衛(wèi)子顏，謝勇，王朦朦，蔡夢思，唐蘭蘭，劉雄

(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)

據(jù)統(tǒng)計(jì)，稻谷是我國的第二大糧食作物，其中2019年產(chǎn)量為1.078 7億t[1]。米糠是稻米加工的副產(chǎn)物，是米粒(胚乳)的表皮、胚和一些淀粉質(zhì)胚乳的混合物，約占稻谷重量的10%，含有豐富的不飽和脂肪酸、膳食纖維、礦物質(zhì)及多酚等營養(yǎng)成分[2]。研究表明，米糠中的多酚含量達(dá)4.13 mg GAE/g[3]，多酚種類主要包括阿魏酸、對香豆酸、香草醛、咖啡酸、香豆酸等，具有較好的抗氧化活性；此外，這些酚類物質(zhì)能通過調(diào)節(jié)腸道菌群的構(gòu)成及腸道酶的活性有效改善胃腸健康[4]、通過抑制NF-κB等信號通路來減輕炎癥保護(hù)心肌細(xì)胞[5]、預(yù)防結(jié)腸癌等疾病[6]。然而，由于米糠的口感較粗糙且不易消化，大部分被用作飼料或直接被丟棄，造成了米糠資源的浪費(fèi)。

超微粉碎是一種高效、綠色的食品加工技術(shù)，通過機(jī)械或流體動(dòng)力學(xué)的方法將原料加工為微米級甚至是納米級，減小原料的粒徑，不僅可以改善原料的理化、功能、食用特性，還可促進(jìn)原料中營養(yǎng)物質(zhì)、生物活性組分的釋放和吸收[7-8]。CHAIT等[9]、蔡婷等[10]發(fā)現(xiàn)超微粉碎處理能顯著提高角豆、苦蕎中多酚類物質(zhì)的含量及抗氧化能力。目前，超微粉碎技術(shù)應(yīng)用于米糠的研究大部分體現(xiàn)在理化及功能性質(zhì)方面[11-12]，而對米糠中多酚的組成及功能活性影響的關(guān)注甚少。例如，WANG等[13]研究了米糠中結(jié)合酚類化合物的組成及抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)結(jié)合酚中的酚酸主要有阿魏酸、香草醛和對羥基苯甲酸等，張媛等[14]探究了超微粉碎對脫脂小米米糠抗氧化性的影響，發(fā)現(xiàn)微粉粒徑的大小與其抗氧化能力呈負(fù)相關(guān)性，但對超微粉碎處理對米糠中多酚組成和抗氧化活性之間的相關(guān)性未進(jìn)行深入的探討。另外，鮮有人關(guān)注加工對米糠多酚在消化道的釋放的影響。

因此，本研究將米糠進(jìn)行超微粉碎處理，探究超微粉碎對米糠中酚類化合物的含量及組成、DPPH自由基清除力、ABTS陽離子自由基清除力、鐵離子還原能力(ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP)以及體外胃腸釋放度的影響，并分析米糠多酚的含量、組成與抗氧化能力之間的相關(guān)性，以期建立超微粉碎對米糠多酚類成分的影響規(guī)律，為米糠的深加工研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米糠，湖北省恩施市新塘鄉(xiāng)；標(biāo)準(zhǔn)品沒食子酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、咖啡酸、對香豆酸、香草醛、香草酸、阿魏酸、槲皮素，北京邁瑞達(dá)科技有限公司；水溶性維生素E標(biāo)準(zhǔn)品、ABTS、DPPH、福林酚試劑，北京索萊寶科技有限公司；胃蛋白酶、胰酶、膽鹽，美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BJ-300型高速多功能粉碎機(jī)，上海拜杰實(shí)業(yè)有限公司；CJM-SY-B高能納米沖擊磨，秦皇島市太極環(huán)納米制品有限公司；BIOTEK型酶標(biāo)儀，美國基因公司；AXTG16G離心機(jī)，鹽城市安信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SHZ-88型水浴振蕩器，朗越儀器制造公司；LC-20A高效液相色譜儀，日本島津公司；Mastersizer 3000激光粒度儀，英國馬爾文公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 超微脫脂米糠粉的制備

將新鮮米糠用乙醇進(jìn)行脫脂處理，烘干后過60目篩，得到粗粉；使用BJ-300型粉碎機(jī)粉碎粗粉2 min，得到微粉A；使用高能納米沖擊磨粉碎粗粉，得微粉B。用Mastersizer 3000激光粒度儀測得粗粉、微粉A、微粉B的平均粒徑分別為208.3、85.7、14.9 μm，裝袋密封，于-18 ℃冰箱保藏備用。

1.3.2 米糠游離態(tài)酚、結(jié)合態(tài)酚的提取

米糠游離酚、結(jié)合酚的提取參考文獻(xiàn)[15]的方法并稍做修改，稱取1.5 g米糠與50 mL預(yù)冷丙酮溶液(80%，體積分?jǐn)?shù))混合，超聲提取30 min后，以8 000×g離心10 min，重復(fù)3次，合并上清液并在45 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸干，用甲醇定容至10 mL，-18 ℃保存。將提取完游離酚后的殘?jiān)谑覝叵录尤? mol/L的NaOH溶液40 mL，充入N2，避光振蕩1 h，用6 mol/L的HCl溶液將pH調(diào)至2.0，加入40 mL乙酸乙酯，混勻，重復(fù)5次，合并上清液在45 ℃下旋蒸，用甲醇定容至10 mL，即得結(jié)合態(tài)多酚，-18 ℃保存。

1.3.3 總酚含量的測定

參考SINGLETON等[16]的方法，并略做修改。用Folin-Ciocalteu法進(jìn)行測定，以沒食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 HPLC法檢測米糠中的酚類物質(zhì)

取樣品溶液過0.22 μm濾膜，用日本島津LC-20A HPLC儀檢測多酚組成。色譜條件：色譜柱為Thermo-C18(150 mm×4.6 mm，3 μm)、流動(dòng)相流速為0.7 mL/min、柱溫30 ℃、進(jìn)樣量10 μL、檢測波長為280；流動(dòng)相A相：0.4%乙酸水溶液，B相：乙腈。梯度洗脫程序：5%B (0 min)，25%B (0～40 min)，35%B (40～45 min)，50%B (45～50 min)，5%B (50～55 min)。以沒食子酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、咖啡酸、對香豆酸、香草醛、香草酸、阿魏酸、槲皮素為標(biāo)準(zhǔn)品，混標(biāo)進(jìn)樣，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得各標(biāo)準(zhǔn)品的線性方程，計(jì)算提取液中的主要酚類物質(zhì)含量。圖1為9種混合多酚標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖，表1為各標(biāo)準(zhǔn)品峰面積與質(zhì)量濃度之間的回歸方程。

1-沒食子酸；2-原兒茶酸；3-對羥基苯甲酸；4-香草酸；5-咖啡酸；6-香草醛；7-對香豆酸；8-阿魏酸；9-槲皮素圖1 多酚混合標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatogram of standard mixture

表1 九種標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程Table 1 Regression equations of nine standard substances

1.3.5 體外抗氧化活性測定

1.3.5.1 DPPH自由基清除力測定

參考ROY等[17]的方法，將樣品稀釋20倍，向1 mL待測樣品中加入48 mg/L的DPPH溶液2 mL，混勻，在室溫下避光反應(yīng)30 min，測定517 nm處的吸光度。以Trolox為參照，結(jié)果以每100 g多酚提取物(以干基計(jì))所對應(yīng)的Trolox當(dāng)量表示(μmol Trolox/100g)。

1.3.5.2 ABTS陽離子自由基清除力測定

參考徐洪宇等[18]的方法測定。取0.1 mL待測溶液與2.9 mL ABTS陽離子自由基稀釋液混合，于黑暗處30 ℃反應(yīng)10 min，并在734 nm下測定其吸光度。以去離子水作空白，結(jié)果以每100 g多酚提取物(以干基計(jì))所對應(yīng)的Trolox當(dāng)量表示(μmol Trolox/100g)。

1.3.5.3 FRAP測定

根據(jù)中國南京生物工程研究所提供的試劑盒的要求進(jìn)行測定。酚類樣品將Fe3+還原為Fe2+，在測定過程中，F(xiàn)e2+與菲咯啉類物質(zhì)反應(yīng)生成絡(luò)合物。記錄520 nm處的吸光度，結(jié)果以每克多酚提取物(以干基計(jì))所還原的Fe2+當(dāng)量表示(μmol Fe2+/g)。

1.3.6 體外模擬胃、腸消化

參考SUN等[19]的方法稱取0.5 g米糠粉，加入50 mL胃液，混勻后，在37 ℃水浴中水平振蕩(150 r/min)消化1 h，然后將所得的消化物以4 000 r/min離心10 min，取5 mL上清液作為胃消化液，-20 ℃貯存。剩余消化液用10% NaOH溶液調(diào)至pH為7.0，然后加入5 mL腸液，混勻，在37 ℃水浴中水平振蕩(150 r/min)消化4 h，然后將所得的消化物以4 000 r/min離心10 min，取5 mL上清液作為腸消化液，-20 ℃貯存。

1.3.7 多酚化合物的體外釋放度

參考YOU等[20]的方法計(jì)算酚的體外釋放度，模擬體外胃腸消化后酚的釋放度按公式(1)計(jì)算。

(1)

式中：A是在體外消化后樣品中的總酚含量，mg；B是體外消化前樣品中的總酚含量，mg。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

本研究中每個(gè)試驗(yàn)均重復(fù)進(jìn)行3次，采用Microsoft Excel 2019 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)、SPSS 25.0分析顯著性、Origin 2018軟件作圖，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 超微粉碎對米糠多酚含量的影響

超微粉碎后米糠的多酚含量變化如表2所示，2種微粉的游離酚、總酚含量均顯著高于粗粉(P<0.05)，而結(jié)合酚含量則低于粗粉組。與粗粉相比，微粉A、B的總酚含量分別增加了2.30%、5.21%。超微粉碎處理顯著提高了米糠多酚等營養(yǎng)物質(zhì)的溶出，這與趙萌萌等[21]報(bào)道超微粉碎后青稞麩皮中多酚含量增加的結(jié)果一致。一方面是由于超微粉碎處理使米糠的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)被破壞，米糠粉體的蛋白質(zhì)、膳食纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化、細(xì)化，細(xì)胞內(nèi)部的成分溶出的阻力減小，從而使米糠中酚類物質(zhì)的溶出率提高；另一方面，超微粉碎處理增大了米糠粉體的孔隙率以及與提取溶劑的接觸面積，使提取更充分，從而增加了微粉多酚提取物的含量。而超微粉碎處理后結(jié)合酚的含量均有所降低，這與TAO等[22]發(fā)現(xiàn)超微粉碎柑橘皮渣中結(jié)合酚含量下降18.0%的結(jié)果類似。這可能是機(jī)械化作用及粉碎過程中的熱效應(yīng)可使多酚與細(xì)胞壁物質(zhì)之間的共價(jià)作用或非共價(jià)作用解除，結(jié)合酚與細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)成分如纖維素、木質(zhì)素等之間的酯鍵、糖苷鍵部分?jǐn)嗔眩鴮?dǎo)致結(jié)合態(tài)多酚向游離態(tài)多酚轉(zhuǎn)化[23]。

表2 超微粉碎處理的米糠中多酚含量 單位:mg GAE/g

2.2 超微粉碎處理對米糠多酚組成的影響

超微粉碎后米糠中酚類物質(zhì)(游離型、結(jié)合型)的主要成分與含量如表3所示。

表3 超微粉碎處理的米糠中多酚的組成及含量 單位:μg/g

超微粉碎處理對米糠中酚類物質(zhì)的組成及含量均有一定影響，且粗粉、微粉A、微粉B的總酚類物質(zhì)含量差異顯著(P<0.05),分別為1 466.97、1 620.44、1 666.11 μg/g。米糠中提取出的酚類物質(zhì)主要有原兒茶酸、香草酸、對香豆酸、香草醛、阿魏酸，其中游離酚以香草酸、香草醛、對香豆酸、阿魏酸為主，結(jié)合酚以香草醛、對香豆酸、阿魏酸為主。阿魏酸含量最多，達(dá)1 234.53 μg/g，是米糠結(jié)合酚中最主要的酚酸，只有少量的對羥基苯甲酸、咖啡酸。不同粉碎方式對米糠提取物中多酚組分有一定影響，超微粉碎處理后游離酚中原兒茶酸、香草醛、阿魏酸含量明顯增加，結(jié)合酚中對香豆酸、阿魏酸含量明顯增加。由于本實(shí)驗(yàn)選用的標(biāo)準(zhǔn)品種類以及檢測條件有限，米糠多酚提取物中還存在未檢出的單體酚類化合物。如WANYO等[24]從米糠多酚提取物中除檢出原兒茶酸、對香豆酸、阿魏酸，還檢測出丁香酸和芥子酸。ZHANG等[25]在米糠多酚提取物中還檢出山萘酚、異阿魏酸。

2.3 超微粉碎處理對米糠多酚抗氧化活性的影響

如圖2所示，米糠粗粉及2種微粉的多酚提取物均有一定的抗氧化活性，且微粉組的抗氧化活性顯著高于粗粉(P<0.05)。米糠粉體的DPPH自由基清除力(圖2-a)、ABTS陽離子自由基清除力(圖2-b)、FRAP(圖2-c)均隨粉碎粒度的減小而逐漸增大，其中微粉B的多酚提取物具有最高的抗氧化能力。相較于粗粉，微粉B多酚的DPPH自由基清除力、ABTS陽離子自由基清除力、FRAP分別增加了33.21%、22.88%、30.11%。一方面可能是因?yàn)槊卓肺⒎鄣牧皆叫。M織被破碎的程度越徹底，多酚等抗氧化物質(zhì)與提取溶劑的接觸面積增大，更易于溶出，使粉體的抗氧化活性提高；另一方面可能是超微粉碎處理后米糠粉體中的多酚組成發(fā)生了變化，微粉中抗氧化性較強(qiáng)的酚酸，如對香豆酸、阿魏酸等含量增加[26]，從而增強(qiáng)了粉體的抗氧化能力。

a-DPPH自由基清除力；b-ABTS陽離子自由基清除力；c-FRAP還原能力圖2 超微粉碎處理對米糠多酚抗氧化活性的影響Fig.2 Effect of ultrafine grinding treatment on the antioxidant activity of rice bran polyphenols注：字母a、b、c表示差異顯著(P<0.05)

2.4 米糠酚類物質(zhì)含量與抗氧化活性之間的相關(guān)性分析

為進(jìn)一步明確米糠中的酚類物質(zhì)含量與其抗氧化活性的關(guān)系，進(jìn)行相關(guān)性分析。由表4可知，米糠中的總酚含量與DPPH、ABTS、FRAP法測定的抗氧化活性均呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，其相關(guān)系數(shù)分別為0.989、0.997、0.986。米糠中多酚含量越高，其清除自由基的能力越強(qiáng)，說明米糠酚類提取物中含有豐富的抗氧化物質(zhì)。對香豆酸、阿魏酸、香草醛與米糠多酚提取物的DPPH自由基清除力、ABTS陽離子自由基清除力、FRAP成顯著正相關(guān)(P<0.05)，說明對香豆酸、阿魏酸、香草醛是米糠多酚提取物中抗氧化的主要貢獻(xiàn)物質(zhì)，這與ZHAO等[27]報(bào)道的米糠多酚中對香豆酸、阿魏酸是清除自由基能力的主要貢獻(xiàn)物質(zhì)的結(jié)果一致，可能是由于對香豆酸、阿魏酸在米糠多酚中有較高的含量。

2.5 體外模擬胃腸消化過程中米糠總酚的含量及釋放度

酚類要在人體內(nèi)發(fā)揮健康益處，前提是它們可以通過胃腸道被吸收和代謝，最終在特定組織或器官上起作用，發(fā)揮其健康益處。在消化過程中，大多數(shù)游離酚的釋放主要發(fā)生在上消化道，而結(jié)合酚主要通過腸道酶和微生物酶的作用在較低的消化道中，破壞結(jié)合酚與細(xì)胞壁之間的共價(jià)鍵來釋放結(jié)合酚[28]。由表5可知，米糠中的總酚含量在經(jīng)過體外模擬胃腸道消化后，呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢，這與朱秀靈等[29]關(guān)于蘋果中的酚類化合物體外消化的研究結(jié)果相似，說明胃腸消化會使酚類化合物發(fā)生降解或者轉(zhuǎn)換，從食物基質(zhì)中釋放出來。且腸道消化期間酚類化合物的釋放量增加，可能是由于腸酶和膽汁鹽的作用，使與基質(zhì)結(jié)合的酚類化合物得到釋放。酚類物質(zhì)的體外消化釋放度隨米糠粒徑的減小而逐漸增加，與粗粉相比，微粉A、B的體外釋放度分別提高了2.61%、7.31%。這可能是因?yàn)槌⒎鬯楹蟮拿卓妨皆叫?，比表面積越大，從而增強(qiáng)了細(xì)胞壁中的多酚與胃腸消化液之間的相互作用，促進(jìn)多酚的釋放。此外，超微粉碎會使糊粉細(xì)胞破裂，改變了食物基質(zhì)中酚類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)特性，及其與蛋白質(zhì)、多糖等成分的相互作用，使多酚更具有生物可及性[30]。

表4 米糠中酚類物質(zhì)含量與體外抗氧化活性的相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis of phenolic substances in rice bran and antioxidant activity in vitro

表5 體外胃腸消化后米糠中酚類化合物的釋放度 單位：mg GAE/g樣品

3 結(jié)論

(1)米糠經(jīng)超微粉碎處理后，其多酚提取物含量均顯著增大(P<0.05)。與粗粉相比，微粉A、B的多酚提取物含量分別增加了2.30%、5.21%，微粉B(粒徑為14.9 μm)的多酚提取物含量最高，為(5.113±0.012) mg GAE/g。米糠中的酚類物質(zhì)主要有原兒茶酸、香草酸、香草醛、對香豆酸、阿魏酸，其中游離酚以香草酸、香草醛、對香豆酸、阿魏酸為主，結(jié)合酚以香草醛、對香豆酸、阿魏酸為主。超微粉碎處理后游離酚中原兒茶酸、香草醛、阿魏酸含量明顯增加，結(jié)合酚中對香豆酸、阿魏酸含量明顯增加。

(2)2種微粉(粒徑分別為85.7、14.9 μm)的抗氧化活性(DPPH自由基清除力、ABTS陽離子自由基清除力、FRAP)均顯著優(yōu)于粗粉(粒徑為208.3 μm)(P<0.05)，且米糠粉體的粒徑越小，其抗氧化活性越強(qiáng)。

(3)米糠中的多酚含量與DPPH、ABTS、FRAP法測定的抗氧化活性均呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。米糠酚類提取物中香草醛、對香豆酸、阿魏酸是清除DPPH自由基、ABTS陽離子自由基、還原Fe3+的主要貢獻(xiàn)物質(zhì)。微粉A、B的體外釋放度分別提高了2.61%、7.31%。

以上表明，超微粉碎技術(shù)既減小了米糠粉體的粒徑，一定程度上提高了酚類物質(zhì)的溶出率、體外抗氧化活性、體外釋放度。然而，本研究中體外消化實(shí)驗(yàn)不包括結(jié)腸發(fā)酵階段，需要通過結(jié)腸發(fā)酵模型來完整地模擬米糠中多酚化合物在體內(nèi)的吸收和代謝，才能更好地評價(jià)其生物體外釋放及生物利用情況，為探究米糠的功能特性提供科學(xué)依據(jù)。