張瑾，余祖華，丁軻，李旺，李元曉，曹平華，賈艷艷，何萬領(lǐng)，趙龍妹，廖成水

1(洛陽市活載體生物材料與動物疫病防控重點實驗室，河南 洛陽，471023)2(功能微生物與精準(zhǔn)營養(yǎng)重點實驗室，河南 洛陽，471023)

黃曲霉毒素是主要由黃曲霉(Aspergillusflavus)和寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)等合成的次級代謝物[1-2]，其化學(xué)成分是二氫呋喃香豆素的衍生物。黃曲霉毒素B1(aflatoxin, AFB1)、AFB2、AFG1和AFG2是4種主要的黃曲霉毒素，而因其具有肝毒性、致癌性、致畸性和免疫抑制等特點被列為一級致癌物[3-4]。

小麥、玉米和大豆等飼料原料和食品中普遍存在AFB1，嚴(yán)重影響了人畜安全。目前已經(jīng)提出了物理法、化學(xué)法和生物法來降解AFB1[5-7]，而由于物理法和化學(xué)法存在成本高、化學(xué)殘留、食品營養(yǎng)成分被破壞等限制，這些方法均不太理想[8]。而AFB1的生物降解法因具有對毒素高度專一性、無污染、不破壞食品營養(yǎng)等優(yōu)點，近年來已成為國內(nèi)外AFB1脫毒的研究熱點[9]。雷元培等[10]篩選降解AFB1菌霉立解060菌，經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌，其對AFB1、AFG1和AFM1的降解率分別為73%、71%和59%。AMRA等[11]研究表明小鼠連續(xù)7 d口服1×1010CFU/mL鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)可顯著降低AFB1引起的毒性。SHU等[12]以香豆素為唯一碳源的培養(yǎng)基分離出AFB1降解菌枯草芽孢桿菌DY3108，該菌在較寬的pH和溫度下都有降解效果。SONG等[13]對銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)M19對AFB1的生物降解進(jìn)行了評價，從該菌中分離純化了AFB1降解酶(AFB1-degrading enzymes，PADE)，PADE在65 ℃、pH 6.0時對AFB1的降解活性最高。ADEBO等[14]發(fā)現(xiàn)乳酸菌可以通過吸附作用與AFB1結(jié)合，培養(yǎng)48 h后可以清除54%的AFB1。雖然關(guān)于生物降解方面的研究較多，但大多研究停留在菌株的篩選與鑒定，未對菌株生長條件和益生性深入研究。因此，開發(fā)微生物降解AFB1具有非常重要的意義。本研究旨在篩選到1株降解AFB1的益生菌，采用形態(tài)觀察、生理生化試驗和分子生物學(xué)方法對菌株進(jìn)行鑒定，并對菌株生物學(xué)特性進(jìn)行初步研究，為進(jìn)一步開發(fā)微生物降解AFB1提供基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗樣品

發(fā)霉花生、玉米、青貯飼料等采集自洛陽某地。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

香豆素初篩液體培養(yǎng)基(g/L)：KH2PO40.25、MgSO4·7H2O 0.25 、KNO30.5、(NH4)2SO40.5、CaCl20.005、FeCl3·6H2O 0.003、香豆素1.0，pH 7.0，121 ℃高壓滅菌30 min。

香豆素初篩固體培養(yǎng)基：香豆素初篩液體培養(yǎng)基加入1.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂配成香豆素初篩平板培養(yǎng)基，121 ℃高壓滅菌30 min。

LB培養(yǎng)基(g/100mL)：胰蛋白胨1.0，NaCl 1.0，酵母抽取物0.5，pH 7.0，121 ℃高壓滅菌30 min。

試劑：AFB1標(biāo)準(zhǔn)品，上海酶聯(lián)生物科技有限公司；AFB1ELISA檢測試劑盒，北京華安麥科生物公司；DNA Marker、通用引物，南京擎科生物股份有限公司；DNA 提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；Pepsin、Trypsin、牛膽鹽，天津市博迪化工有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

Thermo Muultiskan-FC型酶標(biāo)儀，美國Thermo Fisher scientific公司；9700T 型PCR儀，西安天隆科技有限公司；OE UV1200 型紫外可見分光光度計，翱藝儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 降解AFB1菌株的篩選

按照AIGAMMAI等[15]的方法進(jìn)行初篩，具體為：分別取5 g不同樣本置于100 mL無菌水中，在渦旋振蕩器上振蕩10 min，靜置20 min后取上層懸濁液100 μL，用無菌水將其梯度稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，以2%接種量分別將懸濁液接種于含有香豆素的初篩液體培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)。24 h后吸取菌液100 μL涂布于香豆素初篩平板，37 ℃培養(yǎng)24 h后選取生長良好的單菌株，連續(xù)3次劃線于香豆素初篩平板，待長出單菌落后進(jìn)行純化并保存菌株。

1.2.2 菌株的復(fù)篩

取上述純化的菌株，分別按2%接種于含0.5 μg/mL AFB1的LB培養(yǎng)基，以未接菌的含0.5 μg/mL AFB1的LB培養(yǎng)基做對照組，每株菌做3個重復(fù)，37 ℃振蕩培養(yǎng)48 h后取樣，按照AFB1ELISA檢測試劑盒說明書檢測AFB1的殘余量。AFB1降解率的計算如公式(1)所示：

(1)

式中：W0，對照組AFB1含量；W1，處理組AFB1含量。

選擇降解率最高的菌株進(jìn)行鑒定與生物學(xué)特性測定。

1.2.3 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

將菌株在LB培養(yǎng)基上純化劃線培養(yǎng)，使其長出單個菌落，觀察其形態(tài)大小，并挑取少許菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。

1.2.4 菌株的生理生化鑒定

菌株的生理生化特征依據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[16]進(jìn)行鑒定。

1.2.5 菌株的16S rRNA鑒定

利用細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒提取分離菌株ZJ20的全基因組，以DNA為模板用細(xì)菌16S rRNA 通用引物(上游引物27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為:PremixTaq12.5 μL，模板1 μL，上游引物、下游引物各1 μL，加ddH2O至25 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性40 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34個循環(huán)；72 ℃再延伸7 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠檢測，然后通過凝膠成像系統(tǒng)檢測觀察結(jié)果。

1.2.6 基于16S rRNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

將PCR產(chǎn)物送至上海生物工程有限公司測序。將拼接后的序列在NCBI網(wǎng)站(美國國立生物技術(shù)中心網(wǎng)站)進(jìn)行BLAST比對分析，將目標(biāo)序列與同源性較高的序列運用MEGA 7.0軟件包中的Kimura2-parameter法計算遺傳距離，運用鄰接法(neighbor joining,NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.7 菌株的生物學(xué)特性

1.2.7.1 菌株生長曲線測定

將活化的降解菌株按2%接種量接入LB培養(yǎng)基，混勻后立即測定OD600值，37 ℃培養(yǎng)20 h，期間每隔2 h測定OD600值，以時間為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)繪圖得到生長曲線。

1.2.7.2 菌株酸耐受性試驗

將活化的菌液在4 000 r/min下離心10 min，棄上清液，將菌體重懸于等體積的pH值為3.0、4.0、5.0 的無菌生理鹽水中，以pH值7.0為對照，振蕩器混勻后，37 ℃孵育3 h，在0、1、2、3 h取100 μL菌液于900 μL無菌水中，依次倍比稀釋至 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8，選擇適宜梯度菌液100 μL涂布于LB瓊脂平板，每個稀釋度做3個重復(fù)，24 h后選取菌落數(shù)在30～300的計數(shù)。每毫升菌落數(shù)計算如公式(2)所示：

(2)

式中：C,合適稀釋濃度下的平均菌落數(shù)；V,涂布平板所用稀釋液的體積，mL；M,稀釋倍數(shù)。

1.2.7.3 菌株膽鹽耐受性試驗

將活化的菌液在4 000 r/min下離心10 min，在100 mL的LB液體培養(yǎng)基中分別加入0.1、0.2、0.3 g的牛膽鹽，制成1、2、3 g/L牛膽鹽的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)3 h，按照1.2.7.1方法進(jìn)行活菌計數(shù)。

1.2.7.4 菌株人工胃腸液耐受性試驗

胃蛋白酶(pepsin)0.3%、NaCl 0.2%、蛋白胨0.12%、酵母膏0.31%(均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))，調(diào)至pH 2.0，經(jīng) 0.22 μm濾菌膜過濾除菌制成人工胃液。胰蛋白酶(trypsin)0.1%、NaHCO31.1%、NaCl 0.2%、牛膽鹽1.2%(均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))，調(diào)至pH值為8.0，過濾除菌制成人工腸液。將活化的菌液在4 ℃、4 000 r/min下離心10 min，棄上清液，取菌體懸浮于人工胃腸液中，37 ℃孵育，分別于0、3 h進(jìn)行活菌計數(shù)。

1.2.7.5 菌株抑菌試驗

分別取大腸桿菌CVCC1527、金黃色葡萄球菌ATCC6538、鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028接種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，調(diào)節(jié)菌懸液的濃度為1.0×108CFU/mL。取100 μL涂布到LB固體培養(yǎng)基，將已滅菌的牛津杯等距放置在平板上，牛津杯中加入菌株ZJ20上清液100 μL，37 ℃培養(yǎng)12 h，測量抑菌圈直徑的大小來判斷受試菌對指示菌的抗菌能力。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 降解AFB1菌株的初分離

樣品中的菌株在香豆素初篩培養(yǎng)基富集后，以AFB1為唯一碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上進(jìn)行分離，根據(jù)菌落形態(tài)不同，初步分離42株對AFB1可能具有降解功能的菌株。

2.2 不同菌株對AFB1降解率測定結(jié)果

初篩的菌株雖對AFB1均有降解能力，但不同樣品來源的菌株的降解率不同，其中對 AFB1降解率>30%的菌株有12株(表1)，降解率>50%的菌株有6株，菌株ZJ20對AFB1的降解率最高，可達(dá)84.23%，因此選擇ZJ20做進(jìn)一步研究。

表1 部分分離菌株對AFB1的降解率Table 1 Degradation rates of AFB1 by isolated strains

2.3 菌株ZJ20形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

菌株ZJ20菌落形態(tài)：白色、不透明、中間凸起、有褶皺、邊緣不整齊；顯微形態(tài)：革蘭氏陽性菌、菌體呈桿狀、中生芽孢(圖1)。

a-菌落形態(tài)；b-顯微形態(tài)圖1 菌株ZJ20的菌落形態(tài)及顯微形態(tài)(1 000×)Fig.1 Colony morphology and microscopic morphology (1 000×) of ZJ20

2.4 菌株ZJ20生理生化鑒定結(jié)果

菌株ZJ20生理生化實驗結(jié)果見表2，該菌株VP試驗、明膠液化試驗陽性；硫化氫試驗、吲哚試驗、硝酸鹽試驗陰性；能夠發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、蔗糖，不用利用乳糖、甘露糖等。對照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》，初步判定ZJ20為枯草芽孢桿菌。

表2 菌株ZJ20的生理生化鑒定結(jié)果Table 2 Biochemical identification results of strain ZJ20

2.5 菌株ZJ20的16S rRNA鑒定結(jié)果

以菌株ZJ20基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳，在約1 500 bp處有1條特異性條帶，與預(yù)期大小相符，見圖2。測序結(jié)果顯示該菌株的16S rRNA 序列長度為1 454 bp，將序列提交GenBank獲得登錄號為SUB10217538。

M-Marker 2 000；1-陰性對照；2-PCR產(chǎn)物圖2 菌株ZJ20的16S rRNA片段PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of 16S rRNA fragment of strain ZJ20

2.6 基于16S rRNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果

將測序結(jié)果與NCBI中已有的16S rRNA序列進(jìn)行BLAST比對，通過MEGA7.0軟件中的“Neighbor-Joining(NJ)”模塊對該序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。由圖3可知，菌株ZJ20與BacillussubtilisYEBN5 MT372156.1在進(jìn)化樹上處于同一個分支，親緣關(guān)系最近，因此，可鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，命名為BacillussubtilisZJ20。

圖3 基于16S rRNA序列的菌株Bacillus subtilis ZJ20系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of Bacillus subtilis ZJ20 based on 16S rRNA sequence

2.7 菌株Bacillus subtilis ZJ20生物學(xué)特性

2.7.1 菌株BacillussubtilisZJ20生長曲線

由圖4可知，BacillussubtilisZJ20生長曲線呈現(xiàn)遲緩期、對數(shù)期和穩(wěn)定期。0～ 4 h是該菌的遲緩期，4～8 h 進(jìn)入對數(shù)生長期，8 h后進(jìn)入細(xì)菌生長穩(wěn)定期。

圖4 Bacillus subtilis ZJ20生長曲線Fig.4 Growth curve of Bacillus subtilis ZJ20

2.7.2 酸耐受性結(jié)果

BacillussubtilisZJ20分別在pH值3.0、4.0、5.0的PBS中培養(yǎng)3 h后，存活率仍能保持在60%以上(圖5)。

圖5 不同pH下Bacillus subtilis ZJ20的耐受能力Fig.5 Tolerance of Bacillus subtilis ZJ20 under different pH

2.7.3 耐膽鹽能力結(jié)果

BacillussubtilisZJ20在1、2、3 g/L牛膽鹽的LB液體培養(yǎng)基中3 h存活率分別為91.56%、77.35%、68.12%(圖6)。

圖6 不同膽鹽濃度下Bacillus subtilis ZJ20的耐受能力Fig.6 Tolerance of Bacillus subtilis ZJ20 under different bile salt concentrations

2.7.4 胃液耐受結(jié)果

BacillussubtilisZJ20在人工胃液中作用3 h后，活菌數(shù)從0 h的6.54×108CFU/mL下降至4.08×108CFU/mL，存活率保持在62.39%以上，說明該菌株能夠耐受胃腸道環(huán)境并保持一定活性。

2.7.5 腸液耐受結(jié)果

BacillussubtilisZJ20在人工腸液中作用后，活菌數(shù)從0 h的7.98×108CFU/mL下降至5.36×108CFU/mL，存活率保持在67.17%以上。將本試驗結(jié)果與劉曉燕等[17]研究的枯草芽孢桿菌WH1抗逆性試驗結(jié)果對比，發(fā)現(xiàn)本試驗菌株耐酸、耐膽鹽能力高于WH1，而耐人工胃液能力稍低于WH1。

2.7.6 抑菌能力結(jié)果

通過牛津杯平板法對BacillussubtilisZJ20進(jìn)行抑菌能力檢測，結(jié)果表明對3株指示菌株均有抑菌效果，且抑菌圈平均直徑在15 mm以上，對鼠傷寒沙門氏菌抑菌效果最好，抑菌圈直徑達(dá)18.36 mm，大腸桿菌的抑菌圈為16.32 mm，金黃色葡萄球菌的抑菌圈為15.75 mm。

3 討論

發(fā)霉飼料原料中的微生物長期處于與黃曲霉毒素共生存中，形成相互制約、相互依賴的微生物系統(tǒng)，長期被霉菌毒素污染的飼料中極可能存在能降解霉菌毒素的菌株[18]。本試驗以霉變的飼料為樣品，以安全的香豆素代AFB1標(biāo)準(zhǔn)品為唯一碳源進(jìn)行AFB1降解菌的篩選，避免了與AFB1過多接觸產(chǎn)生危險，本實驗ELISA復(fù)篩結(jié)果也證明以香豆素為基質(zhì)篩選降解AFB1菌株是切實可行的。

利用芽孢桿菌降解AFB1的研究已有報道，袁遠(yuǎn)等[19]篩選的枯草芽孢桿菌對1 μg/mL的AFB1降解率為68.39%。本試驗篩選的枯草芽孢桿菌對0.5 μg/mL AFB1的降解率為84.23%，與報道菌株降解率不同，一是與菌種不同有關(guān)；二是與菌株本身的降解能力有關(guān)；三是與菌株的降解機(jī)制有關(guān)，一般依靠菌株吸附降解能力有限，而依靠菌株代謝產(chǎn)生降解酶則效率較高；四是與菌株培養(yǎng)條件有關(guān)，如培養(yǎng)時間、溫度、pH值。所以要想得到對AFB1降解效果較好的菌株，必須綜合考慮以上因素。

根據(jù)人和動物胃腸道特性，只有能夠耐受較強(qiáng)酸性和膽鹽環(huán)境的益生菌才能在胃腸道中存活并發(fā)揮其有益的作用。課題接下來實驗設(shè)計是研究AFB1降解菌對肉雞不同階段生長性能的影響，所以有必要研究菌株的抗逆性和抑菌性。耐酸試驗中，篩選的AFB1降解菌能夠耐受通常情況下胃中酸度，說明可通過胃達(dá)到腸道，這為其作為脫毒劑發(fā)揮益生性能起到了先決作用。生長曲線顯示該菌株能夠利用營養(yǎng)成分快速繁殖，符合益生菌的基本特點。人和動物腸道菌群復(fù)雜多樣，除定植有益微生物外，大量有害菌也在腸道中存在，進(jìn)入動物腸道的有益微生物若要較好的發(fā)揮功能必須要抵抗有害菌的抑制作用[20]。本試驗中，BacillussubtilisZJ20菌株上清液對以金黃色葡萄球菌為代表的革蘭氏陽性菌和以大腸桿菌為代表的革蘭氏陰性菌都具良好的抑菌效果，說明該菌可以抵抗動物腸道有害菌的不利影響而發(fā)揮正常的生理功能。

4 結(jié)論

本研究篩選得到1株對AFB1降解率為84.23%的枯草芽孢桿菌，還未對菌株安全性進(jìn)行分析，接下來應(yīng)進(jìn)行動物急性毒性實驗，確定菌株安全性。該菌株未來可能聯(lián)合玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素等降解菌制成飼料脫霉劑或動物解毒劑。大量菌株因不能耐受膽鹽等條件在畜牧生產(chǎn)中應(yīng)用受阻，篩選抗逆性強(qiáng)的微生物在生產(chǎn)中尤為關(guān)鍵，本實驗菌株對酸、膽鹽、胃腸液等環(huán)境具有耐受性，符合制作微生態(tài)制劑的指標(biāo)。該菌對常見病原菌具有抑菌性，作為飼料添加劑還能降低致病菌對動物的損害，有效減少大腸桿菌等引起的腹瀉等疾病?？傊摼亲鳛锳FB1生物降解的有效菌株之一，也是作為活菌飼料添加劑降低飼料中AFB1的良好選擇。