肖懷秋，李玉珍，林親錄，趙謀明，曹丹

1(湖南化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院 制藥與生物工程學(xué)院，湖南 株洲，412000)2(華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州，510000)3(中南林業(yè)科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙，410004)

為使食品免受食源性致病菌或腐敗微生物污染并延長(zhǎng)食品保質(zhì)期，除采用低溫、高鹽(糖)或干燥等傳統(tǒng)手段外，常在食品中添加抗菌保鮮劑以達(dá)到預(yù)期目的?；瘜W(xué)防腐劑因易殘留和存在潛在“三致”危害而受限[1]?？咕囊蚓哂锌咕V廣、抑菌機(jī)制獨(dú)特和不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)勢(shì)而成為食品抗菌保鮮領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。食品是一個(gè)復(fù)雜多變的非線性灰色體系，食品組分、加工參數(shù)及貯運(yùn)條件等內(nèi)外部因素對(duì)抗菌活性發(fā)揮可能產(chǎn)生復(fù)雜影響。食品酸堿性及表面活性劑等可影響抑菌活性，如Nisin在酸性食品中可發(fā)揮較好抑菌活性，而中性或堿性條件則幾乎無(wú)抑菌活性，酸處理能顯著降低辣椒籽抗菌肽抑菌活性[2]，Tween-80能增強(qiáng)抗菌能力[3]。食品中金屬陽(yáng)離子對(duì)抗菌活性也可能產(chǎn)生復(fù)雜影響，如Fe2+使BSN-37抑菌活性消失[4]、Ag+使蘿卜籽蛋白抑菌活性降低70%[5]、Ca2+可增強(qiáng)花椒籽蛋白抗菌活性[3]，Na+、Mg2+和Ca2+使BSN-37最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)上升6倍以上，F(xiàn)e3+使MIC輕微下降[6]。前期研究發(fā)現(xiàn)，金屬抗菌肽SIF4對(duì)金黃色葡萄球菌[7]和大腸桿菌[8]有較好抑菌活性，在模擬食品體系中保持較好抗菌活性[9]，但在食品內(nèi)外部環(huán)境因素變化時(shí)抗菌活性衍變規(guī)律尚未明晰。本文以金黃色葡萄球菌為指示菌，研究食品內(nèi)外部環(huán)境因素變化對(duì)SIF4抑菌活性影響的衍變規(guī)律，為其在食品抗菌保鮮中應(yīng)用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

金屬抗菌肽SIF4由課題組制備[7]。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，ATCC25923)，從菌種保藏中心獲得。牛肉膏、胰蛋白胨，北京博星生物；胃蛋白酶、胰蛋白酶，龐博生物；蛋白酶K，Sigma；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

Infinite M200 Pro多功能酶標(biāo)儀，Tecan；LDZX-40SAI立式蒸汽滅菌鍋，上海博迅醫(yī)療；BBS-SSC超凈工作臺(tái)，濟(jì)南騰覽；DH-360電熱恒溫培養(yǎng)箱，北京科偉；HERMLEZ323K冷凍離心機(jī)，Hermle。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 相對(duì)抑菌活性測(cè)定

從菌種保藏斜面用接種環(huán)刮取2環(huán)S.aureus接種至牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫振蕩(120 r/min)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，準(zhǔn)確吸取0.1 mL菌液(×108CFU/mL)均勻涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基表面，將滅菌牛津杯置于培養(yǎng)皿中并加入供試品0.1 mL，4 ℃放置2 h使試液充分?jǐn)U散至瓊脂層，37 ℃ 恒溫靜置培養(yǎng)24 h并測(cè)定抑菌圈直徑。抑菌活性計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：A1為試驗(yàn)組平均抑菌圈直徑，cm；A0為對(duì)照組平均抑菌圈直徑，cm。

1.2.2 食品內(nèi)部因素對(duì)抑菌活性的影響

(1)溫度對(duì)抑菌活性的影響：取2×MIC的SIF4(MIC=0.2 μg/mL)5 mL，于25、37、50、60、70、80、90、100、121 ℃分別處理30 min，5 000 r/min離心2 min，取上清液與S.aureus等體積混合(SIF4終濃度為1×MIC，下同)并測(cè)定相對(duì)抑菌活性。

(2)pH變化對(duì)抑菌活性的影響：參考WU等[10]方法并略作修改。取2×MIC SIF4若干份，用1 mol/L HCl或NaOH將pH調(diào)至2～12，室溫放置1 h，pH回調(diào)至7.0，5 000 r/min離心2 min，取上清液與S.aureus等體積混合并測(cè)定相對(duì)抑菌活性。

(3)金屬陽(yáng)離子對(duì)抑菌活性的影響：參考BOZIARIS等[11]方法并稍微修改。取SIF4若干份溶于0～200 mmol/L CaCl2、MgCl2、KCl和NaCl溶液(pH 7.4)中，使終濃度為2×MIC，5 000 r/min離心2 min，取上清液與S.aureus等體積混合并測(cè)定相對(duì)抑菌活性。

1.2.3 食品外部因素對(duì)抑菌活性的影響

蛋白酶對(duì)抑菌活性的影響：參考KIM等[12]方法并略作修改。于2×MIC SIF4溶液中分別加入胃蛋白酶(37 ℃，pH 1.5)、胰蛋白酶(37 ℃，pH 8.5)和蛋白酶K(55 ℃，pH 7.5)，使酶終質(zhì)量濃度分別為0.001、0.01、0.1、1 mg/mL，溫育30 min后100 ℃滅酶5 min，5 000 r/min離心2 min，取上清液與S.aureus等體積混合并測(cè)定相對(duì)抑菌活性。

反復(fù)凍融對(duì)抑菌活性的影響：將2×MIC SIF4進(jìn)行反復(fù)凍融(-20 ℃凍結(jié)，常溫解凍，凍融10次)，凍融后于5 000 r/min離心2 min，取上清液與S.aureus等體積混合并測(cè)定相對(duì)抑菌活性。

化學(xué)試劑對(duì)抑菌活性的影響：

(1)EDTA對(duì)抑菌活性的影響：配制濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/mL無(wú)菌EDTA溶液，加入SIF4使終濃度為2×MIC，室溫靜置30 min，5 000 r/min離心2 min，取上清液與S.aureus等體積混合并測(cè)定相對(duì)抑菌活性。

(2)Tween-80對(duì)抑菌活性的影響：配制質(zhì)量濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL無(wú)菌Tween-80溶液，加入SIF4使終濃度為2×MIC，室溫靜置30 min，5 000 r/min離心2 min，取上清液與S.aureus等體積混合并測(cè)定相對(duì)抑菌活性。

(3)尿素對(duì)抑菌活性的影響：配制濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L的無(wú)菌尿素溶液，加入SIF4使終濃度為2×MIC，室溫靜置30 min，5 000 r/min離心2 min，取上清液與S.aureus等體積混合并測(cè)定相對(duì)抑菌活性。

(4)十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)對(duì)抑菌活性的影響：配制質(zhì)量濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL無(wú)菌SDS溶液，加入SIF4使終濃度為2×MIC，室溫靜置30 min，5 000 r/min離心2 min，取上清液與S.aureus等體積混合并測(cè)定相對(duì)抑菌活性。

1.2.4 生物相容性分析(溶血活性分析)

參考STARK[13]方法并修改。取健康家兔血液收集于肝素鈉管中，2 000 r/min離心10 min，倒掉血清，血細(xì)胞用預(yù)冷PBS(10 mmol/L，pH 7.4，含50 mmol/L NaCl PBS)重懸洗滌3次以除盡血清，血細(xì)胞用PBS重懸至8%。將1 024 μg/mL SIF4作2倍稀釋并分別與等體積血紅細(xì)胞懸液混合，37 ℃孵育30 min，3 000 r/min離心10 min，1 000 r/min離心10 min后，上清液用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定A490nm以觀察紅細(xì)胞血紅蛋白釋放程度。以PBS為陰性對(duì)照，0.1% Triton X-100為陽(yáng)性對(duì)照。溶血活性計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

式中：A1為抗菌肽和樣品共育后吸光值；A0為陰性對(duì)照組吸光值；A2為陽(yáng)性對(duì)照組吸光值。

1.2.5 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)表示，用Origin 2017繪制統(tǒng)計(jì)圖，采用SPSS 25.0單因素ANOVA檢驗(yàn)進(jìn)行組間均數(shù)差異多重比較，兩兩比較方差齊性時(shí)采用最小顯著性差異法，非齊性時(shí)使用塔姆黑尼T2方法，顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 食品內(nèi)部因素對(duì)抑菌活性的影響

2.1.1 溫度對(duì)抑菌活性的影響

溫度對(duì)SIF4抑菌活性影響結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，金屬抗菌肽SIF4抑菌活性在25～70 ℃無(wú)顯著差異(P>0.05)，80 ℃后略有下降，121 ℃ 仍保持(92.68±0.40)%抑菌活性，說(shuō)明SIF4經(jīng)不同溫度處理后，對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌活性并未發(fā)生明顯變化，具備較好熱穩(wěn)定性，可能是由于SIF4為小分子抗菌肽，高溫處理對(duì)結(jié)構(gòu)影響甚微[14]，與朱張洪基[15]報(bào)道的SDLH抑菌蛋白熱穩(wěn)定性結(jié)論相悖，該抑菌蛋白常溫表現(xiàn)較好抑菌活性，高溫(50～80 ℃)穩(wěn)定性較差，可能是由于該抑菌蛋白分子質(zhì)量較大，高溫處理破壞氫鍵，對(duì)空間結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，從而減弱抑菌活性，多數(shù)蛋白在45～50 ℃發(fā)生變性，而寡肽熱穩(wěn)定性相對(duì)較好[15]。

圖1 溫度對(duì)抑菌活性的影響Fig.1 The effect of temperature on antimicrobial activity注：字母相同表示組間差異不顯著(P>0.05)，字母不同表示組間差異顯著(P<0.05)(下同)

2.1.2 pH變化對(duì)抑菌活性的影響

pH對(duì)SIF4抑菌活性影響結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，在pH 2～9，SIF4抑菌活性可保持在(93.98±0.30)%以上，說(shuō)明SIF4在酸性、中性或偏堿性條件下有較好抑菌穩(wěn)定性，可用于果蔬汁飲料等酸性食品抗菌保鮮。pH>10抑菌活性顯著降低可能是由于強(qiáng)堿性環(huán)境下抗菌肽分子構(gòu)象發(fā)生變化而影響其抗菌穩(wěn)定性[16]。研究發(fā)現(xiàn)，pH=12時(shí)仍保持(85.54±0.28)%抑菌活性，說(shuō)明SIF4具有較好酸堿適應(yīng)性，在不同食品pH體系中具有較好的應(yīng)用基礎(chǔ)。鴨小腸抗菌肽在pH=7.0時(shí)抑菌活性最強(qiáng)，適用于中性食品體系，偏酸性(pH<6.0)或偏堿性(pH>8.0)食品體系抑菌效果均不理想，林蛙抗菌肽在pH 2～5.6穩(wěn)定，pH>6抑菌活性明顯下降，pH 8左右出現(xiàn)沉淀，適用中性或酸性食品體系，而辣椒籽抗菌肽在pH≥7時(shí)，抗菌活性隨pH升高而顯著升高(P<0.05)，pH=12處理4 h，抑菌活性比對(duì)照提高35.38%，適用于堿性食品體系使用，由此也可看出，不同抗菌肽的酸堿適應(yīng)性存在顯著差異。

圖2 pH值對(duì)抑菌活性的影響Fig.2 The effect of pH value on antimicrobial activity

2.1.3 金屬陽(yáng)離子對(duì)抑菌活性的影響

金屬陽(yáng)離子對(duì)SIF4抑菌活性影響如圖3所示。

由圖3-A可知，50～200 mmo/L Ca2+對(duì)SIF4抑菌活性無(wú)顯著影響(P>0.05)。李心丹等[17]發(fā)現(xiàn)，抗菌肽抑菌活性隨Ca2+濃度增加而顯著減弱(P<0.05)且呈良好負(fù)相關(guān)關(guān)系，但也有研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+可增強(qiáng)抗菌肽抑菌活性，如Ca2+可使BSN-37對(duì)沙門(mén)氏菌MIC提升6倍以上，對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌MIC提升4倍；由圖3-B可知，50～200 mmo/L Mg2+對(duì)抑菌活性無(wú)顯著影響(P>0.05)，抑菌活性均保持在(99.28±0.78)%以上。Mg2+對(duì)花椒籽抗菌肽有顯著抑制作用且與離子濃度呈正相關(guān)關(guān)系[16]，抗菌肽VR3在高濃度Mg2+時(shí)抑菌活性減弱近40%，且Mg2+比Na+抑菌活性更明顯[18]；由圖3-C可知，K+在50～200 mmol/L，試驗(yàn)組與對(duì)照組抑菌活性均無(wú)顯著差異(P>0.05)，與李心丹等[17]結(jié)果一致，但與侯曉艷[16]結(jié)論不一致，她發(fā)現(xiàn)高濃度K+濃度時(shí)，NP-5抑菌活性下降了38.46%；由圖3-D可知，在50～200 mmol/L Na+，試驗(yàn)組與對(duì)照組抑菌活性無(wú)顯著差異(P>0.05)，與鐘亨任[19]結(jié)果一致。結(jié)果表明，SIF4抑菌活性不受Na+、K+、Ca2+和Mg2+影響，可能為非金屬依耐抗菌肽[20]。

2.2 食品外部因素對(duì)抑菌活性的影響

2.2.1 蛋白酶對(duì)抑菌活性的影響

蛋白酶對(duì)SIF4抑菌活性影響如圖4所示。

A-胃蛋白酶；B-胰蛋白酶；C-蛋白酶K圖4 蛋白酶對(duì)抑菌活性的影響Fig.4 The effect of proteinase on antimicrobial activity

由圖4-A可知，胃蛋白酶處理后抑菌活性與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)，說(shuō)明SIF4具有較好的胃蛋白酶耐受性。侯曉艷[16]發(fā)現(xiàn)，胃蛋白酶可顯著降低NP-2、NP-5和NP-6抑菌活性，coagulin甚至可被胃蛋白酶失活[21]。胃蛋白酶主要作用于芳香族氨基酸，傾向于剪切氨基端或羧基端為芳香族氨基酸和亮氨酸的肽鍵，SIF4具有較好的胃蛋白酶耐受性可能與其金屬螯合載體相對(duì)分子質(zhì)量較小及氨基酸組成有關(guān)，可能不含酶切位點(diǎn)[22]。由圖4-B可知，0.001～0.1 mg/mL胰蛋白酶處理后，SIF4抑菌活性與對(duì)照組也無(wú)顯著差異(P>0.05)，0.1、1.0 mg/mL胰蛋白酶處理后，抑菌活性略有下降，但仍可保持(97.40±0.87)%以上抑菌活性，coagulin可被胰蛋白酶失活[21]。胰蛋白酶主要作用于精氨酸和賴氨酸羧基端，SIF4具有較好的胰蛋白酶耐受性與其氨基酸組成有關(guān)，其在食品模擬體系中的穩(wěn)定性與課題組前期研究的胃腸耐受性結(jié)論一致[22]；由圖4-C可知，經(jīng)0.001、0.01 mg/mL蛋白酶K處理后，SIF4抑菌活性與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)，經(jīng)0.1、1.0 mg/mL蛋白酶K處理后，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)意義顯著下降(P<0.05)，但仍分別有(92.52±0.71)%和(87.98±0.54)%抑菌活性，說(shuō)明SIF4具有較好蛋白酶K耐受性?？咕囊志钚钥杀坏鞍酌窴失活(如bacthuricinF4)[23]或不受蛋白酶K影響(如B.laterosporusS62-9抗菌肽)[24]，抗菌肽酶耐受性的差異與抗菌肽氨基酸序列長(zhǎng)短及氨基酸組成有關(guān)[23]。

2.2.2 反復(fù)凍融對(duì)抑菌活性的影響

反復(fù)凍融對(duì)SIF4抑菌活性影響如圖5所示。

圖5 反復(fù)凍融對(duì)抑菌活性的影響Fig.5 The effect of freeze-thaw cycle on antimicrobial activity

由圖5可知，SIF4經(jīng)6次凍融處理后，抑菌活性與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)，抑菌活性為(99.00±0.81)%，隨后略有下降，凍融10次時(shí)，抑菌活性仍保持(82.90±0.87)%，表明SIF4具有較好凍融穩(wěn)定性，與抗菌肽Brevilaterin凍融穩(wěn)定性一致[25]。凍融穩(wěn)定性差的抑菌蛋白(肽)應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融操作。

2.2.3 化學(xué)試劑對(duì)抑菌活性的影響

化學(xué)試劑對(duì)抑菌活性的影響如圖6所示。

A-EDTA；B-Tween-80；C-尿素；D-SDS圖6 化學(xué)試劑對(duì)抑菌活性的影響Fig.6 The effect of chemical reagent on antimicrobial activity

由圖6-A可知，EDTA在0.2～1.0 mmol/mL時(shí)，抑菌活性與對(duì)照組均無(wú)顯著差異(P>0.05)，表明EDTA對(duì)SIF4抑菌活性影響較小。EDTA可破壞陰性細(xì)菌外膜脂多糖結(jié)構(gòu)，如EDTA可協(xié)同增強(qiáng)Enterocin T1和Plantarcin Q7抑菌活性；由圖6-B可知，Tween-80對(duì)SIF4抑菌活性無(wú)顯著影響(P>0.05)，與WORAPRAYOTE等[26]結(jié)論一致。有研究發(fā)現(xiàn)，Tween-80能增強(qiáng)抑菌活性，可能是因?yàn)門(mén)ween有助抗菌肽在瓊脂平板中充分?jǐn)U散[24]；從圖6-C可知，0.2～0.8 mol/L尿素對(duì)SIF4抑菌活性無(wú)顯著影響(P>0.05)，濃度為1.0 mol/L時(shí)，抑菌活性仍可保持(97.43±0.54)%，說(shuō)明尿素對(duì)抑菌活性影響較小，與LIU等[27]基本一致，但WORAPRAYOTE研究發(fā)現(xiàn)，尿素可顯著降低抗菌肽抑菌活性[26]；由圖6-D可知，0.2～0.4 mg/mL SDS對(duì)抑菌活性無(wú)顯著影響(P>0.05)，0.6 mg/mL上升到0.8、1.0 mg/mL時(shí)，抑菌活性從(98.75±0.41)%略降至(97.97±0.44)%和(97.81±0.75)%，具有較好抑菌穩(wěn)定性，可能是由于SDS有利于抗菌肽α-螺旋空間結(jié)構(gòu)形成，對(duì)維持其空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和增強(qiáng)抑菌活性有重要意義[28]。董新穎發(fā)現(xiàn)，SDS可顯著降低B.laterosporusS62-9抑菌活性(僅殘存6.69%)，可能是由于該抗菌肽分子量較大，SDS處理可使抑菌蛋白變性，從而顯著減弱其抗菌活性。SIF4經(jīng)SDS作用后，抗菌活性仍可保持(97.81±0.75)%以上，說(shuō)明金屬抗菌肽SIF4為分子質(zhì)量較小的寡聚抗菌肽。

2.3 生物相容性

SIF4對(duì)血紅細(xì)胞生物相容性結(jié)果如表1所示。

表1 SIF4對(duì)血紅細(xì)胞生物相容性結(jié)果Table 1 The biocompatibility of SIF4 on blood cells

研究發(fā)現(xiàn)，PBS試驗(yàn)組未觀察到溶血現(xiàn)象，Triton X-100試驗(yàn)組溶血率為100%。由表1可看出，SIF4對(duì)血紅細(xì)胞均具較好生物相容性，表現(xiàn)較低溶血活性，即使在1 024 μg/mL時(shí)，溶血活性也僅為(5.48±0.32)%，遠(yuǎn)超過(guò)其MIC濃度，說(shuō)明SIF4對(duì)動(dòng)物細(xì)胞幾乎無(wú)細(xì)胞毒性，具有較好生物相容性和生物安全性。

3 結(jié)論

抗菌肽能否適應(yīng)食品內(nèi)外部環(huán)境變化是制約其在食品抗菌保鮮領(lǐng)域中應(yīng)用的基礎(chǔ)。本試驗(yàn)以金黃色葡萄球菌為指示菌，研究了食品內(nèi)外部環(huán)境因素變化對(duì)抑菌活性的影響。研究發(fā)現(xiàn)，金屬抗菌肽SIF4具有較好熱穩(wěn)定性和酸堿耐受性，常見(jiàn)金屬陽(yáng)離子對(duì)抑菌活性無(wú)顯著影響(P>0.05)，胃蛋白酶和胰蛋白酶對(duì)抑菌活性影響較小，具有很好胃腸消化酶耐受性，低濃度蛋白酶K處理對(duì)抑菌活性無(wú)顯著影響(P>0.05)，蛋白酶K濃度增加，抑菌活性有所減弱，但仍可保持較高抑菌活性；有較好的凍融穩(wěn)定性。EDTA和Tween-80對(duì)抑菌活性無(wú)顯著影響(P>0.05)，低濃度SDS(<0.4 mg/mL)和尿素(<0.8 mol/L)對(duì)抑菌活性無(wú)顯著影響(P>0.05)；具有很好的生物相容性和生物安全性，對(duì)血紅細(xì)胞有極低溶血活性。研究認(rèn)為，在常見(jiàn)食品內(nèi)外部因素變化過(guò)程中，SIF4可保持較好的抑菌活性和生物相容性，可作為一種新型抑菌劑用于食品抗菌保鮮，可通過(guò)抑制致病微生物和腐敗微生物增殖來(lái)增強(qiáng)食品的抗菌保鮮，有很好的應(yīng)用前景。