楊貴，張宿義,*，趙金松,4，張立強，楊艷，宋攀，冉茂芳，薛江林，林慧

1(四川輕化工大學 生物工程學院，四川 宜賓，644000)2(瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州，646000)3(國家固態(tài)釀造工程技術研究中心，四川 瀘州，646000)4(四川省酒業(yè)集團有限責任公司川酒研究院，四川 成都，610000)

隨著我國經濟的快速發(fā)展，人民的生活水平逐漸提高，對白酒口味的需求越來越多元化，所以調味白酒一直是行業(yè)內研究的重點。調味白酒一般采用特殊工藝生產，因含有較多特定的香味成分及擁有獨特風味，在酒體設計和勾調過程中，可以明顯提高和彌補酒體在某些方面的不足，提升基礎酒的香味和口感；其特點在于添加量少，起到畫龍點睛的作用。魏志陽等[1]利用篩選自老白干酒醅中的一株高產乳酸干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)發(fā)酵制得乳酸發(fā)酵液，通過南極假絲酵母(Candidaantarctic)脂肪酶B催化乳酸發(fā)酵液與酒尾合成乳酸乙酯，并通過單因素試驗和正交試驗對其催化工藝進行了優(yōu)化，最后通過蒸餾濃縮得到乳酸乙酯調味白酒。吳軒德等[2]在釀酒酵母轉化L-苯丙氨酸合成β-苯乙醇的基礎上，通過紫外誘變育種、好氧發(fā)酵與補料厭氧發(fā)酵的二步法工藝來研制β-苯乙醇調味白酒。目前針對調味酒的研究更多是在工藝方面，對釀造機理方面的研究相對較少；本研究是在創(chuàng)新設計并已成熟運用的調味白酒釀造工藝基礎上，通過高通量測序揭示該發(fā)酵過程微生物群落演替的時空特征，并通過多元統(tǒng)計分析，解釋微生物與理化指標的相關性以及微生物代謝間的差異，為進一步探究調味白酒的釀造機理和提高發(fā)酵過程的可控性提供依據，為滿足消費者多元化需求以及白酒行業(yè)高質量發(fā)展奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

主要材料：某酒廠調味白酒糟醅；其釀造工藝路線如圖1所示。

圖1 調味酒釀造工藝流程圖Fig.1 Brewing process flow chart of flavoring Baijiu

該調味白酒釀造工藝是以濃香型白酒生產工藝為基礎，結合其他香型白酒生產工藝，創(chuàng)新設計的一套調味白酒釀造工藝，采用了續(xù)糟配料、復合配料、高溫堆積、高溫流酒、混蒸混燒、分層蒸餾、長期貯存等工藝，釀造出具有總酯含量高、口感甜凈，有明顯焦糊香味的特殊調味白酒。

試驗試劑：CTAB Buffer、V(氯仿)∶V(異戊醇)=24∶1、V(酚)∶V(氯仿)∶V(異戊醇)=25∶24∶1、聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)6000、氯化鈉、無水乙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、葡萄糖、鹽酸、五水硫酸銅、酒石酸鉀(均為分析純)，聚合化工。

1.2 儀器與設備

TL2010S中通量組織研磨儀，北京鼎昊源科技有限公司；ND1000微量紫外可見分光光度計，Nano drop；MLS-375L全自動滅菌鍋，日本日立公司；DHG-9245A鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；DL-1 電爐，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；5804R高速冷凍離心機，德國艾本德公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 取樣

同時跟蹤相鄰3口大小(3.2 m×2.4 m×1.8 m)一樣的窖池，從入窖后，每7 d取1次樣，共發(fā)酵35 d。每次從糟醅的上層、中層和下層分別取樣，將3口窖池取自同一層次的樣品置于無菌取樣袋中立即密封混合均勻，再將其分為2份，1份保存在-20 ℃用于理化特性檢測，1份保存在-80 ℃用于基因組DNA的提取。

1.3.2 理化指標檢測

理化指標檢測參照《瀘型酒技藝大全》[3]。

1.3.3 DNA提取方法

稱取10 g糟醅，用十二萬基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)法提取糟醅中微生物的基因組DNA[4]?；蚪MDNA送往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行高通量測序，測序數據在美吉生物云平臺(https://icloud.majorbio.com/)進行處理。

1.3.4 數據分析

根據高通量擴增子測序數據，利用R-3.3.1 (stat)以及Kruskal-Wallis秩和檢驗，對α多樣性指數組間差異檢驗分析。利用R-3.3.1 (vegan)進行冗余分析(redundancy analysis，RDA)，分析理化指標與微生物群落間的相關性，并計算糟醅理化指標與微生物群落物種分布的解釋率。利用R-3.3.1 (stat)、python-2.7 (stat) 計算物種-理化指標之間的相關性，構建出物種相關性網絡圖。利用PICRUSt2 (v2.2.0-b) 對標記基因(16S/ITS)序列進行功能豐度預測，獲得每個樣本中對應的功能信息和豐度信息。

2 結果與分析

2.1 理化指標分析

發(fā)酵過程中，糟醅的理化性質能夠直觀地體現出當時糟醅的發(fā)酵情況，通過動態(tài)監(jiān)測發(fā)酵過程中糟醅的理化性質，進一步解釋調味白酒發(fā)酵過程中的發(fā)酵機理。糟醅理化指標均以絕干狀態(tài)計算(圖2)。

a-水分含量；b-酸度；c-還原糖含量；d-淀粉含量圖2 調味白酒發(fā)酵過程中糟醅理化性質Fig.2 Physicochemical properties of fermented grains during flavoring Baijiu fermentation

如圖2所示，在發(fā)酵過程中，微生物不斷消耗糟醅中的淀粉、還原糖等，產生水分，使得水分含量呈現增長趨勢(48.12±0.4)%～(56.82±0.45)%。酸是酒體中重要的風味物質，能夠起到提味的作用，其主要由微生物代謝產生,隨著發(fā)酵進行，糟醅酸度呈現逐漸增加趨勢,由(3.17±0.06) mmol/10g增加至(12.8±0.04) mmol/10g，中下層糟醅酸度較高，可能是發(fā)酵過程中黃水向下滲透所致，酸度較高同時也會影響微生物的代謝活動及酶的活性等。還原糖[(1±0.08)%-(6.8±0.06)%]和淀粉含量[(27.8±0.98)%-(41.99±0.35)%]總體都呈現下降趨勢，隨著發(fā)酵的進行，淀粉被酶和有機酸逐漸分解為微生物可利用的糖；在發(fā)酵前期，因上層糟醅中含氧較高，微生物繁殖能力強，對糖類的消耗巨大，發(fā)酵前期上層糟醅淀粉和還原糖含量快速下降。由于水分向下滲透，將一部分淀粉和還原糖帶到中下層，可能導致發(fā)酵前期中下層糟醅中的淀粉和還原糖的含量略有上升且下降緩慢，后期則在微生物的利用下迅速下降。

2.2 微生物多樣性分析

如表1所示，隨著發(fā)酵時間的增加，細菌群落的豐富度和多樣性先增加后減少，而真菌群落的豐富度和多樣性先增加后趨于穩(wěn)定。

對Chao指數和Shannon指數進行差異性檢驗，如圖3所示，在整個發(fā)酵期間，不同層糟醅微生物之間豐度和多樣性無顯著差異(P>0.05)；而在發(fā)酵過程中存在顯著差異，如圖4-a所示，細菌在0～7 d豐富度變化明顯(P>0.05)，第7天之后的樣本間豐富度變化差異顯著(P<0.05)，可能是微生物在0～7 d 在大量繁殖，使得豐富度增加，但由于窖池內酸度和酒精度不斷增加，溶氧不斷減少，環(huán)境極端性增強，窖池內微生物群落結構隨之發(fā)生轉變，導致微生物群落豐富度在第7天之后逐漸降低，并趨于穩(wěn)定；與此同時，糟醅中微生物多樣性也會隨著微生物豐富度變化而變化。相反，在0～14 d，真菌微生物豐富度和多樣性均呈現迅速增加的趨勢，推測是真核微生物中，優(yōu)勢微生物大多是由酵母屬、霉菌屬等兼性厭氧或好氧微生物組成，從而使得在發(fā)酵前期有氧條件下能夠迅速繁殖的同時，還能夠在發(fā)酵后期厭氧環(huán)境下保持較高的豐富度和多樣性。微生物群落豐富度和多樣性在整個發(fā)酵過程中的變化情況與發(fā)酵溫度前緩、中挺、后緩落遙相呼應，這也進一步證明在白酒釀造過程中，在不同發(fā)酵時間下微生物的代謝繁殖與溫度、微生態(tài)環(huán)境變化有著一定的相關性。

a-細菌Chao指數Kruskal-Wallis秩和檢驗；b-細菌Shannon指數Kruskal-Wallis秩和檢驗；c-真菌Chao指數Kruskal-Wallis秩和檢驗；d-真菌Shannon指數Kruskal-Wallis秩和檢驗圖4 不同發(fā)酵時間的糟醅微生物α多樣性Chao、Shannon指數Kruskal-Wallis秩和檢驗Fig.4 Microbes in fermented grains at different fermentation times α diversity Chao, Shannon index Kruskal-Wallis H test注：“*”代表顯著性差異，*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001(下同)

2.3 微生物群落分布特征分析

2.3.1 細菌微生物群落在屬水平上的組成

基于16S rRNA高通量測序的序列數據分析表明，在發(fā)酵過程糟醅樣品中細菌分布在28個門、68個綱、159個目、276個科、520個屬、747個種以及1 617個ASV(amplicon sequence variants)集。這些細菌主要分布在厚壁菌門[Firmicutes(80%)]、變形菌門[Proteobacteria(16.33%)]、擬桿菌門[Bacteroidota(1.05%)]等。根據高通量測序結果，結合ASVs聚類分析結果和研究需求，將細菌微生物群落在屬水平上相對豐度較大的菌屬進行統(tǒng)計分析(圖5)。

由圖5所示，發(fā)酵第0天，醋桿菌屬[Acetobacter(55.3%)]處于優(yōu)勢地位，發(fā)酵第7天，Acetobacter(9.11%)的優(yōu)勢地位被乳酸桿菌屬[Lactobacillus(53.7%)]所取代；除此之外，優(yōu)勢物種還包括芽孢桿菌屬(Bacillus)、高溫放線菌屬(Thermoactinomyces)、氨基桿菌屬(Aminobacterium)、氫孢菌屬(Hydrogenispora)、克羅彭斯特菌屬(Kroppenstedtia)、產己酸菌屬(Caproiciproducens)、紅球菌屬(Rhodococcus)、互營乙酸氧化菌屬(Syntrophaceticus)等，這些微生物主要代謝產生乙醇、乙酸、乳酸、己酸等白酒中重要的風味物質及其風味前體物質[5-6]。值得注意的是，在發(fā)酵0～14 d，優(yōu)勢物種主要分布在Proteobacteria和Firmicutes。Proteobacteria類微生物一般都具有較強的固氮能力[7]，發(fā)酵0～14 d，其豐度從82%降低至1.7%；在該門類中豐度最大的是Acetobacter，因溶氧量逐漸降低，豐度也從56%逐漸降低至1.1%。相反Firmicutes豐度由12%增加至97%；隨著發(fā)酵的進行，在發(fā)酵0～7 d高含氧量條件下，芽孢桿菌大量繁殖，豐度由2.9%增加至5.8%，后因糟醅中溶氧量減少，豐度隨之逐漸降低，并最終穩(wěn)定在0.038%。在白酒釀造過程中，芽孢桿菌不僅能夠通過自身代謝直接產生風味物質，還能夠產生風味物質的前體物質，為其他微生物協(xié)同發(fā)酵和美拉德反應提供物質基礎[8]。特別是Aminobacterium、Hydrogenispora、Caproiciproducens、Rhodococcus、Syntrophaceticus等在發(fā)酵第14天后才出現；有研究表明，Thermoactinomyces可產生耐高溫α淀粉酶、絲氨酸蛋白酶、脫氫酶、多酚氧化酶和脲酶等[9]；Aminobacterium屬于Synergistetes門Synergistaceae科，是典型厭氧專性氨基酸降解細菌，在代謝氨基酸的同時能夠產生脂肪酸[10]，該菌在發(fā)酵后期出現，表明該調味酒在發(fā)酵后期產生了大量的氨基酸；Caproiciproducens是一類代謝產生氫氣、丁酸和己酸的細菌，可提供己酸乙酯的前體物質己酸[6]，Syntrophaceticus能夠降解長鏈脂肪酸或丁酸產生氫氣、乙酸、丙酸[11]。Lactobacillus是整個發(fā)酵過程中的優(yōu)勢物種，在發(fā)酵0～14 d，豐度從0.5%增加至94%，并最終穩(wěn)定在95%以上至發(fā)酵結束；這是由于Lactobacillus是一類厭氧微生物，環(huán)境適應性強，具有較強的代謝碳水化合物產酸的能力，在白酒釀造過程中能夠為其他微生物提供碳源以及形成風味前體物質，是白酒釀造過程中不可或缺的一類微生物。

2.3.2 真菌微生物群落在屬水平上的組成

相對于細菌而言，真菌群落變化較為單一，分布在7個門、22個綱、41個目、100個科、172個屬、264個種以及507個ASV集。其主要分布在子囊菌門[Ascomycota(75%)]和擔子菌門[Basidiomycota(2.23%)]等(圖6)。

a-真菌屬水平豐度圖；b-真菌屬水平圈圖圖6 糟醅發(fā)酵過程中真菌屬水平豐度圖和圈圖Fig.6 Bar and circos diagram of fungi genus in fermented grains during fermentation

如圖6所示，真菌優(yōu)勢微生物包括伊薩酵母屬(Issatchenkia)、絲衣霉屬(Byssochlamys)、畢赤酵母屬(Pichia)、哈薩克斯坦酵母屬(Kazachstania)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、曲霉菌屬(Aspergillus)、節(jié)擔菌屬(Wallemia)、耐干霉菌屬(Xeromyces)、酵母菌屬(Saccharomyces)等。隨著發(fā)酵的進行，優(yōu)勢真菌Byssochlamys、Aspergillus和Kazachstania逐漸變?yōu)榉莾?yōu)勢真菌，Issatchenkia和Pichia逐漸變?yōu)閮?yōu)勢真菌，且豐度在整個發(fā)酵過程中呈線性變化趨勢，表明Lactobacillus對該發(fā)酵體系中的真菌抑制作用較弱，這也許是調味酒高酯的重要原因。在發(fā)酵第0天，Byssochlamys(59%)和Aspergillus(4.1%)處于絕對的優(yōu)勢地位，為淀粉酶和糖化酶的主要生產者，是發(fā)酵前期淀粉含量迅速下降、還原糖含量增加的主要原因；隨著發(fā)酵的進行，糟醅中溶氧量逐漸降低，酸度逐漸增加，其豐度逐漸降低，至發(fā)酵結束，兩者豐度都僅占1.2%；研究表明，曲霉屬在發(fā)酵過程中能夠分解原輔料中的淀粉和蛋白質，代謝產生大量的還原糖和氨基酸，其代謝產物是構成酒體風味與口感的重要物質基礎[12]。在0～7 d，環(huán)境極端性較低時，Kazachstania大量繁殖，豐度從0.42%增加至25%，在發(fā)酵后期緩慢降低，至發(fā)酵結束豐度為3.7%；譚壹[13]研究發(fā)現，Kazachstania屬中Kazachstaniasp.為濃香型白酒優(yōu)勢真菌微生物，且為好氧微生物[14]；該調味酒工藝是在濃香型白酒工藝基礎上創(chuàng)新設計，是該調味白酒中Kazachstania的主要來源，故推測發(fā)酵后期溶氧量低是Kazachstania豐度降低的主要原因。Issatchenkia和Pichia因具有一定的嗜酸性和乙醇耐受能力強[15]的特點，故豐度在發(fā)酵過程中不斷增加；同時，在發(fā)酵前期，與乳酸桿菌屬類微生物還存在爭奪營養(yǎng)物質的競爭關系，由于乳酸桿菌的糖代謝能力強于酵母菌類微生物，故其生長速率遠大于酵母菌。值得注意的是，Thermoascus在發(fā)酵后期的豐度激增，該類真菌可以分泌β-木聚糖酶、堿性耐熱過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、角質酶等酶類，可將植物細胞壁中木聚糖轉化成木糖等，并具有產花果香類物質的能力，醇、酮和呋喃類是其主要的呈香載體物質，同時還能生成散囊菌特有的“菌花香”，所以該類菌可作為重要的產香功能菌[16]。

2.4 微生物群落結構和環(huán)境因素關聯(lián)分析

為更好地反映微生物群落與糟醅理化性質之間的關系，本文通過R-3.3.1和python-2.7軟件對其進行RDA，并基于Sperman相關性構建雙因素相關性網絡圖(圖7)。

a-細菌RDA；b-細菌基于Sperman相關性的微生物-理化指標共現網絡；c-真菌RDA；d-真菌基于Sperman相關性的微生物-理化指標共現網絡圖7 發(fā)酵過程中微生物與理化指標相關性分析Fig.7 Correlation analysis between microbes and physical and chemical indexes in fermentation process注：圖b、d中紅色和綠色分別代表正和負相互作用

根據RDA結果，糟醅理化性質對細菌和真菌群落微生物的分布解釋率分別為78.42%和46.01%(圖7-a、圖7-c)，說明糟醅理化性質與細菌群落分布有較高的相關性，與真菌群落分布有一定的相關性。同時，根據微生物與理化雙因子相關性網絡圖(圖7-b、圖7-d)，糟醅理化因子與大多數細菌和部分的真菌微生物都存在顯著的相互作用。對細菌而言，淀粉和還原糖含量與Acetobacter、Bacillus等呈顯著正相關；水分和酸度與Lactobacillus等呈顯著正相關(圖7-b)。對真菌而言，相關性網絡結構相對簡單，淀粉和還原糖含量與Byssochlamys、Monascus等呈正相關。水分和酸度與Issatchenkia、Pichia等呈正相關，與Byssochlamys、Monascus等呈負相關(圖7-d)。酸度與第一優(yōu)勢微生物呈現出較強的正相關性，與其他多數微生物都呈現負相關性。而這主要是由于優(yōu)勢微生物在發(fā)酵過程中能夠大量代謝產生乳酸、乙酸，從而抑制耐酸能力差的微生物生長繁殖，其次，Lactobacillus的代謝產物雙乙酰，對很多腐敗菌和致病菌都有抑制作用，雙乙?？赏ㄟ^革蘭氏陰性菌精氨酸的結合蛋白反應，從而干擾精氨酸的利用，抑制革蘭氏陰性菌的生長，這也可能是乳酸桿菌屬微生物能夠成為優(yōu)勢物種保證發(fā)酵體系穩(wěn)定的原因之一。

2.5 細菌代謝通路預測分析

基于16S擴增子高通量測序數據，利用軟件PICRUSt2對細菌群落微生物進行功能預測，如圖8所示，結果表明,該調味白酒發(fā)酵過程中，在KEGG(Kyoto Encyloedia of Genes and Genomes)通路水平1上的分布相對穩(wěn)定，其中，涉及代謝、遺傳信息處理和環(huán)境信號處理的通路比例，分別為(77.44±0.81)%、(9.79±1.52)%和(5.58±0.26)%；可以看出，代謝途徑豐度占比最大，因此進一步對代謝功能進行分析，如圖9所示，隨著發(fā)酵的進行，細菌微生物群落結構演替使得特定代謝功能豐度顯著變化，氨基酸轉運與代謝、碳水化合物運輸和代謝以及核苷酸轉運與代謝功能豐度呈現不斷增長的趨勢，且豐度最大，可能由于調味白酒采用高氮配料工藝，蛋白質含量豐富，使能利用含氮化合物的微生物大量繁殖，相應的氨基酸轉運與代謝以及核苷酸轉運與代謝功能豐度呈現增長趨勢。其中，乳酸菌對糊精、D-果糖、D-半乳糖、D-麥芽糖、纖維二糖、D-甘露糖等多種糖類物質的利用較強[17]，而Bacillus可以合成淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶并催化產生各種風味物質的前體[18]，Lactobacillus對Bacillus的取代使得細菌類微生物在發(fā)酵后期對碳源(淀粉、蔗糖、果糖、甘露糖和半乳糖)的分解利用加強，從而碳水化合物運輸和代謝豐度也逐漸提高。相反，輔酶轉運與代謝、無機離子轉運與代謝、次生代謝物生物合成、運輸和分解代謝豐度呈現出不斷減小的趨勢，可能由于微生物多樣性逐漸降低，發(fā)酵環(huán)境中微生物的代謝途徑多樣性也逐漸降低，使得輔酶、無機離子以及次級代謝物主要為優(yōu)勢微生物所利用，從而豐度不斷減小。而脂質在白酒釀造過程中利用程度低，故其豐度在整個發(fā)酵過程中相對穩(wěn)定。

T-出窖上層糟醅；M-出窖中層糟醅；B-出窖底層糟醅圖8 調味白酒發(fā)酵過程中細菌微生物群落KEGG通路分布Fig.8 Distribution of KEGG pathways of bacterial community during roasted flavoring Baijiu fermentation

T-出窖上層糟醅；M-出窖中層糟醅；B-出窖底層糟醅圖9 調味白酒發(fā)酵過程中細菌微生物群落主要COG代謝功能分布Fig.9 Distribution of main COG metabolites in the bacterial community during flavoring Baijiu fermentation

3 結論與討論

本文采用高通量測序技術和常規(guī)理化分析等方法，對調味白酒發(fā)酵過程中微生物群落時空演示特征及其與理化指標間相關性以及細菌代謝功能進行分析。結果表明，隨著發(fā)酵的進行，不同層糟醅微生物之間豐度和多樣性雖存在差異，但并不顯著，而在發(fā)酵過程中存在顯著差異；細菌群落的豐富度和多樣性先增加后逐漸減少，真菌群落則先增加并逐漸趨于穩(wěn)定；其中，優(yōu)勢細菌主要有Lactobacillus、Acetobacter、Bacillus等，且Lactobacillus在發(fā)酵第14天后占據絕對優(yōu)勢(>94%)；優(yōu)勢真菌主要有Issatchenkia、Byssochlamys、Pichia、Kazachstania、Thermoascus等，且在整個發(fā)酵過程中，Lactobacillus對真菌的抑制較弱，使得酵母屬微生物不受限制的正常代謝，這或許是調味酒高酯的原因之一。相關性分析顯示，淀粉和還原糖含量與Acetobacter、Bacillus、Byssochlamys等呈顯著正相關，與Trichomerium、Pichia等呈負相關。酸度和水分與Lactobacillus、Issatchenkia、Pichia等呈正相關，與Acetobacter、Bacillus、Byssochlamys、Monascus等呈負相關；這與李小龍[19]的研究趨于一致。隨著發(fā)酵的進行，細菌在KEGG通路水平1上的分布相對穩(wěn)定，涉及代謝、遺傳信息處理和環(huán)境信號處理的通路比例分別為(77.44±0.81)%、(9.79±1.52)%和(5.58±0.26)%；與芝麻香型白酒發(fā)酵相比，該調味酒在發(fā)酵前期細菌多樣性更豐富，代謝通路豐度更大，且以氨基酸轉運與代謝、碳水化合物運輸和代謝以及核苷酸轉運與代謝為主，并隨發(fā)酵時間不斷增加，這與李小龍[19]對芝麻香型白酒代謝路徑的研究結果相反，推測是因為配料和工藝不同，該調味酒在發(fā)酵過程中能更多保留產淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶和脫氫酶等的微生物，從而更有利于美拉德反應。