趙亞珠，郝曉秀，劉光發(fā)，高翔

1(天津職業(yè)大學(xué) 包裝與印刷工程學(xué)院，天津，300410)2(天津科技大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院，天津，300457)3(宏觀世紀(jì)(天津)科技股份有限公司，天津，301700)

甜櫻桃因味道甜美營養(yǎng)豐富深受人們喜愛，其營養(yǎng)物質(zhì)有糖分、維生素C、花青素、有機(jī)酸、單寧和黃烷醇等[1]。甜櫻桃原產(chǎn)于歐洲和西亞，現(xiàn)廣泛分布在世界各地[2]。我國甜櫻桃年產(chǎn)量約4.2萬t[3]，在貯藏過程中極易腐爛和軟化[4]。引起甜櫻桃腐爛的因素有微生物、高呼吸、水分損失和軟化，其中微生物是導(dǎo)致甜櫻桃腐爛的重要原因。甜櫻桃主要致腐菌為灰霉、褐腐病菌、枝孢霉、匍枝根霉和青霉病等[5]。目前在甜櫻桃貯藏中常用一些化學(xué)合成殺菌劑，存在一定耐藥性且對人體健康存在安全風(fēng)險，因此，更加安全和綠色的防腐保鮮技術(shù)成為今后研究方向。

部分天然抗菌劑(肉桂精油、牛至精油、殼聚糖)[6-9]對很多食源性致病菌具有較強(qiáng)抑制作用，且對人體安全性較高。TOKATLI等[10]研究了殼聚糖可食用涂膜對甜櫻桃理化和微生物品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)殼聚糖涂層可有效抑制甜櫻桃中總嗜溫需氧菌、酵母和霉菌的生長。ARABPOOR等[11]通過離子凝膠法制備了一種殼聚糖包埋野刺芹(EryngiumcampestreL.)精油的納米顆粒，在甜櫻桃果實(shí)表面涂上一層薄的該涂層可顯著降低甜櫻桃的微生物數(shù)量。張倩等[12]將肉桂精油涂布于吸附紙上，在常溫下對甜櫻桃進(jìn)行熏蒸處理，可抑制甜櫻桃的腐爛?？咕磕こ煞质欠翊嬖谟蛇w移引起的食品安全風(fēng)險，如何提升精油涂布紙的緩釋抑菌效果，仍需進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)以肉桂精油、殼聚糖和埃洛石納米管等為主要原料，采用涂布法制備一種抗菌紙，結(jié)合帶孔隔離紙實(shí)現(xiàn)對甜櫻桃的防腐保鮮應(yīng)用，為果蔬活性包裝材料的研制及應(yīng)用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甜櫻桃，選取當(dāng)天從天津市某果園采摘的外觀、硬度及顏色相近，九成熟的紅燈甜櫻桃。肉桂精油(反式肉桂醛82.2%)，江西恒誠天然香料油有限公司；殼聚糖，青島弘海生物技術(shù)有限公司；埃洛石納米管，靈壽縣南昱礦產(chǎn)品加工廠；聚乙烯(polyethylene，PE)保鮮膜，O2和CO2透過率分別為1.02×104～2.49×104cm3/(m2·d·atm)和0.77×105～1.9×105cm3/(m2·d·atm)，透濕率為17.4～42.6 g/(m2·d)，脫普日用化學(xué)品公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JT-C均質(zhì)機(jī)，漯河市金田試驗(yàn)設(shè)備研究所；GY-3水果硬度計，衢州艾普計量儀器公司；WS114 折光度測試儀，上海測維光電技術(shù)公司；JSM-IT300 LV掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope，SEM)，日本電子株式會社。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 抗菌紙制備

將10 g殼聚糖在90 ℃水浴中攪拌溶解于200 mL蒸餾水，冷卻至60 ℃后依次添加2 mL甘油、2 mL吐溫80，2 000 r/min攪拌3 min，獲得質(zhì)地均勻的殼聚糖溶液。取2 g埃洛石納米管分別與2、4、6、8、10 mL肉桂精油充分混合攪拌，獲得負(fù)載肉桂精油的埃洛石納米管，將其在60 ℃條件下分別加入200 mL殼聚糖溶液中，使肉桂精油體積分?jǐn)?shù)分別為1%、2%、3%、4%、5%，使用均質(zhì)機(jī)10 000 r/min均質(zhì)3 min，隨后倒入燒杯，用PE保鮮膜密封，獲得肉桂精油-埃洛石納米管-殼聚糖涂布乳液。

裁剪尺寸為30 cm×20 cm的食品包裝原紙若干，采用涂布棒將涂布乳液均勻涂布在原紙上，38 ℃烘干，雙層涂布。將肉桂精油體積分?jǐn)?shù)為1%、2%、3%、4%和5%的抗菌紙依次標(biāo)記為T1、T2、T3、T4和T5，原紙為對照組，記為control。各組抗菌紙中涂層厚度為(20±3) μm。

1.3.2 抗菌紙中精油負(fù)載材料的微觀結(jié)構(gòu)表征

為研究抗菌紙中埃洛石納米管對精油的負(fù)載作用，采用SEM觀察埃洛石納米管在負(fù)載肉桂精油前后微觀結(jié)構(gòu)的變化。將肉桂精油和埃洛石納米管按質(zhì)量比1∶1混合、攪拌、研磨后置于60 ℃烘箱干燥24 h。空白埃洛石納米管也按同樣方法干燥24 h。取干燥后的空白埃洛石納米管和負(fù)載肉桂精油的埃洛石納米管置于SEM樣品臺上固定，然后進(jìn)行噴金處理，再采用SEM觀察其微觀結(jié)構(gòu)。

1.3.3 抗菌紙的抑菌性能測試

參考楊玉函等[13]的方法進(jìn)行菌種活化和培養(yǎng)基制備。霉菌和細(xì)菌分別使用PDA和NA培養(yǎng)基，使用無菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌懸液濃度為1×106CFU/mL。將抗菌紙裁切成直徑為25 mm的圓形試樣，紫外滅菌30 min。在培養(yǎng)基表面涂0.1 mL菌懸液，在培養(yǎng)皿蓋中心放置抗菌紙圓形試樣，將培養(yǎng)皿倒置孵化一定時間后測抑菌圈直徑(霉菌28 ℃，48 h；細(xì)菌37 ℃，24 h)。

1.3.4 抗菌紙對甜櫻桃的保鮮處理

稱取100～110 g甜櫻桃，放于聚丙烯(polypropylene，PP)托盤內(nèi)，在甜櫻桃上方依次放1層帶孔隔離紙(孔徑3 mm，孔距5～8 mm)和抗菌紙(原紙為對照組)，隨后纏繞1層PE保鮮膜。將甜櫻桃實(shí)驗(yàn)樣品分為6組，根據(jù)所用原紙/抗菌紙依次記為control、T1、T2、T3、T4和T5，每組設(shè)24個托盤為平行試樣。所有試樣置于室溫條件下[(27±2) ℃，相對濕度(50±10)%)]貯藏7 d，每1 d進(jìn)行1次指標(biāo)測試。

1.3.5 甜櫻桃指標(biāo)測試

感官評價：參考ABDIPOUR等[14]的方法對甜櫻桃進(jìn)行感官評價。選10名經(jīng)培訓(xùn)的消費(fèi)者(5男，5女，年齡18～30歲)為評價員，主要針對甜櫻桃的外觀、顏色、味道、氣味給出整體接受度的打分，采用5分制(5～1分依次代表：優(yōu)、好、較好、較差、差)。腐爛率：腐爛果粒數(shù)與總果粒數(shù)的百分比值。菌落總數(shù)：參照GB4789.2—2016中的方法進(jìn)行，采用PCA瓊脂培養(yǎng)菌落。質(zhì)量損失率：每次測量時甜櫻桃試樣的質(zhì)量損失量與其初始質(zhì)量的百分比值。硬度：采用水果硬度計測定。可溶性固形物：參照NY/T 2637—2014中的方法測試，將甜櫻桃果肉研碎，紗布過濾后取漿汁，采用折射儀測試。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)樣品準(zhǔn)備3個平行樣，用SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析，P< 0.05 差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗菌紙中精油負(fù)載材料的SEM分析

埃洛石是一種具有中空管腔結(jié)構(gòu)的天然納米材料，長度200～1 500 nm，外徑50～75 nm，內(nèi)徑10～30 nm[15]，可高效負(fù)載活性成分，且具有較好的生物相容性。圖1-a為天然埃洛石納米管的SEM圖，為細(xì)長棒狀結(jié)構(gòu)。圖1-b為負(fù)載肉桂精油的埃洛石納米管SEM圖，負(fù)載肉桂精油后埃洛石納米管的形態(tài)發(fā)生了明顯的變化。與圖1-a相比，圖1-b中的所有埃洛石納米管的直徑均明顯變大，呈現(xiàn)出質(zhì)地較均勻的光滑棒狀結(jié)構(gòu)，這是因?yàn)榘Ｂ迨{米管具有中空管腔結(jié)構(gòu)，在負(fù)載肉桂精油之后，埃洛石納米管的微觀形態(tài)發(fā)生了變化。

a-埃洛石納米管；b-負(fù)載肉桂精油的埃洛石納米管圖1 埃洛石納米管及其負(fù)載肉桂精油后的SEM圖Fig.1 SEM image of halloysite nanotubes and halloysite nanotubes loaded with cinnamon essential oil

2.2 抗菌紙對6種供試微生物的抑菌效果

不同濃度肉桂精油抗菌紙對供試微生物的抑菌效果見圖2。在6種供試微生物中，抗菌紙對灰霉抑菌作用最強(qiáng)，肉桂精油體積分?jǐn)?shù)為1%時抑菌圈直徑為36 mm，體積分?jǐn)?shù)為5%時抑菌圈直徑上升至75 mm。5%(體積分?jǐn)?shù))肉桂精油抗菌紙可明顯抑制4種霉菌和金黃色葡萄球菌的生長(圖3)，對青霉、根霉、交鏈孢霉、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑分別是63.8、48.6、41.2、31和25 mm。肉桂精油針對細(xì)菌和霉菌的抑制作用可歸因于破壞細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞重要成分泄漏，破壞細(xì)胞代謝等。ZHANG等[16]研究了負(fù)載肉桂精油的介孔二氧化硅納米粒子針對毛霉屬的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)在添加最低抑菌濃度的肉桂精油-介孔二氧化硅納米粒子后，菌體的細(xì)胞膜通透性、活性氧(reactive oxygen，ROS)含量、可溶性糖和丙二醛含量均發(fā)生明顯變化，細(xì)胞成分發(fā)生滲漏，并伴隨著菌絲形態(tài)被破壞，部分基因被上調(diào)，孢子萌發(fā)和生長被抑制。ZHANG等[17]研究了肉桂精油對大腸桿菌等細(xì)菌的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)最低殺菌濃度的肉桂精油可導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生破壞，致使細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸發(fā)生泄漏，還可引起細(xì)菌代謝活性降低，并發(fā)現(xiàn)與大腸桿菌相比，金黃色葡萄球菌更敏感，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合?？咕垖?種供試霉菌的抑菌圈直徑顯著大于(P<0.05)2種供試細(xì)菌，這說明該抗菌紙更適合于主要致腐菌為上述4種霉菌的食品/農(nóng)產(chǎn)品的防腐保鮮。

圖2 抗菌紙對供試微生物的抑制效果Fig.2 Antimicrobial activity of antimicrobial paper against test microorganisms

a-大腸桿菌；b-金黃色葡萄球菌；c-青霉；d-根霉；e-灰霉；f-交鏈孢霉圖3 精油體積分?jǐn)?shù)為5%的抗菌紙對供試微生物的抑菌圈Fig.3 Inhibition zone of antimicrobial paper against test microorganisms with cinnamon essential oil at concentration of 5% (volume ratio)

2.3 抗菌紙對甜櫻桃防腐保鮮效果的影響

2.3.1 抗菌紙對甜櫻桃感官品質(zhì)的影響

感官品質(zhì)直接影響消費(fèi)者的購買決定[18]，其中氣味是水果中糖、酸和芳香物質(zhì)的結(jié)合，被認(rèn)為是水果最具感官特性的參數(shù)[14]。不同抗菌紙?zhí)幚韺μ饳烟腋泄僭u價分值的影響見圖4。貯藏期間，由于甜櫻桃的外觀、顏色、味道、氣味等發(fā)生改變，所有甜櫻桃試樣的感官分值逐漸降低。在各組試樣中，對照組分值下降速率最快，其原因是微生物的快速繁殖導(dǎo)致甜櫻桃的外觀和氣味出現(xiàn)了不利變化。T1處理組甜櫻桃的感官分值下降趨勢較快，在貯藏3 d后分值降為2.5分，其原因是T1抗菌紙中抗菌成分較少，防腐抑菌作用微弱。在各組試樣中，T4處理組甜櫻桃的感官分值最高，在貯藏6 d后仍為3分，該組甜櫻桃不僅維持了較好的口感和氣味，其外觀質(zhì)量也優(yōu)于其他處理組(圖5)。隨著精油含量的增加，T5處理組甜櫻桃的腐爛高于T4組，這是因?yàn)門5抗菌紙中精油成分含量過高，反而加速了甜櫻桃的腐爛。此前有研究[19]表明當(dāng)抗菌膜中抗菌劑成分超過一定劑量時，抗菌膜對甜櫻桃果皮產(chǎn)生了藥害。在各組試樣中，未觀察到明顯的藥害現(xiàn)象，這是由于在抗菌紙與甜櫻桃之間放置了一層帶孔隔離紙，既能避免甜櫻桃和抗菌紙直接接觸而導(dǎo)致的藥害現(xiàn)象，又能起到防腐保鮮作用。

圖4 抗菌紙?zhí)幚韺μ饳烟腋泄僭u價分值的影響Fig.4 Effect of different antimicrobial paper treatments on sensory evaluation score of sweet cherries during storage

a-control;b-T1;c-T2;d-T3;e-T4;f-T5圖5 貯藏6 d后的甜櫻桃照片F(xiàn)ig.5 Photos of sweet cherries after six days of storage

2.3.2 抗菌紙對甜櫻桃腐爛率的影響

灰霉在貯藏過程中對甜櫻桃造成極大的腐爛損耗[20]。貯藏期間，甜櫻桃腐爛率均逐漸增高(圖6)，其中對照組甜櫻桃的腐爛率最高，貯藏6 d后腐爛率達(dá)50%。T1～T5處理組中甜櫻桃腐爛率顯著低于對照組(P<0.05)，經(jīng)過6 d的貯藏，腐爛率集中在8%～30%，腐爛率從高到底依次為T1、T5、T2、T3、T4處理組。T4處理組甜櫻桃的腐爛率在貯藏4 d后仍為0%，貯藏6 d后僅為8%。結(jié)合感官評價分值，T4抗菌紙可延長甜櫻桃貨架壽命約3 d。T4抗菌紙可明顯降低甜櫻桃的腐爛，其原因是由于肉桂精油對很多食源性致腐微生物具有很強(qiáng)的抑制作用[6]，抗菌紙的抑菌效果數(shù)據(jù)也證實(shí)了該結(jié)論。此前有部分研究工作利用肉桂精油來降低甜櫻桃的腐爛。張倩等[12]將肉桂精油涂布于吸附紙上，在常溫下用于甜櫻桃的防腐保鮮，經(jīng)過6 d貯藏后腐爛率為16.68%，優(yōu)于對照組60.3%的腐爛率。劉光發(fā)等[19]使用肉桂精油和檸檬草精油復(fù)配與聚乙烯醇等原料制備了一種抗菌膜，降低了甜櫻桃的腐爛率。以上研究說明肉桂精油在制備可有效抑制甜櫻桃腐爛的活性材料方面具有很好的潛力。

圖6 抗菌紙對甜櫻桃腐爛率的影響Fig.6 Effect of different antimicrobial paper treatments on decay rate of sweet cherries during storage

2.3.3 抗菌紙對甜櫻桃菌落總數(shù)的影響

貯藏期間，所有甜櫻桃菌落總數(shù)逐漸增高(圖7)，其中對照組增加最快，貯藏6 d后達(dá)4.91 lgCFU/g。T3 和T4 處理組試樣的菌落總數(shù)較低，貯藏6 d后菌落總數(shù)分別為4.09 lgCFU/g和3.7 lgCFU/g。與甜櫻桃腐爛率變化規(guī)律類似，T1和T5處理組的菌落總數(shù)低于對照組，但顯著高于T3和T4處理組(P<0.05)。其原因是抗菌紙涂層中1%(體積分?jǐn)?shù))肉桂精油含量太低，從抗菌紙中釋放的抑菌成分不足以有效抑制甜櫻桃中菌落的生長，而T5處理組中5%(體積分?jǐn)?shù))肉桂精油也無法有效抑制菌落總數(shù)的上升，這是因?yàn)楦邼舛鹊木涂赡軙μ饳烟冶砥ぴ斐蓳p傷。HASSENBERG等[5]也得到類似的結(jié)論，例如采用乙酸蒸氣在20 ℃熏蒸甜櫻桃，當(dāng)乙酸溶液質(zhì)量濃度為9 mg/L時，貯藏5 d后需氧嗜溫細(xì)菌總數(shù)高于3 mg/L和6 mg/L處理組，甚至高于對照組。TOKATLI等[10]發(fā)現(xiàn)可食用殼聚糖涂膜能抑制甜櫻桃中總嗜溫需氧菌、總嗜冷需氧菌、總大腸菌群、酵母菌和霉菌的菌落數(shù)量。本研究表明抗菌紙中活性成分的添加劑量需針對被包裝產(chǎn)品進(jìn)行定量研究。

圖7 抗菌紙對甜櫻桃菌落總數(shù)的影響Fig.7 Effect of different antimicrobial paper treatments on total viable count of sweet cherries during storage

2.3.4 抗菌紙對甜櫻桃質(zhì)量損失率的影響

質(zhì)量損失率是衡量水果保鮮程度的一項(xiàng)重要指標(biāo)[11]。水果在貯藏期間的質(zhì)量損失主要是由于蒸騰作用和呼吸過程引起的水分流失[21]造成的，因此果皮的質(zhì)地特性對質(zhì)量損失率起著重要作用[22]。各處理組甜櫻桃質(zhì)量損失率隨貯藏時間的變化見圖8。所有處理組中甜櫻桃的質(zhì)量損失率都隨著時間的延長而增加，T5處理組和對照組樣品比其他組樣品擁有相對較高的質(zhì)量損失率，其中T5組試樣的質(zhì)量損失率最高(3.39%)，甚至高于對照組(3.11%)。與對照組相比，T1～T4組試樣的質(zhì)量損失率較低，其中T4組質(zhì)量損失率最低，貯藏6 d后僅為2.04%。其原因可能是T4抗菌紙中抗菌劑的劑量可較好地保持甜櫻桃的果皮質(zhì)地屬性。此前也有文獻(xiàn)報道采用抗菌劑熏蒸方式抑制甜櫻桃質(zhì)量損失率的上升，例如BOZKURT等[22]采用汽化的丙酮酸乙酯可有效減少各測試組甜櫻桃樣品的質(zhì)量損失。

圖8 抗菌紙對甜櫻桃質(zhì)量損失率的影響Fig.8 Effect of different antimicrobial paper treatments on weight loss of sweet cherries during storage

2.3.5 抗菌紙對甜櫻桃硬度的影響

硬度可反映甜櫻桃的組織結(jié)構(gòu)，是體現(xiàn)甜櫻桃果實(shí)新鮮度的主要參數(shù)[11]。如圖9所示，甜櫻桃的初始硬度為2.45 kg/cm2，在整個貯藏期間所有甜櫻桃試樣的硬度逐漸降低，其中對照組下降最明顯，貯藏6 d后硬度僅為1.79 kg/cm2。合適劑量的活性抗菌紙可以延緩甜櫻桃果實(shí)的軟化，經(jīng)T2、T3和T4抗菌紙?zhí)幚淼奶饳烟以谫A藏6 d后硬度分別為2.23、2.27和2.29 kg/cm2，顯著高于對照組(P< 0.05)。ABDIPOUR等[14]采用紫外線處理甜櫻桃也出現(xiàn)了延緩甜櫻桃果實(shí)軟化的現(xiàn)象。這是因?yàn)樯锘钚曰衔锟梢砸种乒麑?shí)軟化過程，從而維持甜櫻桃細(xì)胞壁的穩(wěn)定性[21]。然而T1和T5抗菌紙對于維持甜櫻桃硬度并不明顯，其原因是T1抗菌紙中抗菌劑成分太少對于抑制果實(shí)軟化作用不明顯，而T5抗菌紙中高濃度的抑菌劑影響了甜櫻桃果實(shí)表皮的組織結(jié)構(gòu)，進(jìn)而造成了果實(shí)硬度的下降。

圖9 抗菌紙對甜櫻桃硬度的影響Fig.9 Effect of different antimicrobial paper treatments on firmness of sweet cherries during storage

2.3.6 抗菌紙對甜櫻桃可溶性固形物的影響

可溶性固形物是與消費(fèi)者接受度和水果質(zhì)量相關(guān)的重要屬性[23]。葡萄糖、果糖、山梨糖醇和蔗糖是甜櫻桃中可溶性固形物的主要糖類化合物[24]。各組甜櫻桃可溶性固形物含量在貯存期間顯示出上升趨勢(圖10)。甜櫻桃在貯存期間往往會顯示可溶性固形含量物增加的趨勢[25]，可溶性固形物的增加與失水、成熟或軟化過程有關(guān)，而這又是由于酶活性增加和膨壓降低所致[14]。各組樣品可溶性固形物數(shù)值位于13.0～15.0，抗菌紙對甜櫻桃可溶性固形物的變化沒有顯著作用。SHARMA等[26]用己醛和甲基環(huán)丙烯噴灑甜櫻桃，也未引起可溶性固形物的變化。焦中高等[27]采用短波紫外線輻照甜櫻桃也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象，紫外線對甜櫻桃進(jìn)行殺菌處理未能引起可溶性固形物的顯著變化。

圖10 甜櫻桃可溶性固形物的變化Fig.10 Changes in total soluble solids of sweet cherries during storage

3 結(jié)論

埃洛石納米管可對肉桂精油進(jìn)行有效負(fù)載，負(fù)載肉桂精油后的埃洛石納米管直徑均明顯變大，呈現(xiàn)光滑棒狀結(jié)構(gòu)?？咕埧娠@著抑制4種霉菌的生長，當(dāng)肉桂精油體積分?jǐn)?shù)≥2%時抑菌圈直徑≥26 mm?？咕垖?種供試細(xì)菌的抑制作用相對較弱。與對照組相比，肉桂精油體積分?jǐn)?shù)為4%的抗菌紙可顯著延緩甜櫻桃腐爛率和菌落總數(shù)的上升趨勢，可減少甜櫻桃的質(zhì)量損失，能較好地保持甜櫻桃感官品質(zhì)和硬度，可延長甜櫻桃貨架壽命約3 d。由于在抗菌紙與甜櫻桃之間放置了一層帶孔隔離紙，所有甜櫻桃均未觀察到抗菌劑引起的明顯藥害作用。本實(shí)驗(yàn)制備的抗菌紙還可應(yīng)用至其他果蔬的防腐保鮮。針對被包裝產(chǎn)品探尋抗菌劑的最佳使用量，提升持久緩釋抑菌效果，以及實(shí)施多種保鮮技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用將是今后果蔬防腐保鮮的研究重點(diǎn)。