張瑾，余祖華，丁軻，李旺，李元曉，曹平華，賈艷艷，何萬(wàn)領(lǐng)，趙龍妹，廖成水

1(洛陽(yáng)市活載體生物材料與動(dòng)物疫病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 洛陽(yáng)，471023)2(功能微生物與精準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 洛陽(yáng)，471023)

黃曲霉毒素是主要由黃曲霉(Aspergillusflavus)和寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)等合成的次級(jí)代謝物[1-2]，其化學(xué)成分是二氫呋喃香豆素的衍生物。黃曲霉毒素B1(aflatoxin, AFB1)、AFB2、AFG1和AFG2是4種主要的黃曲霉毒素，而因其具有肝毒性、致癌性、致畸性和免疫抑制等特點(diǎn)被列為一級(jí)致癌物[3-4]。

小麥、玉米和大豆等飼料原料和食品中普遍存在AFB1，嚴(yán)重影響了人畜安全。目前已經(jīng)提出了物理法、化學(xué)法和生物法來(lái)降解AFB1[5-7]，而由于物理法和化學(xué)法存在成本高、化學(xué)殘留、食品營(yíng)養(yǎng)成分被破壞等限制，這些方法均不太理想[8]。而AFB1的生物降解法因具有對(duì)毒素高度專(zhuān)一性、無(wú)污染、不破壞食品營(yíng)養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)已成為國(guó)內(nèi)外AFB1脫毒的研究熱點(diǎn)[9]。雷元培等[10]篩選降解AFB1菌霉立解060菌，經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌，其對(duì)AFB1、AFG1和AFM1的降解率分別為73%、71%和59%。AMRA等[11]研究表明小鼠連續(xù)7 d口服1×1010CFU/mL鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)可顯著降低AFB1引起的毒性。SHU等[12]以香豆素為唯一碳源的培養(yǎng)基分離出AFB1降解菌枯草芽孢桿菌DY3108，該菌在較寬的pH和溫度下都有降解效果。SONG等[13]對(duì)銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)M19對(duì)AFB1的生物降解進(jìn)行了評(píng)價(jià)，從該菌中分離純化了AFB1降解酶(AFB1-degrading enzymes，PADE)，PADE在65 ℃、pH 6.0時(shí)對(duì)AFB1的降解活性最高。ADEBO等[14]發(fā)現(xiàn)乳酸菌可以通過(guò)吸附作用與AFB1結(jié)合，培養(yǎng)48 h后可以清除54%的AFB1。雖然關(guān)于生物降解方面的研究較多，但大多研究停留在菌株的篩選與鑒定，未對(duì)菌株生長(zhǎng)條件和益生性深入研究。因此，開(kāi)發(fā)微生物降解AFB1具有非常重要的意義。本研究旨在篩選到1株降解AFB1的益生菌，采用形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)和分子生物學(xué)方法對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，并對(duì)菌株生物學(xué)特性進(jìn)行初步研究，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)微生物降解AFB1提供基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)樣品

發(fā)霉花生、玉米、青貯飼料等采集自洛陽(yáng)某地。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

香豆素初篩液體培養(yǎng)基(g/L)：KH2PO40.25、MgSO4·7H2O 0.25 、KNO30.5、(NH4)2SO40.5、CaCl20.005、FeCl3·6H2O 0.003、香豆素1.0，pH 7.0，121 ℃高壓滅菌30 min。

香豆素初篩固體培養(yǎng)基：香豆素初篩液體培養(yǎng)基加入1.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂配成香豆素初篩平板培養(yǎng)基，121 ℃高壓滅菌30 min。

LB培養(yǎng)基(g/100mL)：胰蛋白胨1.0，NaCl 1.0，酵母抽取物0.5，pH 7.0，121 ℃高壓滅菌30 min。

試劑：AFB1標(biāo)準(zhǔn)品，上海酶聯(lián)生物科技有限公司；AFB1ELISA檢測(cè)試劑盒，北京華安麥科生物公司；DNA Marker、通用引物，南京擎科生物股份有限公司；DNA 提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；Pepsin、Trypsin、牛膽鹽，天津市博迪化工有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

Thermo Muultiskan-FC型酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo Fisher scientific公司；9700T 型PCR儀，西安天隆科技有限公司；OE UV1200 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，翱藝儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 降解AFB1菌株的篩選

按照AIGAMMAI等[15]的方法進(jìn)行初篩，具體為：分別取5 g不同樣本置于100 mL無(wú)菌水中，在渦旋振蕩器上振蕩10 min，靜置20 min后取上層懸濁液100 μL，用無(wú)菌水將其梯度稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，以2%接種量分別將懸濁液接種于含有香豆素的初篩液體培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)。24 h后吸取菌液100 μL涂布于香豆素初篩平板，37 ℃培養(yǎng)24 h后選取生長(zhǎng)良好的單菌株，連續(xù)3次劃線(xiàn)于香豆素初篩平板，待長(zhǎng)出單菌落后進(jìn)行純化并保存菌株。

1.2.2 菌株的復(fù)篩

取上述純化的菌株，分別按2%接種于含0.5 μg/mL AFB1的LB培養(yǎng)基，以未接菌的含0.5 μg/mL AFB1的LB培養(yǎng)基做對(duì)照組，每株菌做3個(gè)重復(fù)，37 ℃振蕩培養(yǎng)48 h后取樣，按照AFB1ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)AFB1的殘余量。AFB1降解率的計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：W0，對(duì)照組AFB1含量；W1，處理組AFB1含量。

選擇降解率最高的菌株進(jìn)行鑒定與生物學(xué)特性測(cè)定。

1.2.3 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

將菌株在LB培養(yǎng)基上純化劃線(xiàn)培養(yǎng)，使其長(zhǎng)出單個(gè)菌落，觀察其形態(tài)大小，并挑取少許菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。

1.2.4 菌株的生理生化鑒定

菌株的生理生化特征依據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[16]進(jìn)行鑒定。

1.2.5 菌株的16S rRNA鑒定

利用細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒提取分離菌株ZJ20的全基因組，以DNA為模板用細(xì)菌16S rRNA 通用引物(上游引物27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為:PremixTaq12.5 μL，模板1 μL，上游引物、下游引物各1 μL，加ddH2O至25 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性40 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸7 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)，然后通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)觀察結(jié)果。

1.2.6 基于16S rRNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

將PCR產(chǎn)物送至上海生物工程有限公司測(cè)序。將拼接后的序列在NCBI網(wǎng)站(美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)中心網(wǎng)站)進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，將目標(biāo)序列與同源性較高的序列運(yùn)用MEGA 7.0軟件包中的Kimura2-parameter法計(jì)算遺傳距離，運(yùn)用鄰接法(neighbor joining,NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.7 菌株的生物學(xué)特性

1.2.7.1 菌株生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定

將活化的降解菌株按2%接種量接入LB培養(yǎng)基，混勻后立即測(cè)定OD600值，37 ℃培養(yǎng)20 h，期間每隔2 h測(cè)定OD600值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)繪圖得到生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.2.7.2 菌株酸耐受性試驗(yàn)

將活化的菌液在4 000 r/min下離心10 min，棄上清液，將菌體重懸于等體積的pH值為3.0、4.0、5.0 的無(wú)菌生理鹽水中，以pH值7.0為對(duì)照，振蕩器混勻后，37 ℃孵育3 h，在0、1、2、3 h取100 μL菌液于900 μL無(wú)菌水中，依次倍比稀釋至 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8，選擇適宜梯度菌液100 μL涂布于LB瓊脂平板，每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù)，24 h后選取菌落數(shù)在30～300的計(jì)數(shù)。每毫升菌落數(shù)計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

式中：C,合適稀釋濃度下的平均菌落數(shù)；V,涂布平板所用稀釋液的體積，mL；M,稀釋倍數(shù)。

1.2.7.3 菌株膽鹽耐受性試驗(yàn)

將活化的菌液在4 000 r/min下離心10 min，在100 mL的LB液體培養(yǎng)基中分別加入0.1、0.2、0.3 g的牛膽鹽，制成1、2、3 g/L牛膽鹽的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)3 h，按照1.2.7.1方法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

1.2.7.4 菌株人工胃腸液耐受性試驗(yàn)

胃蛋白酶(pepsin)0.3%、NaCl 0.2%、蛋白胨0.12%、酵母膏0.31%(均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))，調(diào)至pH 2.0，經(jīng) 0.22 μm濾菌膜過(guò)濾除菌制成人工胃液。胰蛋白酶(trypsin)0.1%、NaHCO31.1%、NaCl 0.2%、牛膽鹽1.2%(均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))，調(diào)至pH值為8.0，過(guò)濾除菌制成人工腸液。將活化的菌液在4 ℃、4 000 r/min下離心10 min，棄上清液，取菌體懸浮于人工胃腸液中，37 ℃孵育，分別于0、3 h進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

1.2.7.5 菌株抑菌試驗(yàn)

分別取大腸桿菌CVCC1527、金黃色葡萄球菌ATCC6538、鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC14028接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，調(diào)節(jié)菌懸液的濃度為1.0×108CFU/mL。取100 μL涂布到LB固體培養(yǎng)基，將已滅菌的牛津杯等距放置在平板上，牛津杯中加入菌株ZJ20上清液100 μL，37 ℃培養(yǎng)12 h，測(cè)量抑菌圈直徑的大小來(lái)判斷受試菌對(duì)指示菌的抗菌能力。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 降解AFB1菌株的初分離

樣品中的菌株在香豆素初篩培養(yǎng)基富集后，以AFB1為唯一碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上進(jìn)行分離，根據(jù)菌落形態(tài)不同，初步分離42株對(duì)AFB1可能具有降解功能的菌株。

2.2 不同菌株對(duì)AFB1降解率測(cè)定結(jié)果

初篩的菌株雖對(duì)AFB1均有降解能力，但不同樣品來(lái)源的菌株的降解率不同，其中對(duì) AFB1降解率>30%的菌株有12株(表1)，降解率>50%的菌株有6株，菌株ZJ20對(duì)AFB1的降解率最高，可達(dá)84.23%，因此選擇ZJ20做進(jìn)一步研究。

表1 部分分離菌株對(duì)AFB1的降解率Table 1 Degradation rates of AFB1 by isolated strains

2.3 菌株ZJ20形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

菌株ZJ20菌落形態(tài)：白色、不透明、中間凸起、有褶皺、邊緣不整齊；顯微形態(tài)：革蘭氏陽(yáng)性菌、菌體呈桿狀、中生芽孢(圖1)。

a-菌落形態(tài)；b-顯微形態(tài)圖1 菌株ZJ20的菌落形態(tài)及顯微形態(tài)(1 000×)Fig.1 Colony morphology and microscopic morphology (1 000×) of ZJ20

2.4 菌株ZJ20生理生化鑒定結(jié)果

菌株ZJ20生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，該菌株VP試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)陽(yáng)性；硫化氫試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、硝酸鹽試驗(yàn)陰性；能夠發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、蔗糖，不用利用乳糖、甘露糖等。對(duì)照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，初步判定ZJ20為枯草芽孢桿菌。

表2 菌株ZJ20的生理生化鑒定結(jié)果Table 2 Biochemical identification results of strain ZJ20

2.5 菌株ZJ20的16S rRNA鑒定結(jié)果

以菌株ZJ20基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳，在約1 500 bp處有1條特異性條帶，與預(yù)期大小相符，見(jiàn)圖2。測(cè)序結(jié)果顯示該菌株的16S rRNA 序列長(zhǎng)度為1 454 bp，將序列提交GenBank獲得登錄號(hào)為SUB10217538。

M-Marker 2 000；1-陰性對(duì)照；2-PCR產(chǎn)物圖2 菌株ZJ20的16S rRNA片段PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of 16S rRNA fragment of strain ZJ20

2.6 基于16S rRNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果

將測(cè)序結(jié)果與NCBI中已有的16S rRNA序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，通過(guò)MEGA7.0軟件中的“Neighbor-Joining(NJ)”模塊對(duì)該序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析。由圖3可知，菌株ZJ20與BacillussubtilisYEBN5 MT372156.1在進(jìn)化樹(shù)上處于同一個(gè)分支，親緣關(guān)系最近，因此，可鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，命名為BacillussubtilisZJ20。

圖3 基于16S rRNA序列的菌株Bacillus subtilis ZJ20系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of Bacillus subtilis ZJ20 based on 16S rRNA sequence

2.7 菌株Bacillus subtilis ZJ20生物學(xué)特性

2.7.1 菌株BacillussubtilisZJ20生長(zhǎng)曲線(xiàn)

由圖4可知，BacillussubtilisZJ20生長(zhǎng)曲線(xiàn)呈現(xiàn)遲緩期、對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期。0～ 4 h是該菌的遲緩期，4～8 h 進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，8 h后進(jìn)入細(xì)菌生長(zhǎng)穩(wěn)定期。

圖4 Bacillus subtilis ZJ20生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig.4 Growth curve of Bacillus subtilis ZJ20

2.7.2 酸耐受性結(jié)果

BacillussubtilisZJ20分別在pH值3.0、4.0、5.0的PBS中培養(yǎng)3 h后，存活率仍能保持在60%以上(圖5)。

圖5 不同pH下Bacillus subtilis ZJ20的耐受能力Fig.5 Tolerance of Bacillus subtilis ZJ20 under different pH

2.7.3 耐膽鹽能力結(jié)果

BacillussubtilisZJ20在1、2、3 g/L牛膽鹽的LB液體培養(yǎng)基中3 h存活率分別為91.56%、77.35%、68.12%(圖6)。

圖6 不同膽鹽濃度下Bacillus subtilis ZJ20的耐受能力Fig.6 Tolerance of Bacillus subtilis ZJ20 under different bile salt concentrations

2.7.4 胃液耐受結(jié)果

BacillussubtilisZJ20在人工胃液中作用3 h后，活菌數(shù)從0 h的6.54×108CFU/mL下降至4.08×108CFU/mL，存活率保持在62.39%以上，說(shuō)明該菌株能夠耐受胃腸道環(huán)境并保持一定活性。

2.7.5 腸液耐受結(jié)果

BacillussubtilisZJ20在人工腸液中作用后，活菌數(shù)從0 h的7.98×108CFU/mL下降至5.36×108CFU/mL，存活率保持在67.17%以上。將本試驗(yàn)結(jié)果與劉曉燕等[17]研究的枯草芽孢桿菌WH1抗逆性試驗(yàn)結(jié)果對(duì)比，發(fā)現(xiàn)本試驗(yàn)菌株耐酸、耐膽鹽能力高于WH1，而耐人工胃液能力稍低于WH1。

2.7.6 抑菌能力結(jié)果

通過(guò)牛津杯平板法對(duì)BacillussubtilisZJ20進(jìn)行抑菌能力檢測(cè)，結(jié)果表明對(duì)3株指示菌株均有抑菌效果，且抑菌圈平均直徑在15 mm以上，對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌抑菌效果最好，抑菌圈直徑達(dá)18.36 mm，大腸桿菌的抑菌圈為16.32 mm，金黃色葡萄球菌的抑菌圈為15.75 mm。

3 討論

發(fā)霉飼料原料中的微生物長(zhǎng)期處于與黃曲霉毒素共生存中，形成相互制約、相互依賴(lài)的微生物系統(tǒng)，長(zhǎng)期被霉菌毒素污染的飼料中極可能存在能降解霉菌毒素的菌株[18]。本試驗(yàn)以霉變的飼料為樣品，以安全的香豆素代AFB1標(biāo)準(zhǔn)品為唯一碳源進(jìn)行AFB1降解菌的篩選，避免了與AFB1過(guò)多接觸產(chǎn)生危險(xiǎn)，本實(shí)驗(yàn)ELISA復(fù)篩結(jié)果也證明以香豆素為基質(zhì)篩選降解AFB1菌株是切實(shí)可行的。

利用芽孢桿菌降解AFB1的研究已有報(bào)道，袁遠(yuǎn)等[19]篩選的枯草芽孢桿菌對(duì)1 μg/mL的AFB1降解率為68.39%。本試驗(yàn)篩選的枯草芽孢桿菌對(duì)0.5 μg/mL AFB1的降解率為84.23%，與報(bào)道菌株降解率不同，一是與菌種不同有關(guān)；二是與菌株本身的降解能力有關(guān)；三是與菌株的降解機(jī)制有關(guān)，一般依靠菌株吸附降解能力有限，而依靠菌株代謝產(chǎn)生降解酶則效率較高；四是與菌株培養(yǎng)條件有關(guān)，如培養(yǎng)時(shí)間、溫度、pH值。所以要想得到對(duì)AFB1降解效果較好的菌株，必須綜合考慮以上因素。

根據(jù)人和動(dòng)物胃腸道特性，只有能夠耐受較強(qiáng)酸性和膽鹽環(huán)境的益生菌才能在胃腸道中存活并發(fā)揮其有益的作用。課題接下來(lái)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是研究AFB1降解菌對(duì)肉雞不同階段生長(zhǎng)性能的影響，所以有必要研究菌株的抗逆性和抑菌性。耐酸試驗(yàn)中，篩選的AFB1降解菌能夠耐受通常情況下胃中酸度，說(shuō)明可通過(guò)胃達(dá)到腸道，這為其作為脫毒劑發(fā)揮益生性能起到了先決作用。生長(zhǎng)曲線(xiàn)顯示該菌株能夠利用營(yíng)養(yǎng)成分快速繁殖，符合益生菌的基本特點(diǎn)。人和動(dòng)物腸道菌群復(fù)雜多樣，除定植有益微生物外，大量有害菌也在腸道中存在，進(jìn)入動(dòng)物腸道的有益微生物若要較好的發(fā)揮功能必須要抵抗有害菌的抑制作用[20]。本試驗(yàn)中，BacillussubtilisZJ20菌株上清液對(duì)以金黃色葡萄球菌為代表的革蘭氏陽(yáng)性菌和以大腸桿菌為代表的革蘭氏陰性菌都具良好的抑菌效果，說(shuō)明該菌可以抵抗動(dòng)物腸道有害菌的不利影響而發(fā)揮正常的生理功能。

4 結(jié)論

本研究篩選得到1株對(duì)AFB1降解率為84.23%的枯草芽孢桿菌，還未對(duì)菌株安全性進(jìn)行分析，接下來(lái)應(yīng)進(jìn)行動(dòng)物急性毒性實(shí)驗(yàn)，確定菌株安全性。該菌株未來(lái)可能聯(lián)合玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素等降解菌制成飼料脫霉劑或動(dòng)物解毒劑。大量菌株因不能耐受膽鹽等條件在畜牧生產(chǎn)中應(yīng)用受阻，篩選抗逆性強(qiáng)的微生物在生產(chǎn)中尤為關(guān)鍵，本實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)酸、膽鹽、胃腸液等環(huán)境具有耐受性，符合制作微生態(tài)制劑的指標(biāo)。該菌對(duì)常見(jiàn)病原菌具有抑菌性，作為飼料添加劑還能降低致病菌對(duì)動(dòng)物的損害，有效減少大腸桿菌等引起的腹瀉等疾病?？傊摼亲鳛锳FB1生物降解的有效菌株之一，也是作為活菌飼料添加劑降低飼料中AFB1的良好選擇。