劉玲紅，許國(guó)娟，程榮，陳凱，趙安心*

1(武漢淡雅香生物科技有限公司，湖北 武漢，430034)2(湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院，湖北 武漢，430068)

隨著色素用途的多元化發(fā)展，單一色素的性能可能不能滿足實(shí)際需求，多重色素復(fù)合使用成為發(fā)展趨勢(shì)之一，可利用色素間優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)的原則構(gòu)建多色素共混體系[1]。天然色素資源豐富、無(wú)毒無(wú)害，被廣泛應(yīng)用于生活實(shí)踐中。在智能標(biāo)簽比色指示劑的染料的研究中，研究人員利用姜黃素的抗氧化性彌補(bǔ)花青素的不穩(wěn)定性，同時(shí)以花青素的廣變色區(qū)間補(bǔ)充姜黃素的變色局限范圍[2]；禽蛋蛋黃的顏色是評(píng)價(jià)其質(zhì)量的重要感官指標(biāo)，在飼料中添加1種色素只能使蛋黃顏色偏向該色值，往往2種色素配合使用，如萬(wàn)壽菊提取物與辣椒紅同時(shí)使用[3]，能取得更好的效果。朱穎等[4]在蛋雞日糧中添加1∶1的橙黃素和辣椒紅，顯著提高了蛋黃中葉黃素的含量和色度。

天然梔子黃色素是從茜草科植物梔子(Gardeniajasminnoides)的果實(shí)中提取精致的天然黃色食用色素物質(zhì)，是一種混合物，主要成分為類(lèi)胡蘿卜素的藏花素和藏花酸，環(huán)烯醚萜甙類(lèi)的梔子甙、黃酮和綠原酸[5-7](圖1-a)。其中，藏花素和藏花酸是主要成分，藏花素是藏花酸的龍膽二糖酯，分子上的多個(gè)共軛雙鍵賦予梔子黃以黃色[7]。天然梔子黃色素具有著色力強(qiáng)、色澤鮮艷、色調(diào)自然柔和、穩(wěn)定性較好、溶解性強(qiáng)的特點(diǎn)，對(duì)人體安全無(wú)毒，且極易被人體吸收，轉(zhuǎn)化為維生素A，與合成色素比較，著色自然新鮮，尤其對(duì)蛋白和淀粉染色性好，無(wú)異味。梔子黃的分子結(jié)構(gòu)中存在多個(gè)共軛雙鍵，是該色素的發(fā)色基團(tuán)，也是發(fā)生不穩(wěn)定的來(lái)源[7]。梔子黃分子容易受環(huán)境溫度、光照、pH等因素影響而氧化，發(fā)生變色，直接影響了該色素的實(shí)際應(yīng)用。

姜黃素是從姜科植物姜黃的根莖中提取出的一種多酚類(lèi)活性物質(zhì)(圖1-b)，顏色呈明亮黃色，粉末為橙黃結(jié)晶狀，著色力強(qiáng)，安全無(wú)毒，具有抗氧化、抗菌、消炎、抗癌等功效，被廣泛用于有色酒類(lèi)、甜品、飲料及保健食品中(GB 1886.76—2015)[8]。據(jù)報(bào)道，姜黃易受堿性、光照、熱、氧氣、金屬離子等條件影響而降解，減弱明亮的色澤，這些都限制了姜黃在生產(chǎn)生活中的應(yīng)用[9-10]。

本研究以梔子黃與姜黃按照不同配比共混制備色素溶液，采用不同的光照、溫度、pH值、氧化劑、還原劑、金屬離子等條件來(lái)處理此共混色素，考察梔子黃/姜黃共混色素的穩(wěn)定性，探究2種色素在共混體系中對(duì)環(huán)境因素的響應(yīng)，及兩者間可能的分子相互作用。本文將為日用化工、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域更好地開(kāi)發(fā)利用共混色素提供一定的理論依據(jù)。

a-梔子黃；b-姜黃素圖1 梔子黃和姜黃素分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecular structures of gardenia yellow and curcumin

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

梔子黃色素(食品級(jí))，武漢綠孚生物工程有限公司；姜黃素(食品級(jí))，河北昱華科技有限公司；氫氧化鈉、磷酸、亞硫酸鈉、過(guò)氧化氫、氯化鎂、氯化鐵、氯化鈣、氯化鋰(均為分析純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA3204B電子天平，上海天美天平儀器有限公司；HH-2恒溫水浴鍋，國(guó)華電器有限公司；UV-5200紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；SL1-PHSJ-4F酸度計(jì)，北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司；GZX-250光照培養(yǎng)箱，常州國(guó)宇儀器有限公司；DHP-9052恒溫干燥箱，上海精宏設(shè)備有限公司；Vertex 70傅立葉變換紅外光譜儀，德國(guó)布魯克有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 梔子黃/姜黃共混色素的配制和吸收波長(zhǎng)檢測(cè)

參照國(guó)標(biāo)GB 7912—2010的方法，稱(chēng)取質(zhì)量比分別為1∶1、3∶2、4∶1的梔子黃和姜黃混合物，總質(zhì)量為0.5 g，置于500 mL容量瓶中定容，搖勻靜置得到1 mg/mL共混色素標(biāo)準(zhǔn)溶液，以蒸餾水作空白，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)該樣品溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)。

1.3.2 傅立葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectrometry，F(xiàn)TIR)檢測(cè)

配制純梔子黃溶液、純姜黃溶液以及3種配比的共混溶液，用移液槍取少量溶液分別涂布于溴化鉀晶片上，室溫下自然陰干成薄膜狀，盡量避免其他環(huán)境因子對(duì)色素的影響，室溫下運(yùn)用FTIR在500～4 000 cm-1掃描，分辨率為4 cm-1。

1.3.3 環(huán)境因子對(duì)共混色素的穩(wěn)定性影響

1.3.3.1 不同光照類(lèi)型的影響

分別取3種配比的共混色素溶液3 mL，置于太陽(yáng)光、日光燈(GZX-250光照培養(yǎng)箱)和黑暗條件下，分別在0、2、4、6、8 h測(cè)定吸光度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

LED單色光處理[11]：自制60 cm×60 cm×60 cm可封閉不透光紙箱，在紙箱內(nèi)測(cè)頂部分別安裝藍(lán)光(480 nm)、綠光(540 nm)、紅光(660 nm)的LED單色光燈帶；將共混色素溶液添加到24孔板，用單色光照射處理，分別在0、2、4、6、8 h取樣測(cè)定吸光度，每個(gè)處理3個(gè)平行重復(fù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3.2 不同溫度的影響

分別取3種配比的共混色素溶液3 mL，置于玻璃試管中，避光分別放入4、20 ℃的冰箱以及60、100 ℃ 的水浴條件下處理，分別在0、2、4、6、8 h取樣測(cè)定吸光度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3.3 不同pH值的影響

稱(chēng)取3種配比的共混色素各0.1 g，用pH為2、4、6、7、8、10、12的氫氧化鈉/磷酸緩沖液定容至100 mL，搖勻靜置，以蒸餾水定容的溶液為對(duì)照。處理6 h后測(cè)定溶液吸光度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3.4 不同濃度氧化劑、還原劑的影響

分別以體積分?jǐn)?shù)0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的H2O2溶液和質(zhì)量濃度為0、2、4、6、8、10 μg/mL的Na2SO3溶液將3種配比的共混色素0.1 g 定容至100 mL，搖勻靜置，處理6 h后測(cè)定溶液吸光度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3.5 不同濃度金屬離子的影響

以質(zhì)量濃度為0、1、2、3、4、5 μg/mL的氯化鈣、氯化鎂、氯化鐵、氯化鋰溶液分別將3種配比的共混色素0.1 g定容至100 mL，搖勻靜置，處理6 h后測(cè)定溶液吸光度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Microsoft Excel 2019和Origin 9.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和作圖，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(standard error, SE)表示數(shù)據(jù)點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 梔子黃/姜黃共混色素體系特征吸收波長(zhǎng)檢測(cè)

如圖2所示，在150～500 nm進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，1∶1、3∶2、4∶1三種配比的梔子黃/姜黃共混色素溶液均在430 nm處出現(xiàn)特征吸收峰，與單一色素的最大吸收波長(zhǎng)接近。梔子黃水溶液的特征吸收峰在440 nm，姜黃水溶液的特征吸收峰在425 nm，參考GB 7912—2010[2]和GB 1886.76—2015[8]。本實(shí)驗(yàn)采用430 nm作為共混色素體系的最大吸收波長(zhǎng)進(jìn)行后續(xù)穩(wěn)定性檢測(cè)。圖2可見(jiàn)1∶1配比的共混溶液的A430 nm最大，表明姜黃占比越大可能對(duì)吸光度的影響越大，酚羥基的增加有助于色素體系的加強(qiáng)，對(duì)吸光度的貢獻(xiàn)更大，共混體系中姜黃分子的主導(dǎo)作用可能大于梔子黃分子。

圖2 梔子黃/姜黃共混色素吸收波長(zhǎng)圖譜Fig.2 Absorption spectrum of gardenia yellow/curcumin blend pigments

2.2 FTIR檢測(cè)與體系分子互作

結(jié)合紫外吸收波長(zhǎng)的圖譜結(jié)果，通常單一的梔子黃色素溶液經(jīng)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)全波長(zhǎng)掃描會(huì)出現(xiàn)3個(gè)典型的特征吸收峰，對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)為236、326、442 nm，442 nm為主要成分藏花素和藏花酸的特征吸收峰[7]；單一的姜黃素溶液的特征吸收峰對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)為425 nm。本研究3種配比溶液僅在430 nm處出現(xiàn)吸收峰，沒(méi)有檢測(cè)到多個(gè)吸收峰，推測(cè)該共混體系分子間不再是單一組分游離狀態(tài)，進(jìn)一步表明梔子黃與姜黃形成了復(fù)合體系。

圖3 梔子黃、姜黃及共混色素FTIR圖Fig.3 FTIR spectrum of gardenia yellow, curcumin and blend pigments

2.3 不同環(huán)境因子對(duì)梔子黃/姜黃共混體系的影響

2.3.1 不同光照類(lèi)型的影響

圖4顯示，3種配比的共混色素溶液受太陽(yáng)光、日光燈和避光處理后，體系吸光度逐漸減小，色素有一定損失。日光燈和避光處理對(duì)體系影響較小，太陽(yáng)光照射的影響比較顯著，表明色素體系對(duì)太陽(yáng)光的穩(wěn)定性較差。蘿卜紅色素、藍(lán)莓色素等，具有較好的耐光性[14-15]，與該共混體系有一定差別；與前人研究結(jié)果類(lèi)似，本研究中太陽(yáng)光處理8 h后體系色素?fù)p失率約18%，據(jù)報(bào)道，梔子黃溶液經(jīng)太陽(yáng)光或日光燈照射8～12 h，色素?fù)p失率近20%，耐光性較弱[7,16]；姜黃色素受光照影響很大，其溶液吸光度變化很大。2種色素均建議避光保存[10]。

圖5顯示，單色光對(duì)共混色素的影響與多色光基本相似，均引起吸光度逐漸減小，藍(lán)光比綠光和紅光的作用更明顯，造成體系吸光度顯著降低，表明藍(lán)光造成共混體系的色素?fù)p失最大。

a-1∶1；b-3∶2；c-4∶1圖4 多色光照對(duì)共混色素穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of light on the stability of the blend pigments

a-1∶1；b-3∶2；c-4∶1圖5 LED單色光對(duì)共混色素穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of LED monochromatic light on the stability of the blend pigments

2.3.2 溫度敏感性

單一梔子黃溶液對(duì)溫度敏感，在60 ℃以下時(shí)，色素?fù)p失率可達(dá)到50%左右，100 ℃下?lián)p失率大于70%；多項(xiàng)研究表明姜黃素對(duì)溫度不敏感，20～100 ℃內(nèi)不同溫度處理后，吸光度變化不明顯[7,17]。不同配比溶液中，4 ℃處理吸光度變化極小，20 ℃下體系吸光度變化較小，60 ℃下吸光度下降明顯，100 ℃ 處理吸光度急劇下降，3種配比間變化趨勢(shì)相似，表明該共混色素能耐冷藏、室溫，不耐高溫，建議保存時(shí)避免高溫環(huán)境(圖6)。另外，共混色素在4、20、60及100 ℃下的損失率分別為2%、12%、30%及55%左右，顯著低于單一梔子黃色素的損失率，表明姜黃的加入對(duì)梔子黃有保護(hù)作用。

a-1∶1；b-3∶2；c-4∶1圖6 溫度對(duì)共混色素穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of temperature on the stability of the blend pigments

2.3.3 pH值對(duì)共混色素穩(wěn)定性的影響

由前人研究可知，在強(qiáng)酸或強(qiáng)堿環(huán)境下，梔子黃色素?fù)p失率在15%左右，pH 5～9時(shí)損失率小于10%[6]；姜黃素溶液受pH值影響很大，在酸性和中性條件下呈現(xiàn)亮黃色、黃色，色素溶解度降低，在堿性條件下呈現(xiàn)橙紅色，吸光度增大，但分子結(jié)構(gòu)未受影響[17]。pH值在2～6和8～12時(shí)，3種配比的共混色素溶液的吸光度下降較多，酸性和堿性越強(qiáng)，吸光度變化越大，體系色素?fù)p失也越大；pH值為7時(shí)，吸光度與對(duì)照組相比無(wú)明顯下降，表明梔子黃/姜黃共混溶液的耐酸堿性較弱，可能跟梔子黃和姜黃中所含的羧基和羥基有關(guān)，應(yīng)避免強(qiáng)酸強(qiáng)堿的處理(圖7)。4∶1 配比的色素溶液在不同pH下的吸光度對(duì)其他配比的色素溶液具有顯著性差異，表明梔子黃在共混體系中影響較大。此共混體系對(duì)pH值的敏感性符合相關(guān)報(bào)道，單獨(dú)的梔子黃或姜黃色素受pH的影響較大，顏色發(fā)生較大變化[18-19]。

圖7 pH值對(duì)共混色素穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of pH value on the stability of the blend pigments

2.3.4 氧化劑、還原劑對(duì)共混色素穩(wěn)定性的影響

經(jīng)不同濃度的過(guò)氧化氫溶液處理后，3種配比的梔子黃/姜黃共混色素吸光度呈減小趨勢(shì)，損失率均小于10%，不同濃度H2O2對(duì)1∶1和3∶2的共混色素穩(wěn)定性影響幾乎一致，4∶1配比的共混色素所受影響存在顯著性差異，表明共混色素對(duì)氧化劑H2O2比較穩(wěn)定，梔子黃在此共混體系中對(duì)氧化劑相對(duì)更加敏感(圖8)。有研究表明，單獨(dú)的梔子黃或姜黃溶液均具有一定的耐氧化性[7,20]，穩(wěn)定性良好。

圖8 過(guò)氧化氫對(duì)共混色素穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effect of H2O2 on the stability of the blend pigments

經(jīng)不同濃度的Na2SO3溶液處理后，3種配比的梔子黃/姜黃共混色素吸光度呈減小趨勢(shì)，色素?fù)p失率為10%～20%，表明該共混色素溶液對(duì)此還原劑較為穩(wěn)定。不同濃度的Na2SO3對(duì)此共混溶液的影響無(wú)顯著差異(圖9)?；痉锨叭搜芯拷Y(jié)論，梔子黃溶液在Na2SO3環(huán)境中具有良好的穩(wěn)定性，磷酸鈉溶液可使姜黃色素溶液吸光度增大產(chǎn)生增色作用[7,21]。

有研究表明，梔子黃色素經(jīng)過(guò)不同濃度的過(guò)氧化氫或者亞硫酸鈉處理，損失率為15%左右，對(duì)氧化劑和還原劑比較穩(wěn)定；姜黃素對(duì)H2O2有很強(qiáng)的抗氧化性，經(jīng)磷酸鈉處理發(fā)生增色效應(yīng)，吸光度顯著增大[17,22]。本研究中，共混色素經(jīng)H2O2或者Na2SO3處理后，吸光度降幅不大；氧化劑處理時(shí)，4∶1配比的共混溶液吸光度顯著低于1∶1和3∶2配比的溶液，可能是梔子黃占主體的共混溶液抗氧化性較弱。因此，有氧化劑或還原劑參與的環(huán)境，建議適當(dāng)提高姜黃的比例，有利于共混體系穩(wěn)定性的提升。

圖9 亞硫酸鈉對(duì)共混色素穩(wěn)定性的影響Fig.9 Effect of Na2SO3 on the stability of the blend pigments

2.3.5 金屬離子對(duì)共混色素穩(wěn)定性的影響

如圖10所示，不同濃度金屬離子處理?xiàng)d子黃/姜黃共混色素溶液后，3種配比的共混色素吸光度均逐漸下降。其中Fe3+的影響最大，引起吸光度急劇下降，體系損失率為65%左右，相對(duì)其他離子產(chǎn)生的影響具有顯著性差異，Ca2+、Li+及Mg2+(色素?fù)p失率約5%)作用效果基本一致。據(jù)報(bào)道，F(xiàn)e3+對(duì)梔子黃色素的破壞相當(dāng)明顯，2 h可引起色素?fù)p失率大于80%，溶液幾乎褪色為無(wú)色，梔子黃對(duì)Mg2+、Ca2+、Li+非常穩(wěn)定[23]；Fe3+和Ca2+可引起姜黃溶液變色[7,24]。結(jié)果表明共混體系相較于單一色素的穩(wěn)定性更好，受金屬離子處理后損失率相對(duì)更低；但共混體系對(duì)Fe3+環(huán)境不穩(wěn)定性，與前人的研究一致，可能是因?yàn)榻饘匐x子與色素發(fā)生了氧化還原反應(yīng)或者螯合作用[1]。

近幾十年來(lái)，研究人員積極探索穩(wěn)定天然色素的可用方法。目前，常用的方法有添加共色素化合物、形成超分子配合物、納米載體的包封體系和屏蔽保護(hù)等[1]。比如前人運(yùn)用酚類(lèi)化合物等來(lái)穩(wěn)定花青素，以及運(yùn)用Fe3+、Ca2+、Al3+等離子與色素共著色來(lái)提升天然色素的穩(wěn)定性[25]，金屬離子與天然色素發(fā)生氧化還原反應(yīng)或螯合作用是顏色改變的可能機(jī)理之一[1]。本研究中，姜黃分子為多酚化合物，可能對(duì)梔子黃分子有提升穩(wěn)定性作用，有待進(jìn)一步研究。

a-1∶1；b-3∶2；c-4∶1圖10 金屬離子對(duì)共混色素穩(wěn)定性的影響Fig.10 Effect of metal ions on the stability of the blend pigments

3 結(jié)論

本研究表明梔子黃/姜黃的共混體系分子間可能發(fā)生了以氫鍵為主的復(fù)合作用，形成較穩(wěn)定的復(fù)合物；本文共混色素比單一色素的耐光性稍強(qiáng)，色素受太陽(yáng)光和單色光藍(lán)光的影響較大；共混體系對(duì)不同溫度的穩(wěn)定性優(yōu)于單一色素，但在60 ℃以條件下同樣不穩(wěn)定；共混體系在酸堿條件不穩(wěn)定；在氧化劑、還原劑、金屬離子的環(huán)境中，共混體系相較于單一色素更加穩(wěn)定，F(xiàn)e3+環(huán)境下穩(wěn)定性差；不同環(huán)境因子對(duì)3種配比共混體系的作用顯示，適當(dāng)增大體系中姜黃的比例有利于增強(qiáng)共混色素的穩(wěn)定性。本研究可為共混色素的研究和應(yīng)用提供理論參考。