高錦鴻,蘆鑫,孫強(qiáng),黃紀(jì)念*,王強(qiáng),賈聰,王瑞丹
1(河南省農(nóng)科院農(nóng)副產(chǎn)品加工研究所,河南 鄭州,450002)2(河南省農(nóng)產(chǎn)品生物活性物質(zhì)工程技術(shù)研究中心,河南 鄭州,450002)3(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,北京,100193)
花生,一年生豆科草本植物[1],是重要的高蛋白油料作物之一。我國(guó)是世界花生生產(chǎn)大國(guó),2019年產(chǎn)量約1 752萬(wàn)t?;ㄉt衣作為花生加工副產(chǎn)物之一,資源豐富,年產(chǎn)量約45萬(wàn)t(按花生總質(zhì)量的2.6%計(jì)[2])。目前,除少量花生紅衣應(yīng)用于制藥及食品加工[3],大多用于飼料或被舍棄,其商業(yè)價(jià)值十分低廉,僅約70 ~120元/t,在很大程度上造成資源浪費(fèi)。
花生紅衣含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分,除含有約37%~42%的纖維素、10%~14%的脂肪和11%~17%的蛋白外,還含有約15%的酚類物質(zhì)[4]。花生紅衣中含有的酚類物質(zhì)具有降血糖、清除自由基、促進(jìn)血小板生成、降血脂及抑菌等多種生理功能[5]。CHRISTMAN等[6]通過(guò)體內(nèi)外試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)花生紅衣多酚提取物具有降血糖功效;趙萍等[7]的研究表明花生紅衣多酚提取物對(duì)DPPH自由基具有較好的清除能力;劉婧依等[8]探討了升血小板膠囊聯(lián)合花生衣提取液治療特發(fā)性血小板減少性紫癜患者的臨床效果,結(jié)果表明血小板數(shù)目高于對(duì)照組。為充分利用花生紅衣中的酚類物質(zhì),國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)花生紅衣的提取方法開(kāi)展了諸多研究,目前采用的主要方法包括溶劑提取、超聲波輔助提取及微波輔助提取[9]。
研究發(fā)現(xiàn),花生紅衣酚類提取物的活性強(qiáng)弱受其酚類物質(zhì)的組成和含量的影響[10-11],而花生紅衣中酚類物質(zhì)的組成和含量又受到花生品種等因素的影響,例如,宋昱等[10]對(duì)3個(gè)不同花生品種的花生衣中的原花青素進(jìn)行了檢測(cè)分析,發(fā)現(xiàn)花生衣原花青素組分的單體種類及含量均不同;張姣勤[11]對(duì)8個(gè)不同花生品種中的多酚含量進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果可大致分為3組,含量分別為190、160、130 mg/g,總酚含量具有較大差異,且不同單酚間也具有明顯差異,但單酚含量未進(jìn)行定量分析。因此分析不同品種間花生紅衣中的酚類物質(zhì)組成和含量,掌握花生紅衣酚類物質(zhì)的組成變化規(guī)律,對(duì)于花生紅衣制藥及功能性花生紅衣食品的選材和質(zhì)量控制尤為重要。目前,雖然國(guó)內(nèi)外開(kāi)展了花生紅衣酚類成分分析的研究,但研究不系統(tǒng),僅集中于總酚、某種酚類濃度檢測(cè),且未覆蓋在不同花生品種中分布規(guī)律[12-15]。此外,現(xiàn)有的檢測(cè)花生紅衣酚類物質(zhì)的主要方法為HPLC,由于花生紅衣中的酚類物質(zhì)組成復(fù)雜,不同酚類濃度相差懸殊,造成現(xiàn)有高效液相檢測(cè)方法存在預(yù)處理繁瑣,檢測(cè)過(guò)程復(fù)雜,難以兼顧多種酚類檢測(cè)等缺點(diǎn),難以滿足花生紅衣酚類物質(zhì)檢測(cè)工作,有必要建立一種更加方便、準(zhǔn)確、高效的適宜檢測(cè)花生紅衣中主要酚類物質(zhì)高效液相方法。
因此,本文通過(guò)實(shí)驗(yàn)構(gòu)建能夠同時(shí)檢測(cè)8種花生紅衣中酚類的HPLC方法,通過(guò)分析40種花生紅衣的酚類物質(zhì)組成,利用相關(guān)性分析方法和聚類分析方法進(jìn)行相關(guān)性分析和類群劃分,以揭示花生紅衣間8種酚類成分的含量特點(diǎn)、不同酚類成分之間的相關(guān)性及類群之間的差異性,為花生紅衣的開(kāi)發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。
材料:供試40個(gè)花生品種由河南綠色作物研究中心提供,具體花生品種如下:遠(yuǎn)雜9102(YZ9102)、花育23(HY23)、花育24(HY24)、魯花11(LH11)、天府3號(hào)(TF3)、豐華(FH)、四粒紅(SLH)、冀花2號(hào)(JH2)、二粒紅(ELH)、白沙1016(BS1016)、冀花5號(hào)(JH5)、花育26(HY26)、大白沙(DBS)、拔二罐(BEG)、黑花生(HHS)、白沙(BS)、花育25號(hào)(HY25)、白沙308(BS308)、冀花4號(hào)(JH4)、國(guó)育2016(GY2016)、小白沙(XBS)、大果101(DG101)、豫花9414(YH9414)、大麻(DM)、商花5號(hào)(SH5)、魯花14(LH14)、徐花13(XH13)、徐花14(XH14)、遠(yuǎn)雜9307(YZ9307)、青花6號(hào)(QH6)、花育16(HY16)、漯花8號(hào)(LH8)、豫花25(YH25)、花育37(HY37)、花育19(HY19)、豐花1號(hào)(FH1)、冀花20(JH20)、花育48(HY48)、花育42(HY42)、花育38(HY38),其中HHS、GY2016為黑花生。花生經(jīng)去紅衣機(jī)分離并收集紅衣,保存于-4 ℃冰箱中。
原兒茶素、表沒(méi)食子酸兒茶素、兒茶素、咖啡酸、表兒茶酸、原花青素C1、阿魏酸、表兒茶素沒(méi)食子酸酯和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%),北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司;乙腈(色譜純),美國(guó)VBS公司;冰乙酸(HPLC≥99.9%),阿拉??;其余試劑均為分析純。
Ultimate 3000高效液相色譜儀,美國(guó)賽默飛公司;XS205電子天平,上海梅特勒-托利多儀器有限公司;T18DS25高速均質(zhì)機(jī),艾卡(廣州)儀器設(shè)備有限公司;XH-2008DE智能溫控雙頻超聲波合成/萃取儀,北京祥鵠科技發(fā)展有限公司;Lyovac GT1 型冷凍干燥機(jī),德國(guó)SRK公司。
1.3.1 HPLC條件
HPLC色譜柱:X-Bridge shield RP18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);柱溫,30 ℃;進(jìn)樣量,10 μL;檢測(cè)波長(zhǎng):250 nm(原兒茶酸、表沒(méi)食子酸兒茶素)、280 nm(兒茶素、表兒茶素、原花青素C1、表兒茶素沒(méi)食子酸酯)、320 nm(阿魏酸、咖啡酸)和370 nm(蘆丁);流動(dòng)相A:0.1%乙酸-乙腈溶液,流動(dòng)相B: 0.1%乙酸-水溶液;梯度洗脫:0~7 min(5% A~7% A,1 mL/min); 7~30 min(7% A~10% A, 1 mL/min);30~60 min(10% A~12% A,1 mL/min);60~80 min(12% A~15% A,1 mL/min);80~100 min(15% A~80% A, 1~0.9 mL/min )。
1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備
分別精確稱取一定質(zhì)量的原兒茶酸、兒茶素、咖啡酸、表兒茶素、原花青素C1、阿魏酸、表兒茶素沒(méi)食子酸酯和蘆丁8種標(biāo)準(zhǔn)品,加甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中,其中蘆丁需加入少量二甲基亞砜助溶。隨后配制成一系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。將標(biāo)準(zhǔn)品溶液用0.45 μm微孔過(guò)濾膜過(guò)濾,用HPLC分析檢測(cè),并建立相對(duì)應(yīng)的回歸方程。
1.3.3 花生紅衣中酚類物質(zhì)的提取
1.3.3.1 超聲波輔助提取[12]
以大果101為例,取適量花生紅衣,置于粉碎機(jī)中,粉碎過(guò)60目篩,精確稱取適量篩下物置于錐形瓶中,分別采取均質(zhì)提取、超聲提取和回流提取等提取方法,對(duì)不同提取溶劑、提取時(shí)間、料液比等因素做單因素試驗(yàn)探究酚類化合物的提取率,以提取率為主要指標(biāo),綜合考慮提取方法,選擇80%(體積分?jǐn)?shù))乙醇水溶液作為提取溶劑、料液比1∶30(g∶mL)、超聲波輔助提取花生紅衣中酚類物質(zhì),超聲時(shí)間20 min,超聲功率 300 W,超聲溫度40 ℃,超聲提取后5 000 r/min 離心15 min,收集上清液,沉淀重復(fù)上述操作2次,合并3次花生紅衣酚類化合物提取液,經(jīng)減壓濃縮、真空冷凍干燥,獲得花生紅衣酚類提取物。
1.3.3.2 供試樣品的制備
將各花生品種的花生紅衣酚類提取物保存于干燥器中備用。經(jīng)考察溶劑、料液比、超聲波輔助溶解時(shí)間等因素,選擇甲醇為溶劑,稱取0.1 g花生紅衣酚類提取物,以料液比1∶50(g∶mL) 配制成溶液,超聲輔助溶解20 min,10 000 r/min 離心10 min,收集上清液,既得供試樣品,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.3.3 花生紅衣中酚類化合物的檢測(cè)
將供試樣品溶液經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后置于進(jìn)樣瓶中,用于HPLC檢測(cè)。以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度(μg/mL)為縱坐標(biāo),以對(duì)應(yīng)峰面積為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并進(jìn)行回歸計(jì)算得到8種酚類化合物回歸方程,檢測(cè)供試樣品中8種酚類物質(zhì)的含量。每種酚類化合物分別以信噪比為3和10對(duì)應(yīng)的酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度計(jì)算檢出限和定量限。
所有數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值,應(yīng)用SPSS 16.0 和Origin 8.5對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。
由圖1-a可以看出,在此色譜條件下,8種酚類化合物的標(biāo)準(zhǔn)品可得到較好的分離。由圖1-b可知,大果101花生紅衣中除蘆丁外,其余7種酚類物質(zhì)均有檢出,且目標(biāo)峰的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品溶液的保留時(shí)間一致,在此色譜條件下花生紅衣樣品中的酚類化合可物得到較好的分離。
峰1-原兒茶酸;峰2-兒茶素;峰3-表兒茶酸;峰4-阿魏酸;峰5-原花青素C1;峰6-表兒茶素沒(méi)食子酸酯;峰7-咖啡酸;峰8-蘆丁a-八種酚類物質(zhì)在250、280、320、370 nm處的液相檢測(cè)圖譜;b-花生樣品大果101提取液在相同條件下的液相檢測(cè)圖譜圖1 酚類標(biāo)準(zhǔn)品及DG101的高效液相檢測(cè)圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of phenolic standard and DG101
在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下,將一系列混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)HPLC分析,以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度(μg/mL)為縱坐標(biāo),各酚類物質(zhì)對(duì)應(yīng)的峰面積為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,如表1所示,8種酚類物質(zhì)在標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。
表1 八種酚類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限Table 1 Regression equations, correlation coefficients, linear ranges, limits of detection and limits of quantitation of eight phenols
如表2所示,HPLC方法學(xué)考察結(jié)果顯示,8種酚類物質(zhì)的精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)為0.67%~1.96%,穩(wěn)定性RSD為0.73%~2.31%,重復(fù)性RSD為1.85%~3.92%,平均回收率為94.15%~100.62%,RSD為0.86%~2.74%,表明儀器精密度良好,實(shí)驗(yàn)方法穩(wěn)定性、重復(fù)性和加標(biāo)回收率均符合常規(guī)定量分析要求,可以滿足花生紅衣中8種酚類物質(zhì)的含量測(cè)定要求。且該HPLC方法與張姣勤[11]建立的花生紅衣酚類HPLC檢測(cè)方法相比,基線平穩(wěn),雜峰少;與劉翠[16]建立的HPLC方法相比,省去了固相微萃取柱的樣品純化,采用甲醇再溶解,既除去部分雜質(zhì),又提高供試樣品濃度,降低檢測(cè)成本;與RESURRECCION等[17]建立的檢測(cè)方法相比,簡(jiǎn)化了樣品的純化步驟,減少了有毒試劑的使用,且降低了流動(dòng)相的流速,對(duì)設(shè)備要求降低,更便于推廣使用。
表2 八種酚類物質(zhì)的方法學(xué)考察Table 2 Methodological study of eight phenols
采用上述HPLC檢測(cè)方法,對(duì)40種不同品種花生紅衣中的8種酚類物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè),為了直觀系統(tǒng)地表明各品種間中不同酚類物質(zhì)的變化情況,通過(guò)描述性分析對(duì)于40種不同品種花生紅衣中的酚類物質(zhì)進(jìn)行了綜合表述。由表3可知,40種不同品種花生紅衣的8種酚類物質(zhì)的總含量平均值為1.692 mg/g,且各個(gè)品種間酚類物質(zhì)總含量存在差異,介于0.901~3.390 mg/g。8種酚類物質(zhì)在不同品種的花生紅衣中存在差異性,變異系數(shù)介于0.447~4.783,其中蘆丁的變異系數(shù)最大為4.783,其次為表兒茶酸和咖啡酸分別為2.950和0.892,研究結(jié)果與張姣勤[11]、劉翠[16]、RESURRECCION等[17]的研究結(jié)果一致。8種酚類物質(zhì)中,原花青素C1在花生紅衣中的平均含量最高為0.729 mg/g,含量分布為0.141~1.947 mg/g,其次為兒茶素平均含量0.406 mg/g,含量分布為0.181~1.120 mg/g,分別占8種酚類總含量的43.08%和24.00%,平均含量較低的酚類物質(zhì)為咖啡酸、表兒茶酸和蘆丁,咖啡酸含量為0.000~0.063 mg/g,平均值為0.021 mg/g,表兒茶酸含量為0.000~0.530 mg/g,平均值為0.034 mg/g,蘆丁含量為0.000~4.783 mg/g,平均值為0.034 mg/g,其僅在HHS和GY2016中檢出,且二者均為黑花生。
為了更為直觀地表述40種酚類物質(zhì)中測(cè)得的8種酚類物質(zhì)的具體分布情況,采用近年來(lái)被廣泛應(yīng)用的熱圖分析方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析,如圖2所示,熱圖中顏色越接近藍(lán)色,表示相對(duì)值越高,越接近紅色,表示相對(duì)值越低。研究表明,原花青素C1是表兒茶素三聚體,具有抗癌、降糖等功效,尤其是在抗黑色素腫瘤方面效果明顯[18];兒茶素為花生紅衣中有效的止血成分,且具有抗氧化、抗癌及抑菌作用[19];表兒茶素沒(méi)食子酸酯是一種兒茶素單體,具有抗癌、抑菌等藥理活性[20];且阿魏酸、原兒茶酸、表兒茶酸、蘆丁及咖啡酸,也具有抗病毒、神經(jīng)保護(hù)、消炎等多種生理功能[21-24]。因此,花生紅衣中酚類物質(zhì)的種類及含量豐富,且這些酚類物質(zhì)均具備多種生理活性功能,表明花生紅衣具備開(kāi)發(fā)功能性大健康食品的潛質(zhì)。
表3 不同品種花生紅衣中8種酚類物質(zhì)的統(tǒng)計(jì)分析 單位:mg/g
圖2 八種酚類物質(zhì)含量的熱圖分析Fig.2 Heatmap of eight phenolic content
花生紅衣中8種酚類化合物的相關(guān)性如表4所示,原兒茶酸、兒茶素、表兒茶素沒(méi)食子酸酯與原花青素C1、兒茶素與咖啡酸均呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)(r=0.432,r=0.510,r=0.404,r=0.445,P<0.01),原兒茶酸與表兒茶素沒(méi)食子酸酯呈現(xiàn)顯著正相關(guān)(r=0.392,P<0.05)。阿魏酸與原兒茶酸、原花青素C1及表兒茶素沒(méi)食子酸酯均呈現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.538,r=-0.597,r=-0.502,P<0.01),其余酚類化合物之間無(wú)顯著相關(guān)性。該研究結(jié)果可能與這些酚類物質(zhì)生物合成及代謝通路有關(guān),通過(guò)KEGG(https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)代謝途徑對(duì)8種酚類化合物原兒茶酸(C00230)、兒茶素(C06562)、咖啡酸(C01197)、表兒茶酸(C09727)、阿魏酸(C01494)、表兒茶素沒(méi)食子酸脂(C09731)、蘆丁(C06801)及原花青素C1(C17642)所涉及的代謝通路查詢可知,它們涉及的代謝通路包括12條,其中苯丙素的生物合成(map 01061)包含這些物質(zhì)的種類最多為6種(圖3)。由圖3可知,苯丙素類化合物的生物合成的經(jīng)糖酵解生成 (-)-3-去氫莽草酸, (-)-3-去氫莽草酸生成原兒茶酸與莽草酸酯,莽草酸酯經(jīng)酶的反應(yīng)生成對(duì)香豆酸,對(duì)香豆酸可合成咖啡酸、阿魏酸,并最終形成木脂素化合物,同時(shí),也參與合成柚皮素查耳酮,隨后形成表兒茶素、兒茶素,延伸為原花青素C1,最終聚合為高聚花青素。阿魏酸與原兒茶酸、原花青素C1屬于代謝通路中的不同分支,存在競(jìng)爭(zhēng)性關(guān)系,這與阿魏酸同原兒茶酸、原花青素C1呈現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)的結(jié)果相一致;而原花青素C1為兒茶素及表兒茶素的延伸單位,和兒茶素與原花青素C1呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)的結(jié)果相一致。物質(zhì)在生物體內(nèi)的合成代謝過(guò)程是復(fù)雜,且受環(huán)境(外部因素)與基因(內(nèi)部因素)的調(diào)控,因此原兒茶酸與原花青素C1及兒茶素與咖啡酸的相關(guān)性與該代謝通路中呈現(xiàn)的關(guān)系相矛盾,這一結(jié)果可能與它們參與的其他生物代謝通路有關(guān),后續(xù)仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。
表4 相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis
以歐氏距離和最長(zhǎng)距離法對(duì)40個(gè)花生紅衣品種進(jìn)行聚類分析[25],如表5和圖4所示,當(dāng)歐氏距離為5時(shí),可將40個(gè)品種分成三類群。其中A群包括16個(gè)樣品,占總樣品的40.0%,該類群中蘆丁的含量均值高于B群和C群,為0.085 mg/g。B群包括17個(gè)樣品,占總樣品數(shù)的42.5%,該類群中兒茶素、原兒茶素C1的含量均值均高于A群和C群,分別為0.350、0.787 mg/g。C群包括7個(gè)樣品,占總樣品數(shù)的17.5%,其原兒茶酸、咖啡酸、表兒茶酸、表兒茶酸沒(méi)食子酸酯和阿魏酸的含量均值在三類群中均為最高,分別為0.188、0.306、0.830、0.278、0.247 mg/g。
綜上所述,3個(gè)類群具有不同的加工適用性,其中,A類群可用于蘆丁和阿魏酸開(kāi)發(fā)利用的首選資源,B類群適用于兒茶素、原兒茶素C1、表兒茶素沒(méi)食子酸酯的開(kāi)發(fā)利用,C類群可用于原兒茶素、咖啡酸、表兒茶酸、表兒茶酸沒(méi)食子酸酯和阿魏酸的開(kāi)發(fā)利用,且8種酚類物質(zhì)總含量最高。花生紅衣中酚類物質(zhì)的含量可能與花生品種、產(chǎn)地有關(guān)[10-11,17],聚類分析較好地體現(xiàn)了不同品種間花生紅衣酚類物質(zhì)的差異性,為花生紅衣?tīng)I(yíng)養(yǎng)價(jià)值及藥用開(kāi)發(fā)提供了一定的數(shù)據(jù)和理論支撐。
圖3 花生紅衣中酚類物質(zhì)在map 01061的生物合成代謝通路Fig.3 Phenolic compounds biosynthesis pathways of map 01061 in peanut skin注:方框,酶的國(guó)際命名編號(hào);圓圈,化合物;紅色圓圈,本文涉及到的酚類化合物;實(shí)箭頭,反應(yīng)方向;虛箭頭,與其他代謝途徑的關(guān)系
表5 各類群品種中8種酚類物質(zhì)的表現(xiàn)特征Table 5 Performance of eight phenolic compounds characters of various groups of varieties
圖4 聚類分析圖(最長(zhǎng)距離法)Fig.4 Cluster diagram (the furthest neighbor method)
本研究建立了HPLC同時(shí)檢測(cè)花生紅衣中8種酚類物質(zhì)的檢測(cè)方法,經(jīng)驗(yàn)證該方法重復(fù)性好、精密度高、穩(wěn)定性好、加標(biāo)回收結(jié)果準(zhǔn)確可靠,可在100 min內(nèi)對(duì)8種酚類物質(zhì)進(jìn)行有效分離,峰形對(duì)稱、分離度高。通過(guò)對(duì)40個(gè)不同品種花生紅衣中8種酚類物質(zhì)的檢測(cè)分析表明,8種酚類物質(zhì)在不同品種中的組成及含量均存在差異;不同酚類物質(zhì)間表現(xiàn)出一定的相關(guān)性;聚類分析可將40個(gè)資源劃分為三類。
酚類物質(zhì)作為花生紅衣的主要活性成分,其各組分的組成和含量對(duì)于花生紅衣的功能性質(zhì)起著決定性作用,因此,建立合理高效的檢測(cè)方法,對(duì)不同品種的花生紅衣酚類成分進(jìn)行綜合分析評(píng)價(jià),對(duì)于花生及花生紅衣品種的選育、資源開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)具有重要的研究意義,但花生紅衣中的酚類物質(zhì)成分復(fù)雜多樣,盡管本研究已實(shí)現(xiàn)8種酚類物質(zhì)的同時(shí)檢測(cè),但仍然具有一定的局限性,有待進(jìn)一步深入研究。