楊貴，張宿義,*，趙金松,4，張立強(qiáng)，楊艷，宋攀，冉茂芳，薛江林，林慧

1(四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 宜賓，644000)2(瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州，646000)3(國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川 瀘州，646000)4(四川省酒業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司川酒研究院，四川 成都，610000)

隨著我國經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，人民的生活水平逐漸提高，對(duì)白酒口味的需求越來越多元化，所以調(diào)味白酒一直是行業(yè)內(nèi)研究的重點(diǎn)。調(diào)味白酒一般采用特殊工藝生產(chǎn)，因含有較多特定的香味成分及擁有獨(dú)特風(fēng)味，在酒體設(shè)計(jì)和勾調(diào)過程中，可以明顯提高和彌補(bǔ)酒體在某些方面的不足，提升基礎(chǔ)酒的香味和口感；其特點(diǎn)在于添加量少，起到畫龍點(diǎn)睛的作用。魏志陽等[1]利用篩選自老白干酒醅中的一株高產(chǎn)乳酸干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)發(fā)酵制得乳酸發(fā)酵液，通過南極假絲酵母(Candidaantarctic)脂肪酶B催化乳酸發(fā)酵液與酒尾合成乳酸乙酯，并通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)其催化工藝進(jìn)行了優(yōu)化，最后通過蒸餾濃縮得到乳酸乙酯調(diào)味白酒。吳軒德等[2]在釀酒酵母轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸合成β-苯乙醇的基礎(chǔ)上，通過紫外誘變育種、好氧發(fā)酵與補(bǔ)料厭氧發(fā)酵的二步法工藝來研制β-苯乙醇調(diào)味白酒。目前針對(duì)調(diào)味酒的研究更多是在工藝方面，對(duì)釀造機(jī)理方面的研究相對(duì)較少；本研究是在創(chuàng)新設(shè)計(jì)并已成熟運(yùn)用的調(diào)味白酒釀造工藝基礎(chǔ)上，通過高通量測(cè)序揭示該發(fā)酵過程微生物群落演替的時(shí)空特征，并通過多元統(tǒng)計(jì)分析，解釋微生物與理化指標(biāo)的相關(guān)性以及微生物代謝間的差異，為進(jìn)一步探究調(diào)味白酒的釀造機(jī)理和提高發(fā)酵過程的可控性提供依據(jù)，為滿足消費(fèi)者多元化需求以及白酒行業(yè)高質(zhì)量發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

主要材料：某酒廠調(diào)味白酒糟醅；其釀造工藝路線如圖1所示。

圖1 調(diào)味酒釀造工藝流程圖Fig.1 Brewing process flow chart of flavoring Baijiu

該調(diào)味白酒釀造工藝是以濃香型白酒生產(chǎn)工藝為基礎(chǔ)，結(jié)合其他香型白酒生產(chǎn)工藝，創(chuàng)新設(shè)計(jì)的一套調(diào)味白酒釀造工藝，采用了續(xù)糟配料、復(fù)合配料、高溫堆積、高溫流酒、混蒸混燒、分層蒸餾、長期貯存等工藝，釀造出具有總酯含量高、口感甜凈，有明顯焦糊香味的特殊調(diào)味白酒。

試驗(yàn)試劑：CTAB Buffer、V(氯仿)∶V(異戊醇)=24∶1、V(酚)∶V(氯仿)∶V(異戊醇)=25∶24∶1、聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)6000、氯化鈉、無水乙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、葡萄糖、鹽酸、五水硫酸銅、酒石酸鉀(均為分析純)，聚合化工。

1.2 儀器與設(shè)備

TL2010S中通量組織研磨儀，北京鼎昊源科技有限公司；ND1000微量紫外可見分光光度計(jì)，Nano drop；MLS-375L全自動(dòng)滅菌鍋，日本日立公司；DHG-9245A鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DL-1 電爐，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；5804R高速冷凍離心機(jī)，德國艾本德公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 取樣

同時(shí)跟蹤相鄰3口大小(3.2 m×2.4 m×1.8 m)一樣的窖池，從入窖后，每7 d取1次樣，共發(fā)酵35 d。每次從糟醅的上層、中層和下層分別取樣，將3口窖池取自同一層次的樣品置于無菌取樣袋中立即密封混合均勻，再將其分為2份，1份保存在-20 ℃用于理化特性檢測(cè)，1份保存在-80 ℃用于基因組DNA的提取。

1.3.2 理化指標(biāo)檢測(cè)

理化指標(biāo)檢測(cè)參照《瀘型酒技藝大全》[3]。

1.3.3 DNA提取方法

稱取10 g糟醅，用十二萬基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)法提取糟醅中微生物的基因組DNA[4]?；蚪MDNA送往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序，測(cè)序數(shù)據(jù)在美吉生物云平臺(tái)(https://icloud.majorbio.com/)進(jìn)行處理。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)高通量擴(kuò)增子測(cè)序數(shù)據(jù)，利用R-3.3.1 (stat)以及Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)，對(duì)α多樣性指數(shù)組間差異檢驗(yàn)分析。利用R-3.3.1 (vegan)進(jìn)行冗余分析(redundancy analysis，RDA)，分析理化指標(biāo)與微生物群落間的相關(guān)性，并計(jì)算糟醅理化指標(biāo)與微生物群落物種分布的解釋率。利用R-3.3.1 (stat)、python-2.7 (stat) 計(jì)算物種-理化指標(biāo)之間的相關(guān)性，構(gòu)建出物種相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖。利用PICRUSt2 (v2.2.0-b) 對(duì)標(biāo)記基因(16S/ITS)序列進(jìn)行功能豐度預(yù)測(cè)，獲得每個(gè)樣本中對(duì)應(yīng)的功能信息和豐度信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化指標(biāo)分析

發(fā)酵過程中，糟醅的理化性質(zhì)能夠直觀地體現(xiàn)出當(dāng)時(shí)糟醅的發(fā)酵情況，通過動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)發(fā)酵過程中糟醅的理化性質(zhì)，進(jìn)一步解釋調(diào)味白酒發(fā)酵過程中的發(fā)酵機(jī)理。糟醅理化指標(biāo)均以絕干狀態(tài)計(jì)算(圖2)。

a-水分含量；b-酸度；c-還原糖含量；d-淀粉含量圖2 調(diào)味白酒發(fā)酵過程中糟醅理化性質(zhì)Fig.2 Physicochemical properties of fermented grains during flavoring Baijiu fermentation

如圖2所示，在發(fā)酵過程中，微生物不斷消耗糟醅中的淀粉、還原糖等，產(chǎn)生水分，使得水分含量呈現(xiàn)增長趨勢(shì)(48.12±0.4)%～(56.82±0.45)%。酸是酒體中重要的風(fēng)味物質(zhì)，能夠起到提味的作用，其主要由微生物代謝產(chǎn)生,隨著發(fā)酵進(jìn)行，糟醅酸度呈現(xiàn)逐漸增加趨勢(shì),由(3.17±0.06) mmol/10g增加至(12.8±0.04) mmol/10g，中下層糟醅酸度較高，可能是發(fā)酵過程中黃水向下滲透所致，酸度較高同時(shí)也會(huì)影響微生物的代謝活動(dòng)及酶的活性等。還原糖[(1±0.08)%-(6.8±0.06)%]和淀粉含量[(27.8±0.98)%-(41.99±0.35)%]總體都呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，淀粉被酶和有機(jī)酸逐漸分解為微生物可利用的糖；在發(fā)酵前期，因上層糟醅中含氧較高，微生物繁殖能力強(qiáng)，對(duì)糖類的消耗巨大，發(fā)酵前期上層糟醅淀粉和還原糖含量快速下降。由于水分向下滲透，將一部分淀粉和還原糖帶到中下層，可能導(dǎo)致發(fā)酵前期中下層糟醅中的淀粉和還原糖的含量略有上升且下降緩慢，后期則在微生物的利用下迅速下降。

2.2 微生物多樣性分析

如表1所示，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，細(xì)菌群落的豐富度和多樣性先增加后減少，而真菌群落的豐富度和多樣性先增加后趨于穩(wěn)定。

對(duì)Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)進(jìn)行差異性檢驗(yàn)，如圖3所示，在整個(gè)發(fā)酵期間，不同層糟醅微生物之間豐度和多樣性無顯著差異(P>0.05)；而在發(fā)酵過程中存在顯著差異，如圖4-a所示，細(xì)菌在0～7 d豐富度變化明顯(P>0.05)，第7天之后的樣本間豐富度變化差異顯著(P<0.05)，可能是微生物在0～7 d 在大量繁殖，使得豐富度增加，但由于窖池內(nèi)酸度和酒精度不斷增加，溶氧不斷減少，環(huán)境極端性增強(qiáng)，窖池內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)隨之發(fā)生轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致微生物群落豐富度在第7天之后逐漸降低，并趨于穩(wěn)定；與此同時(shí)，糟醅中微生物多樣性也會(huì)隨著微生物豐富度變化而變化。相反，在0～14 d，真菌微生物豐富度和多樣性均呈現(xiàn)迅速增加的趨勢(shì)，推測(cè)是真核微生物中，優(yōu)勢(shì)微生物大多是由酵母屬、霉菌屬等兼性厭氧或好氧微生物組成，從而使得在發(fā)酵前期有氧條件下能夠迅速繁殖的同時(shí)，還能夠在發(fā)酵后期厭氧環(huán)境下保持較高的豐富度和多樣性。微生物群落豐富度和多樣性在整個(gè)發(fā)酵過程中的變化情況與發(fā)酵溫度前緩、中挺、后緩落遙相呼應(yīng)，這也進(jìn)一步證明在白酒釀造過程中，在不同發(fā)酵時(shí)間下微生物的代謝繁殖與溫度、微生態(tài)環(huán)境變化有著一定的相關(guān)性。

a-細(xì)菌Chao指數(shù)Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)；b-細(xì)菌Shannon指數(shù)Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)；c-真菌Chao指數(shù)Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)；d-真菌Shannon指數(shù)Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)圖4 不同發(fā)酵時(shí)間的糟醅微生物α多樣性Chao、Shannon指數(shù)Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)Fig.4 Microbes in fermented grains at different fermentation times α diversity Chao, Shannon index Kruskal-Wallis H test注：“*”代表顯著性差異，*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001(下同)

2.3 微生物群落分布特征分析

2.3.1 細(xì)菌微生物群落在屬水平上的組成

基于16S rRNA高通量測(cè)序的序列數(shù)據(jù)分析表明，在發(fā)酵過程糟醅樣品中細(xì)菌分布在28個(gè)門、68個(gè)綱、159個(gè)目、276個(gè)科、520個(gè)屬、747個(gè)種以及1 617個(gè)ASV(amplicon sequence variants)集。這些細(xì)菌主要分布在厚壁菌門[Firmicutes(80%)]、變形菌門[Proteobacteria(16.33%)]、擬桿菌門[Bacteroidota(1.05%)]等。根據(jù)高通量測(cè)序結(jié)果，結(jié)合ASVs聚類分析結(jié)果和研究需求，將細(xì)菌微生物群落在屬水平上相對(duì)豐度較大的菌屬進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(圖5)。

由圖5所示，發(fā)酵第0天，醋桿菌屬[Acetobacter(55.3%)]處于優(yōu)勢(shì)地位，發(fā)酵第7天，Acetobacter(9.11%)的優(yōu)勢(shì)地位被乳酸桿菌屬[Lactobacillus(53.7%)]所取代；除此之外，優(yōu)勢(shì)物種還包括芽孢桿菌屬(Bacillus)、高溫放線菌屬(Thermoactinomyces)、氨基桿菌屬(Aminobacterium)、氫孢菌屬(Hydrogenispora)、克羅彭斯特菌屬(Kroppenstedtia)、產(chǎn)己酸菌屬(Caproiciproducens)、紅球菌屬(Rhodococcus)、互營乙酸氧化菌屬(Syntrophaceticus)等，這些微生物主要代謝產(chǎn)生乙醇、乙酸、乳酸、己酸等白酒中重要的風(fēng)味物質(zhì)及其風(fēng)味前體物質(zhì)[5-6]。值得注意的是，在發(fā)酵0～14 d，優(yōu)勢(shì)物種主要分布在Proteobacteria和Firmicutes。Proteobacteria類微生物一般都具有較強(qiáng)的固氮能力[7]，發(fā)酵0～14 d，其豐度從82%降低至1.7%；在該門類中豐度最大的是Acetobacter，因溶氧量逐漸降低，豐度也從56%逐漸降低至1.1%。相反Firmicutes豐度由12%增加至97%；隨著發(fā)酵的進(jìn)行，在發(fā)酵0～7 d高含氧量條件下，芽孢桿菌大量繁殖，豐度由2.9%增加至5.8%，后因糟醅中溶氧量減少，豐度隨之逐漸降低，并最終穩(wěn)定在0.038%。在白酒釀造過程中，芽孢桿菌不僅能夠通過自身代謝直接產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)，還能夠產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)的前體物質(zhì)，為其他微生物協(xié)同發(fā)酵和美拉德反應(yīng)提供物質(zhì)基礎(chǔ)[8]。特別是Aminobacterium、Hydrogenispora、Caproiciproducens、Rhodococcus、Syntrophaceticus等在發(fā)酵第14天后才出現(xiàn)；有研究表明，Thermoactinomyces可產(chǎn)生耐高溫α淀粉酶、絲氨酸蛋白酶、脫氫酶、多酚氧化酶和脲酶等[9]；Aminobacterium屬于Synergistetes門Synergistaceae科，是典型厭氧專性氨基酸降解細(xì)菌，在代謝氨基酸的同時(shí)能夠產(chǎn)生脂肪酸[10]，該菌在發(fā)酵后期出現(xiàn)，表明該調(diào)味酒在發(fā)酵后期產(chǎn)生了大量的氨基酸；Caproiciproducens是一類代謝產(chǎn)生氫氣、丁酸和己酸的細(xì)菌，可提供己酸乙酯的前體物質(zhì)己酸[6]，Syntrophaceticus能夠降解長鏈脂肪酸或丁酸產(chǎn)生氫氣、乙酸、丙酸[11]。Lactobacillus是整個(gè)發(fā)酵過程中的優(yōu)勢(shì)物種，在發(fā)酵0～14 d，豐度從0.5%增加至94%，并最終穩(wěn)定在95%以上至發(fā)酵結(jié)束；這是由于Lactobacillus是一類厭氧微生物，環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，具有較強(qiáng)的代謝碳水化合物產(chǎn)酸的能力，在白酒釀造過程中能夠?yàn)槠渌⑸锾峁┨荚匆约靶纬娠L(fēng)味前體物質(zhì)，是白酒釀造過程中不可或缺的一類微生物。

2.3.2 真菌微生物群落在屬水平上的組成

相對(duì)于細(xì)菌而言，真菌群落變化較為單一，分布在7個(gè)門、22個(gè)綱、41個(gè)目、100個(gè)科、172個(gè)屬、264個(gè)種以及507個(gè)ASV集。其主要分布在子囊菌門[Ascomycota(75%)]和擔(dān)子菌門[Basidiomycota(2.23%)]等(圖6)。

a-真菌屬水平豐度圖；b-真菌屬水平圈圖圖6 糟醅發(fā)酵過程中真菌屬水平豐度圖和圈圖Fig.6 Bar and circos diagram of fungi genus in fermented grains during fermentation

如圖6所示，真菌優(yōu)勢(shì)微生物包括伊薩酵母屬(Issatchenkia)、絲衣霉屬(Byssochlamys)、畢赤酵母屬(Pichia)、哈薩克斯坦酵母屬(Kazachstania)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、曲霉菌屬(Aspergillus)、節(jié)擔(dān)菌屬(Wallemia)、耐干霉菌屬(Xeromyces)、酵母菌屬(Saccharomyces)等。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，優(yōu)勢(shì)真菌Byssochlamys、Aspergillus和Kazachstania逐漸變?yōu)榉莾?yōu)勢(shì)真菌，Issatchenkia和Pichia逐漸變?yōu)閮?yōu)勢(shì)真菌，且豐度在整個(gè)發(fā)酵過程中呈線性變化趨勢(shì)，表明Lactobacillus對(duì)該發(fā)酵體系中的真菌抑制作用較弱，這也許是調(diào)味酒高酯的重要原因。在發(fā)酵第0天，Byssochlamys(59%)和Aspergillus(4.1%)處于絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)地位，為淀粉酶和糖化酶的主要生產(chǎn)者，是發(fā)酵前期淀粉含量迅速下降、還原糖含量增加的主要原因；隨著發(fā)酵的進(jìn)行，糟醅中溶氧量逐漸降低，酸度逐漸增加，其豐度逐漸降低，至發(fā)酵結(jié)束，兩者豐度都僅占1.2%；研究表明，曲霉屬在發(fā)酵過程中能夠分解原輔料中的淀粉和蛋白質(zhì)，代謝產(chǎn)生大量的還原糖和氨基酸，其代謝產(chǎn)物是構(gòu)成酒體風(fēng)味與口感的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[12]。在0～7 d，環(huán)境極端性較低時(shí)，Kazachstania大量繁殖，豐度從0.42%增加至25%，在發(fā)酵后期緩慢降低，至發(fā)酵結(jié)束豐度為3.7%；譚壹[13]研究發(fā)現(xiàn)，Kazachstania屬中Kazachstaniasp.為濃香型白酒優(yōu)勢(shì)真菌微生物，且為好氧微生物[14]；該調(diào)味酒工藝是在濃香型白酒工藝基礎(chǔ)上創(chuàng)新設(shè)計(jì)，是該調(diào)味白酒中Kazachstania的主要來源，故推測(cè)發(fā)酵后期溶氧量低是Kazachstania豐度降低的主要原因。Issatchenkia和Pichia因具有一定的嗜酸性和乙醇耐受能力強(qiáng)[15]的特點(diǎn)，故豐度在發(fā)酵過程中不斷增加；同時(shí)，在發(fā)酵前期，與乳酸桿菌屬類微生物還存在爭(zhēng)奪營養(yǎng)物質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，由于乳酸桿菌的糖代謝能力強(qiáng)于酵母菌類微生物，故其生長速率遠(yuǎn)大于酵母菌。值得注意的是，Thermoascus在發(fā)酵后期的豐度激增，該類真菌可以分泌β-木聚糖酶、堿性耐熱過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、角質(zhì)酶等酶類，可將植物細(xì)胞壁中木聚糖轉(zhuǎn)化成木糖等，并具有產(chǎn)花果香類物質(zhì)的能力，醇、酮和呋喃類是其主要的呈香載體物質(zhì)，同時(shí)還能生成散囊菌特有的“菌花香”，所以該類菌可作為重要的產(chǎn)香功能菌[16]。

2.4 微生物群落結(jié)構(gòu)和環(huán)境因素關(guān)聯(lián)分析

為更好地反映微生物群落與糟醅理化性質(zhì)之間的關(guān)系，本文通過R-3.3.1和python-2.7軟件對(duì)其進(jìn)行RDA，并基于Sperman相關(guān)性構(gòu)建雙因素相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖(圖7)。

a-細(xì)菌RDA；b-細(xì)菌基于Sperman相關(guān)性的微生物-理化指標(biāo)共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)；c-真菌RDA；d-真菌基于Sperman相關(guān)性的微生物-理化指標(biāo)共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)圖7 發(fā)酵過程中微生物與理化指標(biāo)相關(guān)性分析Fig.7 Correlation analysis between microbes and physical and chemical indexes in fermentation process注：圖b、d中紅色和綠色分別代表正和負(fù)相互作用

根據(jù)RDA結(jié)果，糟醅理化性質(zhì)對(duì)細(xì)菌和真菌群落微生物的分布解釋率分別為78.42%和46.01%(圖7-a、圖7-c)，說明糟醅理化性質(zhì)與細(xì)菌群落分布有較高的相關(guān)性，與真菌群落分布有一定的相關(guān)性。同時(shí)，根據(jù)微生物與理化雙因子相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖(圖7-b、圖7-d)，糟醅理化因子與大多數(shù)細(xì)菌和部分的真菌微生物都存在顯著的相互作用。對(duì)細(xì)菌而言，淀粉和還原糖含量與Acetobacter、Bacillus等呈顯著正相關(guān)；水分和酸度與Lactobacillus等呈顯著正相關(guān)(圖7-b)。對(duì)真菌而言，相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，淀粉和還原糖含量與Byssochlamys、Monascus等呈正相關(guān)。水分和酸度與Issatchenkia、Pichia等呈正相關(guān)，與Byssochlamys、Monascus等呈負(fù)相關(guān)(圖7-d)。酸度與第一優(yōu)勢(shì)微生物呈現(xiàn)出較強(qiáng)的正相關(guān)性，與其他多數(shù)微生物都呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性。而這主要是由于優(yōu)勢(shì)微生物在發(fā)酵過程中能夠大量代謝產(chǎn)生乳酸、乙酸，從而抑制耐酸能力差的微生物生長繁殖，其次，Lactobacillus的代謝產(chǎn)物雙乙酰，對(duì)很多腐敗菌和致病菌都有抑制作用，雙乙?？赏ㄟ^革蘭氏陰性菌精氨酸的結(jié)合蛋白反應(yīng)，從而干擾精氨酸的利用，抑制革蘭氏陰性菌的生長，這也可能是乳酸桿菌屬微生物能夠成為優(yōu)勢(shì)物種保證發(fā)酵體系穩(wěn)定的原因之一。

2.5 細(xì)菌代謝通路預(yù)測(cè)分析

基于16S擴(kuò)增子高通量測(cè)序數(shù)據(jù)，利用軟件PICRUSt2對(duì)細(xì)菌群落微生物進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，如圖8所示，結(jié)果表明,該調(diào)味白酒發(fā)酵過程中，在KEGG(Kyoto Encyloedia of Genes and Genomes)通路水平1上的分布相對(duì)穩(wěn)定，其中，涉及代謝、遺傳信息處理和環(huán)境信號(hào)處理的通路比例，分別為(77.44±0.81)%、(9.79±1.52)%和(5.58±0.26)%；可以看出，代謝途徑豐度占比最大，因此進(jìn)一步對(duì)代謝功能進(jìn)行分析，如圖9所示，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，細(xì)菌微生物群落結(jié)構(gòu)演替使得特定代謝功能豐度顯著變化，氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝、碳水化合物運(yùn)輸和代謝以及核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝功能豐度呈現(xiàn)不斷增長的趨勢(shì)，且豐度最大，可能由于調(diào)味白酒采用高氮配料工藝，蛋白質(zhì)含量豐富，使能利用含氮化合物的微生物大量繁殖，相應(yīng)的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝以及核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝功能豐度呈現(xiàn)增長趨勢(shì)。其中，乳酸菌對(duì)糊精、D-果糖、D-半乳糖、D-麥芽糖、纖維二糖、D-甘露糖等多種糖類物質(zhì)的利用較強(qiáng)[17]，而Bacillus可以合成淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶并催化產(chǎn)生各種風(fēng)味物質(zhì)的前體[18]，Lactobacillus對(duì)Bacillus的取代使得細(xì)菌類微生物在發(fā)酵后期對(duì)碳源(淀粉、蔗糖、果糖、甘露糖和半乳糖)的分解利用加強(qiáng)，從而碳水化合物運(yùn)輸和代謝豐度也逐漸提高。相反，輔酶轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝、無機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝、次生代謝物生物合成、運(yùn)輸和分解代謝豐度呈現(xiàn)出不斷減小的趨勢(shì)，可能由于微生物多樣性逐漸降低，發(fā)酵環(huán)境中微生物的代謝途徑多樣性也逐漸降低，使得輔酶、無機(jī)離子以及次級(jí)代謝物主要為優(yōu)勢(shì)微生物所利用，從而豐度不斷減小。而脂質(zhì)在白酒釀造過程中利用程度低，故其豐度在整個(gè)發(fā)酵過程中相對(duì)穩(wěn)定。

T-出窖上層糟醅；M-出窖中層糟醅；B-出窖底層糟醅圖8 調(diào)味白酒發(fā)酵過程中細(xì)菌微生物群落KEGG通路分布Fig.8 Distribution of KEGG pathways of bacterial community during roasted flavoring Baijiu fermentation

T-出窖上層糟醅；M-出窖中層糟醅；B-出窖底層糟醅圖9 調(diào)味白酒發(fā)酵過程中細(xì)菌微生物群落主要COG代謝功能分布Fig.9 Distribution of main COG metabolites in the bacterial community during flavoring Baijiu fermentation

3 結(jié)論與討論

本文采用高通量測(cè)序技術(shù)和常規(guī)理化分析等方法，對(duì)調(diào)味白酒發(fā)酵過程中微生物群落時(shí)空演示特征及其與理化指標(biāo)間相關(guān)性以及細(xì)菌代謝功能進(jìn)行分析。結(jié)果表明，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，不同層糟醅微生物之間豐度和多樣性雖存在差異，但并不顯著，而在發(fā)酵過程中存在顯著差異；細(xì)菌群落的豐富度和多樣性先增加后逐漸減少，真菌群落則先增加并逐漸趨于穩(wěn)定；其中，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌主要有Lactobacillus、Acetobacter、Bacillus等，且Lactobacillus在發(fā)酵第14天后占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)(>94%)；優(yōu)勢(shì)真菌主要有Issatchenkia、Byssochlamys、Pichia、Kazachstania、Thermoascus等，且在整個(gè)發(fā)酵過程中，Lactobacillus對(duì)真菌的抑制較弱，使得酵母屬微生物不受限制的正常代謝，這或許是調(diào)味酒高酯的原因之一。相關(guān)性分析顯示，淀粉和還原糖含量與Acetobacter、Bacillus、Byssochlamys等呈顯著正相關(guān)，與Trichomerium、Pichia等呈負(fù)相關(guān)。酸度和水分與Lactobacillus、Issatchenkia、Pichia等呈正相關(guān)，與Acetobacter、Bacillus、Byssochlamys、Monascus等呈負(fù)相關(guān)；這與李小龍[19]的研究趨于一致。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，細(xì)菌在KEGG通路水平1上的分布相對(duì)穩(wěn)定，涉及代謝、遺傳信息處理和環(huán)境信號(hào)處理的通路比例分別為(77.44±0.81)%、(9.79±1.52)%和(5.58±0.26)%；與芝麻香型白酒發(fā)酵相比，該調(diào)味酒在發(fā)酵前期細(xì)菌多樣性更豐富，代謝通路豐度更大，且以氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝、碳水化合物運(yùn)輸和代謝以及核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝為主，并隨發(fā)酵時(shí)間不斷增加，這與李小龍[19]對(duì)芝麻香型白酒代謝路徑的研究結(jié)果相反，推測(cè)是因?yàn)榕淞虾凸に嚥煌?，該調(diào)味酒在發(fā)酵過程中能更多保留產(chǎn)淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶和脫氫酶等的微生物，從而更有利于美拉德反應(yīng)。