guò)親和色譜純化得到了29 kDa大小的糖蛋白。方旭波等[34]采用85%乙醇浸提白骨壤，結(jié)合100 ℃熱水浸提法，經(jīng)純化，脫色后得到了具有一定抗補(bǔ)體活性的白色纖維狀糖蛋白。

3 粗糖蛋白分離純化工藝

得到純品糖蛋白是后續(xù)進(jìn)行理化研究的重要前提，糖蛋白的純化指的是通過(guò)去除雜質(zhì)獲得單一成分的過(guò)程。糖蛋白的分離純化過(guò)程與蛋白、多糖純化過(guò)程類似，首先是經(jīng)過(guò)初步純化，除去粗提物中游離蛋白以及小分子雜質(zhì)，再經(jīng)后續(xù)分級(jí)純化，能夠得到較純的糖蛋白單品。

3.1 小分子除雜

常用的去除游離蛋白質(zhì)的方法是Sevage試劑法，在提取液中加入氯仿-正丁醇混合液經(jīng)過(guò)劇烈振蕩，將游離蛋白變?yōu)椴蝗苄晕镔|(zhì)除去[35]。Sevage試劑法較為溫和，對(duì)多糖結(jié)構(gòu)影響不大，在糖蛋白提取實(shí)驗(yàn)中最為常見(jiàn)，而根據(jù)不同研究對(duì)象，所使用的Sevage溶液中氯仿-正丁醇比例需要進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整，并且反應(yīng)時(shí)間以及除雜次數(shù)同樣需要實(shí)驗(yàn)所驗(yàn)證。

常用透析法除去小分子雜質(zhì)，也有學(xué)者采用超濾的方式提純糖蛋白。而采用(NH4)2SO4分級(jí)沉淀得到糖蛋白，通過(guò)獲取不同飽和度下的糖蛋白沉淀，同樣也可以達(dá)到初步純化的效果。

3.2 柱層析法

經(jīng)初步除雜的糖蛋白需要經(jīng)過(guò)進(jìn)一步分級(jí)純化，常用的方法是色譜柱分離技術(shù)，如陰離子交換色譜柱、凝膠柱色譜柱、親和色譜柱和高效液相色譜等。而實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常采用多種方法進(jìn)行分離純化，具體見(jiàn)表3。

表3 糖蛋白純化方法Table 3 The method of Glycoprotein purification

3.2.1 陰離子交換柱層析

應(yīng)用最為廣泛的陰離子交換柱層析填料為二乙基氨基纖維素，利用生物大分子所帶電荷不同，根據(jù)與離子交換劑結(jié)合能力的不同達(dá)到分離效果[41]。為了既保證蛋白質(zhì)生物大分子的活性，又要保證樣品與填料有適中的結(jié)合能力，一般使得溶液pH值與蛋白質(zhì)等電點(diǎn)應(yīng)相差一個(gè)單位，有較好的分離效果，常用的填料類別有DEAE-纖維素、DEAE-葡萄糖凝膠、DEAE-瓊脂糖凝膠。

為了完全分離與填料相結(jié)合的復(fù)雜組分，通常需要改變?nèi)芤簆H值或是離子強(qiáng)度。實(shí)際實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，常改變離子強(qiáng)度，即鹽溶液的濃度，其操作方便并且能夠極大程度上保證蛋白質(zhì)的活性。常用的洗脫方式是用NaCl溶液或是NaHCO3溶液進(jìn)行等濃度梯度洗脫和連續(xù)梯度洗脫，根據(jù)填料所帶不同離子型而確定洗脫液類型，其中連續(xù)梯度洗脫有著更精細(xì)的分離度，所得產(chǎn)品有較好的生物活性。QIN等[42]采用DEAE 瓊脂糖凝膠(DEAE Sepharose)陰離子交換柱對(duì)粗豌豆糖蛋白進(jìn)行純化，采用NaCl梯度洗脫液進(jìn)行洗脫，3個(gè)峰形較好的洗脫峰，結(jié)合后續(xù)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜證明，其3種不同的糖蛋白組分為單一條帶，證明陰離子交換柱層析有較好分離度。SONG等[38]以白玉蝸牛黏液為研究對(duì)象，經(jīng)前處理后，于DEAE Sepharose FF 陰離子交換柱上進(jìn)行梯度洗脫，得到3個(gè)分離尖峰，后續(xù)實(shí)驗(yàn)證明1 mg/mL純化黏液糖蛋白對(duì)DPPH自由基清除率達(dá)到13.77%，并且具有顯著地促進(jìn)傷口愈合活性。

3.2.2 凝膠柱層析

經(jīng)陰離子交換柱層析所得到的樣品，其分子質(zhì)量可能具有一定的差異性，凝膠柱層析法是根據(jù)目標(biāo)分子質(zhì)量大小的不同而達(dá)到分離的目的，在對(duì)未知糖鏈結(jié)構(gòu)的糖蛋白進(jìn)行分離純化時(shí)，2種層析法共同使用可達(dá)到較高的區(qū)分度。大分子不能進(jìn)入凝膠顆粒中，而小分子能夠自由進(jìn)入凝膠顆粒，需要花費(fèi)更長(zhǎng)時(shí)間流經(jīng)柱床，故凝膠柱層析又名排阻色譜。常用的洗脫劑為無(wú)鹽水，通過(guò)一定的流速控制，達(dá)到進(jìn)一步分離不同大小糖蛋白的目的。而為了避免凝膠對(duì)于糖蛋白少量的吸附，可以使用適量的鹽溶液對(duì)其洗脫，則有更好的洗脫效果。劉豪[36]通過(guò)交聯(lián)葡聚糖凝膠G-100(Sephadex G-100)進(jìn)一步純化大鯢黏液糖蛋白，得到2個(gè)較好分離度的尖峰，經(jīng)苯酚硫酸法驗(yàn)證后，得到目標(biāo)糖蛋白，結(jié)合十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳證明得到了單一大鯢黏液糖蛋白純品。

3.2.3 親和柱層析

生物大分子具有生物學(xué)特異性，即為專一性親和力，利用單糖和寡糖能夠與凝集素可逆結(jié)合的原理來(lái)分離純化糖蛋白。含有糖基的生物大分子：糖蛋白、酶、多糖和抗原等能夠與凝集素產(chǎn)生親和吸附，而不能與凝集素產(chǎn)生特異結(jié)合的物質(zhì)會(huì)隨著洗脫液流出，后續(xù)再用含有某種甲基糖苷或是某種糖的緩沖液洗脫特異吸附的目標(biāo)物質(zhì)[43]。在已知提取目標(biāo)糖蛋白含有特定的糖鏈結(jié)構(gòu)時(shí)，采用親和柱層析分離效果較好，區(qū)分度高。不同的凝集素所能結(jié)合的糖鏈結(jié)構(gòu)有所不同，例如，刀豆凝集素可結(jié)合二天線(無(wú)平分型N-乙酰氨基葡萄糖基)、高甘露糖型、雜合型糖鏈；麥胚凝集素可結(jié)合平分型N-乙酰氨基葡萄糖基、唾液酸;花生凝集素可結(jié)合N-乙酰半乳糖胺基Gal β1-3 GalNAc等。王艷等[40]采用刀豆凝集素A親和層析法，分離純化玉竹糖蛋白，結(jié)合HPLC分析，得到2組不同尖峰，證明親和層析分離度優(yōu)良。而隨著對(duì)不同種類糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)的深入了解，根據(jù)其活性位點(diǎn)的不同，更多的方法，如酰肼法、硼酸親和層析法、免疫法等也有一定的應(yīng)用。

4 糖蛋白理化表征方式

結(jié)構(gòu)決定物質(zhì)的性質(zhì)。對(duì)于糖蛋白理化表征，常用的方法有氣相色譜、差示掃描量熱分析、紅外吸收光譜、顯色反應(yīng)、凝膠電泳、薄層層析、氨基酸分析、全波長(zhǎng)紫外掃描、單糖組成分析、糖肽鍵的測(cè)定、等電點(diǎn)測(cè)定等。不同結(jié)構(gòu)以及單糖和氨基酸組成以及排列順序都會(huì)影響其生物活性。而通過(guò)一系列的檢測(cè)能夠解釋糖蛋白獨(dú)特生理活性，為糖蛋白的研究提供有力論據(jù)。

4.1 糖蛋白純度鑒定

常用的糖蛋白純度鑒定方法有凝膠層析法、親和層析法、高壓電泳法、毛細(xì)管電泳法、高效液相色譜法、超速離心法和旋光法等。一般來(lái)說(shuō)對(duì)于糖蛋白純度的鑒定需要采用2種以上的方法。

薛張芝等[23]采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)墨魚纏卵腺糖蛋白純度進(jìn)行鑒定，采用考馬斯亮藍(lán)染色法以及糖原染色法對(duì)其染色，由于糖蛋白本身所具有的糖與蛋白的性質(zhì)，會(huì)對(duì)2種不同的染色方法產(chǎn)生表征反應(yīng)，2塊不同的染色膠上相近位置只有1條染色條帶，并且兩者位置相同，證明純化物是糖蛋白，達(dá)到電泳純。田庚元等[44]通過(guò)高效液相色譜法鑒定枸杞子糖蛋白純度得到單一對(duì)稱峰，并且采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，以蛋白質(zhì)和糖原2種染色方法對(duì)2種膠塊進(jìn)行染色，得到了位置相近的單一條帶，由此證明所提取的糖蛋白為單一純品。LI等[45]分離純化了灰鼬肉水解產(chǎn)物中的糖蛋白成分，經(jīng)柱層析純化和HPLC檢測(cè)，為單一對(duì)稱峰，結(jié)果表明得到了糖蛋白純品。

4.2 單糖與氨基酸組成分析

作為一種結(jié)合蛋白，不同糖蛋白中單糖與氨基酸的組成與含量都會(huì)影響其生物活性，所以分析糖蛋白的單糖與氨基酸組成是探索糖蛋白的重要步驟，如一些氨基酸排序以及構(gòu)成與其氧化性有密切關(guān)系。

糖蛋白中單糖組分常見(jiàn)的分析方法有氣相色譜法、薄層色譜法、高效液相色譜法和紙層析法。LI等[46]對(duì)油茶糖蛋白用H2SO4在氮?dú)鈼l件下進(jìn)行水解，衍生化后采用GC對(duì)樣品進(jìn)行分析，來(lái)檢測(cè)其中的單糖的組成，同時(shí)采用氨基酸自動(dòng)分析儀檢測(cè)檢測(cè)油茶糖蛋白中的氨基酸成分結(jié)果證明其主要含有鼠李糖、阿拉伯糖、木糖三種單糖；谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸3種氨基酸。一些糖蛋白中含有人體必需氨基酸以及藥用氨基酸，后續(xù)的加工工藝中可以考慮應(yīng)用于產(chǎn)品的開發(fā)研究。

4.3 糖肽鍵類別鑒定

糖蛋白中糖肽鍵為2種：O-型糖肽鍵和N-型糖肽鍵，前者對(duì)堿不穩(wěn)定，在NaOH溶液中易發(fā)生β-消除反應(yīng)，糖肽鍵上的絲氨酸和蘇氨酸由于堿的作用下被轉(zhuǎn)化成α-氨基丙烯酸和α-丁基丙烯酸，這兩者會(huì)在240 nm吸光度處產(chǎn)生明顯的紫外吸收[47]。通常對(duì)于糖蛋白樣品溶于NaOH溶液中進(jìn)行反應(yīng)，以溶于水的樣品作為對(duì)照，進(jìn)行全波長(zhǎng)紫外掃描，通過(guò)判斷對(duì)照240 nm處吸光度的變化對(duì)糖蛋白中糖肽鍵類別進(jìn)行初步判斷。

4.4 糖鏈結(jié)構(gòu)分析

糖蛋白中單糖的組成、環(huán)狀構(gòu)象、不同單糖之間的連接位置、鏈接順序等對(duì)糖鏈組成結(jié)構(gòu)有影響[48]。通常采用直接分析，即芯片法或是糖鏈釋放的方法對(duì)糖鏈結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。芯片法通過(guò)凝集素對(duì)糖蛋白進(jìn)行一定的化學(xué)修飾所采用的方法，通過(guò)凝集素與糖蛋白特異性結(jié)合進(jìn)行分析。糖鏈釋放是通過(guò)化學(xué)或者酶法特異性切割糖蛋白，得到完整的糖鏈結(jié)構(gòu)，能夠更完整地得到糖鏈地信息如單糖的組成、分支、鏈接方式等。

目前通過(guò)紅外吸收光譜和核磁共振波譜法能夠了解糖苷鍵的位置、糖殘基、糖苷鍵類型等。廉亞楠等[49]對(duì)甘草硒糖蛋白進(jìn)行紅外光譜分析，結(jié)果表明其在1 000～1 200 cm-1處存在C—O鍵的吸收峰，表明糖蛋白中含有吡喃環(huán)。ZHANG等[50]提取鏈霉菌中的糖蛋白，進(jìn)行核磁共振波譜法分析。其1H譜圖像證明，鏈霉菌糖蛋白中含有苯丙氨酸殘基和鼠李糖殘基甲基而13C譜圖像則表明其含有D-(1,6)連接的糖苷殘基。

5 糖蛋白生物活性作用

作為一種結(jié)合型蛋白，糖蛋白有著蛋白與多糖2種物質(zhì)的特點(diǎn)，具有多種生物活性功能，例如抗氧化、抗疲勞、抗腫瘤、抗菌作用，免疫調(diào)節(jié)功能以及細(xì)胞間相互識(shí)別的作用等，這些作用取決于自身蛋白以及寡糖鏈的結(jié)構(gòu)以及組成，相互協(xié)同作用共同構(gòu)成了糖蛋白的獨(dú)特生理活性。

5.1 抗氧化作用

人體在生命活動(dòng)中會(huì)產(chǎn)生自由基，它能夠破壞人體組織，導(dǎo)致許多疾病的產(chǎn)生和發(fā)展，自由基累積到一定程度還會(huì)誘發(fā)細(xì)胞癌變，破壞周圍正常細(xì)胞。所以開發(fā)一種能夠去除人體內(nèi)自由基、具有抗氧化和抗衰老功效的物質(zhì)具有重大的意義，尤其是天然的抗氧化物更是研究熱點(diǎn)。有許多的研究表明，糖蛋白具有抗氧化、清除自由基以及活性氧的功效，這些功效與糖蛋白中蛋白與糖的組成，以及糖蛋白的結(jié)構(gòu)密不可分。

裙帶菜糖蛋白[51]具有清除DPPH自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基的能力,并且呈現(xiàn)出一定的劑量與pH的相關(guān)性，這些活性可能與糖蛋白的結(jié)構(gòu)多樣性有關(guān)。張金豫等[52]通過(guò)水提醇沉法提取，并且經(jīng)過(guò)純化得到大鯢黏液糖蛋白能夠起到對(duì)羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基的清除作用。從海馬中分離純化得到的2組糖蛋白HG-11與HG-21對(duì)DPPH自由基均有一定的清除能力[53]，而由于疏水性氨基酸以及芳香族氨基酸含量的差異，HG-21的抗氧化性強(qiáng)于HG-11。

5.2 抗菌作用

細(xì)菌廣泛地存在于自然界之中，一些細(xì)菌能夠與人共存且不會(huì)引起疾病。但是有些細(xì)菌卻是致病甚至是致命的，例如鏈球菌或是葡萄球菌，可能會(huì)引起肺炎和腦膜炎等疾病。近年來(lái)，人們對(duì)具有抗生素抗性的細(xì)菌關(guān)注不斷上升，而考慮到化學(xué)抗菌劑的有害作用，近年對(duì)于具有天然抗菌能力的產(chǎn)品研究日趨增長(zhǎng)，并用于健康以及食品工業(yè)方面。其中糖蛋白具有廣泛的結(jié)構(gòu)多樣性，在生物學(xué)中起到重要的作用，能夠作為抗菌、抗病毒或是抗真菌劑。

ABDEL-SHAFI等[54]通過(guò)硫酸銨沉淀法提取并純化非洲鯰魚的黏液糖蛋白(mucous glycoprotein，CFG)，對(duì)9種病原菌進(jìn)行抗菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明其最低抑菌濃度為50 μg/mL，并且CFG對(duì)9種致病菌的生長(zhǎng)有抑制作用，尤其是大腸桿菌和傷寒沙門氏菌在30 h 的生長(zhǎng)內(nèi)能夠起到完全抑制作用，當(dāng)CFG與抗生素聯(lián)合使用時(shí)有顯著的協(xié)同抗菌作用。陳淑敏等[55]提取純化曼氏無(wú)針烏賊纏卵腺糖蛋白，以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌作為研究對(duì)象，采用牛津杯法測(cè)定其抑菌效果，結(jié)果表明曼氏無(wú)針烏賊纏卵腺糖蛋白抗菌活性優(yōu)于同濃度的山梨酸鉀，對(duì)于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果顯著。表明天然糖蛋白能夠應(yīng)用于某些食品應(yīng)用和保存過(guò)程中，能夠減少化學(xué)抗生素的用量，具有一定的實(shí)用前景。

5.3 抗腫瘤作用

腫瘤是人體某部位由于某種外因或內(nèi)因誘發(fā)導(dǎo)致細(xì)胞異常形成的局部腫塊，經(jīng)常出現(xiàn)在炎癥結(jié)束的過(guò)程之中，成為對(duì)人類健康的重大威脅。近幾年的藥理實(shí)驗(yàn)證明，天然提取的糖蛋白可以通過(guò)作用于免疫調(diào)節(jié)機(jī)制增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬能力、凋亡蛋白等達(dá)到有效預(yù)防腫瘤和抗腫瘤的目的。

從甘薯中分離的糖蛋白SPG-8700能夠通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞，亡并且顯著抑制無(wú)胸腺裸鼠中HCT116腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[56]，減少腫瘤48%的體積，同時(shí)伴隨凋亡蛋白Bax的劑量依賴性上升和抗凋亡細(xì)胞Bcl-2的下降；ELENA等[57]分離純化擔(dān)子菌菌絲體中的糖蛋白能夠抑制人與動(dòng)物癌細(xì)胞系如:A549S、HeLa、Hep-2、SPEV-2和C6，對(duì)其產(chǎn)生細(xì)胞毒性，而擔(dān)子菌菌絲體中高活性凝集素能顯著抑制細(xì)胞系的代謝活性。從油茶中分離純化的COG2a糖蛋白[58]能夠有效誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的凋亡，激活caspase-3和Bax的促凋亡基因，提高小鼠胸腺和胰腺指數(shù)、淋巴細(xì)胞數(shù)、白細(xì)胞數(shù)、CD4/CD8比值和干擾素-γ指數(shù)，增強(qiáng)免疫功能。

5.4 其他生物活性

糖蛋白還能夠起到調(diào)節(jié)免疫活性、降血糖和降血脂的作用等的潛力。而機(jī)體有良好的免疫功能是保持身體健康的重要前提條件，能夠抵御病原的危害。

甘薯糖蛋白具有加強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬作用的功能，并且能夠顯著降低患有高血脂癥大鼠體內(nèi)血清膽固醇以及甘油三酯的含量，顯著提高高密度脂蛋白并且降低低密度脂蛋白的含量[59]。張琳等[60]采用水提醇沉法和硫酸銨分級(jí)沉淀法提取南瓜糖蛋白，建立嘧啶型糖尿病小鼠模型，通過(guò)監(jiān)測(cè)血糖值發(fā)現(xiàn)，高劑量南瓜糖蛋白能夠達(dá)到33.75%的降糖率，對(duì)小白鼠體重和血糖有顯著影響。任國(guó)艷等[61]從海蜇中分離純化出1種新型糖蛋白(JGP-III2)，通過(guò)建立免疫底下小鼠模型，進(jìn)行免疫活性機(jī)理研究，結(jié)果表明JGP-III2能夠顯著提高免疫低下小鼠脾臟指數(shù)、巨噬細(xì)胞吞噬能力等指標(biāo)，促進(jìn)免疫低下小鼠淋巴細(xì)胞Th1類細(xì)胞因子mRNA表達(dá)，抑制Th2類細(xì)胞因子mRNA表達(dá)，整體提高細(xì)胞免疫活性。

6 結(jié)論與展望

近年來(lái)，人們對(duì)于健康問(wèn)題愈發(fā)重視，諸如一些含有“抗氧化”“天然抗菌”等標(biāo)簽的保健品頗受青睞，而人們同時(shí)看重這些保健品所含的成分是否“天然”。隨著科學(xué)研究的進(jìn)一步深入，天然糖蛋白的各種生理功能也被不斷發(fā)掘，在食品科學(xué)、免疫學(xué)、醫(yī)藥學(xué)、生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)多領(lǐng)域能夠得到更多的應(yīng)用。如前文所述，一些糖蛋白具有抗氧化、抗癌細(xì)胞增殖的活性作用。我國(guó)動(dòng)植物資源豐富，能夠從中提取大量天然糖蛋白，甚至是從一些如大鯢黏液、貝殼內(nèi)臟等加工時(shí)所丟棄的材料中提取富含生物活性的糖蛋白，能夠提高產(chǎn)品加工過(guò)程中的附加價(jià)值。

對(duì)于糖蛋白的研究也存在著一些問(wèn)題，例如糖蛋白的富集純化過(guò)程復(fù)雜，難以適應(yīng)工業(yè)上的大規(guī)模生產(chǎn)，不同的糖蛋白其性質(zhì)也略有差異，故需要優(yōu)化糖蛋白的提取工藝，以期能達(dá)到最高得率。如前文中提到，富集純化的過(guò)程需經(jīng)過(guò)層層提取、篩選，在這些過(guò)程中保證糖蛋白的生物活性同樣也是亟待解決的問(wèn)題。目前對(duì)于糖蛋白的研究很大程度上停留在對(duì)于目標(biāo)產(chǎn)物的提取純化方面，結(jié)構(gòu)、功能甚至是一些臨床應(yīng)用方面也較少，諸如抗氧化、抗癌和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)大部分停留在體外實(shí)驗(yàn)的過(guò)程，對(duì)于建立人體模型還鮮有報(bào)道。

其次天然糖蛋白具有多種生物活性，其特殊的生物活性與糖蛋白的結(jié)構(gòu)緊密相關(guān)，未來(lái)對(duì)于糖蛋白的研究可以從糖蛋白的生物活性與其構(gòu)效關(guān)系方面進(jìn)行研究，如:糖基化修飾位點(diǎn)、糖鏈結(jié)構(gòu)、單糖與氨基酸組成排列、糖苷鍵等相關(guān)性分析。目前對(duì)于糖蛋白結(jié)構(gòu)以及生理活性的研究存在不足，需要進(jìn)一步深入。

雖然對(duì)于糖蛋白的研究還有諸多的困難和問(wèn)題，但無(wú)疑對(duì)于糖蛋白的研究仍具有廣闊前景。通過(guò)研究不僅能夠探索更多具有生物活性的物質(zhì)，還能夠提高一些“下腳料”的附加產(chǎn)值，為一些藥品和食品的開發(fā)提供新思路。