張國偉，馬俊華，梁玉景，王召君，曾茂茂，陳潔，秦昉，何志勇*

1(食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)2(山東華信制藥集團股份有限公司，山東 菏澤，274000)

免疫系統(tǒng)是一種宿主防御系統(tǒng)，其作用是清除病原體。免疫系統(tǒng)分為固有免疫和獲得性免疫系統(tǒng)。固有免疫通過皮膚、黏膜組織、骨髓或炎癥成分(細胞因子、干擾素等)筑人體抵抗病原體入侵的第一道防線[1]。巨噬細胞在固有免疫中發(fā)揮著重要作用，它可以吞噬和消化病原微生物，介導(dǎo)和促進炎癥，以及加工和呈遞抗原[2]?；罨木奘杉毎梢葬尫哦喾N炎癥因子和細胞因子，調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫反應(yīng)[2]，從而抵御病原體入侵，保護機體免受侵害，因此巨噬細胞的激活是機體提高免疫力、保護自身健康的重要途徑。

阿膠是一種重要的藥食同源資源，在我國的生產(chǎn)歷史悠久，藥用歷史已有2 000多年。阿膠的主要成分為蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖類和微量元素，其中，蛋白質(zhì)含量高達70%以上[3]。相關(guān)研究表明，阿膠具有一系列的藥理學(xué)功能，有免疫調(diào)控、補血升白、抗氧化、抗衰老等功效。在免疫調(diào)控方面，有研究表明，阿膠可以改善免疫缺陷小鼠的固有免疫和適應(yīng)性免疫[4]，也有學(xué)者研究了阿膠對于5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的貧血小鼠免疫的調(diào)控作用，發(fā)現(xiàn)阿膠可以增加外周白細胞和紅細胞數(shù)量，對小鼠免疫細胞具有保護作用[5]。

阿膠主要由驢皮經(jīng)熬煮、濃縮制作而成，在驢皮的化膠過程中，其主要成分膠原蛋白會發(fā)生聚集和降解而形成不同分子質(zhì)量分布的阿膠蛋白組分，其分子質(zhì)量大多在10 kDa以上。膠原蛋白聚集和降解程度與驢皮熬煮加工溫度和時間等條件密切相關(guān)[6]，并且阿膠制作過程中膠原蛋白也會和糖類發(fā)生美拉德反應(yīng)。然而，阿膠中蛋白組分免疫活性與其分子質(zhì)量的關(guān)系并不明確，通過明確阿膠中強免疫活性的蛋白分子質(zhì)量組成，可以調(diào)控阿膠熬煮加工過程的條件，制造出免疫調(diào)節(jié)功能強的阿膠產(chǎn)品，對于優(yōu)質(zhì)阿膠的生產(chǎn)加工具有重要意義。因此，本文以RAW264.7小鼠巨噬細胞系為模型，研究阿膠不同分子質(zhì)量組分對RAW264.7 細胞的活化作用，進一步探究免疫活性強的蛋白組分對RAW264.7細胞活化的機制，從而評價阿膠的免疫調(diào)節(jié)作用，以期為高免疫活性阿膠產(chǎn)品的加工制造提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

阿膠，山東華信制藥集團提供；RAW264.7細胞，中國科學(xué)院細胞庫；DMEM高糖細胞培養(yǎng)液，美國Gibco；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)，長沙賽爾博克斯生物科技有限公司；白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測試劑盒、Western blot試劑盒，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；Trizol試劑盒、MTT試劑盒、NO檢測試劑盒和活性氧熒光探針(2′, 7′-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA)，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；GAPDH內(nèi)參引物、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR引物，上海生工生物工程；HRP標記兔抗小鼠一抗、HRP 標記山羊抗兔二抗，美國Cell signal technology；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 阿膠不同分子質(zhì)量組分的制備及其蛋白質(zhì)含量和分子質(zhì)量分布測定

脫脂：配制質(zhì)量濃度為50 g/L的阿膠溶液，使用2倍體積的石油醚于分液漏斗內(nèi)進行脫脂，重復(fù)3次，脫脂后，8 000 r/min離心10 min，取上清液，獲得阿膠脫脂液。分級：配制20 g/L的牛血清白蛋白、雞卵白蛋白、碳酸酐酶、肌紅蛋白、抑肽酶溶液，用Superdex 75pg 進行分子質(zhì)量標準曲線測定，以出峰時間為x軸，分子質(zhì)量的對數(shù)值為y軸，測定分子質(zhì)量出峰時間標準曲線，然后根據(jù)標準將阿膠脫脂液使用50 mmol/L pH=7.0的磷酸鹽緩沖溶液于AKTA pure蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)進行分級，分離獲得<10 kDa、10～30 kDa、>30 kDa 3種不同分子質(zhì)量的阿膠組分溶液。透析：將獲得的不同分子質(zhì)量的阿膠脫脂液分裝于透析袋(1 kDa)中，超純水4 ℃透析48 h，冷凍干燥后備用，分別命名為F1、F2、F3。

蛋白質(zhì)含量測定：采用雙縮脲法[7]測定樣品蛋白質(zhì)含量。稱取6 g酒石酸鈉，1 g碘化鉀，1.5 g硫酸銅，依次攪拌溶入約500 mL水中，然后和300 mL 10%的氫氧化鈉混合，最后用水稀釋定容到1 000 mL得到雙縮脲試劑，1 mL樣品溶液與4 mL雙縮脲試劑混合后在30 ℃水浴20 min后，測定其在540 nm處的吸光值，以牛血清白蛋白為標準物測定標準曲線。

采用HPLC測定分子質(zhì)量分布[8]：流動相，PBS緩沖液(0.2 mol/L，pH=7.0，0.3 mol/L NaCl)；進樣體積10 μL；運行時間10 min；檢測波長220 nm。以桿菌肽、抑肽酶、細胞色素C、肌紅蛋白、甲狀腺球蛋白為標準物質(zhì)測定以出峰時間為x值，分子質(zhì)量的對數(shù)為y值的標注曲線。

1.2.2 RAW264.7細胞培養(yǎng)

將原代RAW264.7加入DMEM 高糖完全培養(yǎng)基(含5% FBS)中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底部80%時進行傳代，當培養(yǎng)至第3代細胞穩(wěn)定生長時，將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.3 阿膠分離組分F1、F2、F3對RAW264.7細胞活性及刺激細胞釋放NO及TNF-α的含量

細胞活性的測定參照文獻[9]方法，取對數(shù)生長期的RAW264.7細胞，以2×104個/孔(96孔板)的密度鋪板，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，PBS洗去未貼壁細胞，然后1 000 mg/L的阿膠分離組分的DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后，吸去培養(yǎng)液，加入10 μL MTT溶液和90 μL DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)孵育4 h后，吸去培養(yǎng)液，加入150 μL 二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，振蕩10 min后，使用酶標儀檢測在490 nm處的吸光值。以10 μg/mL脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)處理的細胞作為陽性對照。細胞活力計算如公式(1)所示：

(1)

參照文獻[10]方法，取對數(shù)生長期的RAW264.7細胞，以2×104個/孔(96孔板)的密度鋪板，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，PBS洗去未貼壁細胞，然后含有一系列質(zhì)量濃度(1 000、500、250、125、62.5 mg/L)阿膠分離組分的DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，取細胞培養(yǎng)上清液，根據(jù)試劑盒說明書采用Griess法測定NO濃度，細胞培養(yǎng)液中的TNF-α含量根據(jù)ELISA試劑盒說明書測定。

1.2.4 阿膠分離組分F2對RAW264.7細胞的免疫增強作用

1.2.4.1 MTT法檢測細胞活性

參照1.2.3中的方法測定1 000、500、250、125、62.5 mg/L的F2組分對RAW264.7巨噬細胞活性的影響。

1.2.4.2 活性氧(reactive oxygen species,ROS)和IL-6釋放量的測定

ROS的測定方法[11]：取對數(shù)生長期的RAW264.7細胞，以2×105個/孔(12孔板)的密度鋪板，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，PBS洗去未貼壁細胞，以不同濃度的F2處理細胞24 h，吸去上清液，加入1 mL PBS，收集細胞，使用熒光分光光度計在激發(fā)波長和發(fā)射波長分別在488 nm和525 nm處測定熒光值。以10 mg/L LPS處理的細胞作為陽性對照。ROS釋放量計算如公式(2)所示：

(2)

IL-6的測定方法參見1.2.3中TNF-α含量測定。

1.2.5 實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，q-PCR)檢測免疫相關(guān)基因的表達情況

參照文獻[9]方法進行實驗。取對數(shù)生長期的RAW264.7細胞，以2×105個/孔(12孔板)的密度鋪板，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，PBS洗去未貼壁細胞，以不同濃度的F2處理細胞24 h，吸去上清液，冰浴，加入1 mL Trizol試劑，裂解細胞，根據(jù)試劑盒說明書提取細胞mRNA，然后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒完成反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。引物合成由上海生工生物工程公司完成，引物序列如表1所示，q-PCR反應(yīng)體系及條件均按照試劑盒說明書條件進行操作，測定TNF-α、IL-6、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶( inducible nitric oxide synthase ，iNOS)、Toll樣受體 4(Toll-like receptor 4,TLR4)和內(nèi)參GAPDH的基因轉(zhuǎn)錄情況。

表1 q-PCR目的基因引物序列Table 1 The primer sequence of q-PCR target gene

1.2.6 阿膠分離組分F2對RAW264.7細胞內(nèi)MAPK信號通路的影響

參照文獻[9]方法進行實驗。取對數(shù)生長期的RAW264.7細胞，以2×105個/孔(12孔板)的密度鋪板，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，PBS洗去未貼壁細胞，以1 000 mg/L的F2處理細胞4、8、16 h后，收集細胞，按照試劑盒說明說提取細胞蛋白質(zhì)。采用Western-blot方法檢測絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路相關(guān)蛋白的表達情況。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析

所有實驗數(shù)據(jù)采用Statistix 9軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果均以平均值±標準差的形式(SD)表示，每個實驗重復(fù)3次。數(shù)據(jù)的顯著性采用t檢驗進行比較。當P<0.05，則差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 阿膠不同分子質(zhì)量組分的蛋白質(zhì)含量及分子質(zhì)量分布

經(jīng)測定，分離制得的F1、F2、F3組分的蛋白質(zhì)含量分別為(91.88±0.37)%、(94.34±1.72)%和(94.75±0.80)%。其分子質(zhì)量分布色譜圖如圖1所示，kw 804凝膠色譜柱的標準曲線為(R2=0.995 0)，組分F1中，Mw<10 kDa占比81.91%，組分F2中，Mw在10～30 kDa占比85.85%，組分F3中，Mw>30 kDa占比89.83%。

圖1 F1、F2和F3分子質(zhì)量分布液相色譜圖Fig.1 Liquid chromatogram of the F1, F2 and F3’s molecular weight distribution

2.2 阿膠分離組分F1、F2、F3對RAW264.7細胞細胞活性及刺激細胞釋放NO及TNF-α的含量

NO是一種神經(jīng)傳遞調(diào)節(jié)劑，可作為血管舒張劑并保護機體免受病原體侵害。NO與巨噬細胞的抗病毒功能、炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)等功能密切相關(guān)[12]，TNF-α可以激活線粒體產(chǎn)生ROS，并通過NF-κB調(diào)節(jié)蛋白調(diào)節(jié)IL-6、IL-8和NO的釋放[13]。因此，通過比較阿膠分離組分處理細胞后NO和TNF-α的釋放量，可以大致明確不同阿膠分離組分的免疫活性強弱。如圖2所示，與空白對照組相比，所有的阿膠分離組分處理細胞后，對細胞活性均無顯著性影響，NO和TNF-α釋放量明顯增加，其中，1 000 mg/L F2處理細胞后上清液中NO和TNF-α的含量分別為38.87 μmol/L和6 577.29 μg/L，比F1處理后的細胞分別高297.85%和962.86%，比F3處理后的細胞分別高38.87%和15.25%，具有顯著差異(P<0.05)，與LPS處理細胞組相比，釋放量稍低。說明阿膠中免疫活性最強的組分為10～30 kDa的蛋白組分，因此，后續(xù)以F2為研究對象，探討其免疫增強作用和機制。有學(xué)者對鯉魚卵蛋白進行了酶解，并通過體內(nèi)實驗驗證了酶解后蛋白的免疫增強活性，結(jié)果表明酶解后蛋白的分子質(zhì)量大都在5～90 kDa，具有良好的免疫增強活性[14]。

2.3 阿膠分離組分F2對RAW264.7細胞的免疫增強作用

2.3.1 F2對RAW264.7細胞活性的影響

F2對RAW264.7細胞的毒性作用如圖3-a所示，與空白對照組相比，不同濃度的F2對RAW264.7細胞的活力沒有影響，表明F2為62.5～1 000 mg/L時，對RAW264.7巨噬細胞無毒性作用。因此，選擇62.5、125、250、500、1 000 mg/L 5個質(zhì)量濃度梯度進行后續(xù)實驗。

a-細胞活性；b-NO；c-TNF-α圖2 不同濃度F1、F2和F3對RAW264.7細胞細胞活性、NO和TNF-α釋放量的影響Fig.2 The effects of Cell viability, the production of NO and TNF-α of RAW264.7 cells treated with F1, F2 and F3 at different concentration注:不同字母表示具有顯著性差異(P<0.05)(下同)

2.3.2 F2對RAW264.7細胞釋放ROS和IL-6的影響

IL-6可以通過MAPK信號通路影響免疫和生理過程，如細胞增殖和分化的增加、抗體合成的增強以及急性蛋白的產(chǎn)生[15]。不同濃度的F2對RAW264.7細胞釋放ROS和IL-6的影響如圖3-b和圖3-c所示，當F2質(zhì)量濃度為500 mg/L時，細胞釋放的ROS與空白對照有顯著差異(P<0.05)，在1 000 mg/L時，ROS釋放量比空白對照高31.58%，但比LPS處理組低。當F2的質(zhì)量濃度為62.5 mg/L時，IL-6的分泌量與空白對照組相比有顯著差異(P<0.05)，當質(zhì)量濃度增加到1 000 mg/L時，IL-6分泌量與陽性對照LPS無顯著性差異(P>0.05)。結(jié)果表明，ROS和IL-6的釋放量隨F2濃度的升高而升高，具有明顯的劑量依賴性。

綜合所述，F(xiàn)2能夠提升RAW264.7細胞NO、ROS以及TNF-α和IL-6等細胞因子的釋放量，從而促進巨噬細胞發(fā)揮免疫功能。YANG等[12]研究了太子參蛋白水解物的免疫增強活性，也能通過促進RAW264.7巨噬細胞分泌NO和TNF-α從而活化巨噬細胞。柚皮蛋白也可以通過促進巨噬細胞分泌NO、TNF-α和IL-6從而發(fā)揮其免疫增強活性[16]。

a-細胞活力；b-ROS；c-IL-6圖3 不同濃度的F2處理后，RAW264.7細胞活力、ROS和IL-6釋放量的影響Fig.3 The effects of cell viability the production of ROS and IL-6 of RAW264.7 cells treated with different concentrations of F2

2.4 F2對免疫相關(guān)基因的表達情況的影響

用q-PCR檢測細胞中mRNA的含量，結(jié)果如圖4-a 所示。100 mg/L的F2能顯著促進TNF-α基因的表達(P<0.05)，并且，隨著F2濃度的升高，基因的表達量也隨之升高，與經(jīng)F2刺激后，細胞釋放的TNF-α蛋白趨勢相同。IL-6基因的表達量如圖4-b所示，100 mg/L的F2能使得細胞中IL-6 mRNA的量相比空白對照組高4.5倍，但無顯著性差異(P>0.05)，100 mg/L的F2能極顯著(P<0.01)促進IL-6基因的表達。iNOS是巨噬細胞受到刺激后，在細胞內(nèi)合成并發(fā)揮作用，在NO的合成中發(fā)揮重要的作用，參與NO誘導(dǎo)的腫瘤細胞毒性[10]，在F2的刺激下，細胞iNOS基因的表達量也顯著上升，具有促進NO合成的作用。 TLR4是巨噬細胞表面參與固有免疫應(yīng)答的一種重要模式識別受體，相關(guān)研究表明，TLR4對物質(zhì)的識別是激活MAPK信號通路的重要介質(zhì)[17]。因此檢測TLR4基因的表達量能檢測F2組分是否能與細胞表面的TLR4結(jié)合，從而調(diào)控細胞內(nèi)的生理活動，如圖4-d所示，100 mg/L的F2就能顯著促進TLR4基因的表達(P<0.05)，當F2質(zhì)量濃度達1 000 mg/L時，TLR4 mRNA含量最高，為空白對照組的1.72倍，由此推測，F(xiàn)2可以和巨噬細胞表面的TLR4結(jié)合，從而調(diào)控細胞的生理活動。CHANG等[18]研究了茯苓蛋白對巨噬細胞的活化作用后發(fā)現(xiàn)，茯苓蛋白通過與巨噬細胞表面的TLR4結(jié)合，進而發(fā)揮其免疫增強活性。武文佳[19]研究了小麥胚芽球蛋白堿性酶水解物的免疫增強活性，通過TLR4抗體預(yù)處理細胞發(fā)現(xiàn)，NO、ROS、TNF-α和IL-6的分泌量降低，證實了其可以和巨噬細胞表面的TLR4結(jié)合，從而調(diào)控細胞內(nèi)的生理活動。

a-TNF-α；b-IL-6；c-iNOS；d-TLR4圖4 F2對免疫相關(guān)基因的表達情況的影響Fig.4 The effects of F2 on the mRNA expression levels of TNF-α, IL-6, iNOS, and TLR4 in RAW264.7 cells

2.5 F2對RAW264.7細胞內(nèi)MAPK信號通路的影響

MAPK是絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶家族，細胞受到刺激后，它可以參與巨噬細胞NF-κB活化的啟動[20]。已有研究表明，在哺乳動物細胞中有3種具有代表性的MAPK途徑：細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)1/2、C-Jun氨基末端蛋白激酶(C-Jun N-terminal protein kainse,JNK)和P38[20]。為了研究F2發(fā)揮其免疫增強活性的機理，使用Western blot分析檢測ERK、JNK和p38 MAPK通路的磷酸化水平。采用1 000 mg/L的F2處理細胞4、8、16 h，探究隨著時間的變化MAPK信號通路激活的情況，結(jié)果如圖5所示，1 000 μg/mL的F2可以增加JNK、ERK和P38的磷酸化，JNK蛋白的磷酸化在16 h時程度最大，為對照組的7倍，ERK和P38蛋白的磷酸化在8 h時程度最大，分別為對照組的2.5和1.5倍。說明F2可以通過提高JNK、ERK和P38蛋白的磷酸化程度來活化巨噬細胞，從而發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用。

越來越多的研究表明，食品中的蛋白質(zhì)類物質(zhì)具有增強免疫作用[16,21]，但是由于蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量較大，直接進入細胞內(nèi)發(fā)揮其生物學(xué)功能很困難，一般會在細胞表面與細胞表面的模式識別受體相結(jié)合，進而調(diào)控細胞內(nèi)的生物學(xué)活動，發(fā)揮其免疫增強功能。本研究純化獲得的分子質(zhì)量在10～30 kDa的阿膠組分，可以和巨噬細胞表面的TLR4結(jié)合，從而激活細胞內(nèi)的MAPK信號通路，增加JNK、ERK和P38蛋白的磷酸化水平，從而調(diào)控細胞內(nèi)的基因表達水平，增加相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄mRNA，促進巨噬細胞分泌更多的NO、ROS、TNF-α和IL-6，從而使得巨噬細胞活化。

a-Western-blot圖；b-相對JNK表達量；c-相對ERK表達量；d-相對P38表達量圖5 Western-blot檢測1 000 μg/mL的F2處理RAW264.7細胞4、8、16 h后MAPK信號通路相關(guān)蛋白的表達情況及其蛋白表達量的相對灰度分析圖Fig.5 Western-blot detection of the expression of MAPK signaling pathway-related proteins in RAW264.7 cells treated with 1 000 μg/mL F2 for 4, 8 and 16 h and their relative grayscale analysis

3 結(jié)論

本研究用Superdex 75pg葡聚糖凝膠柱將阿膠分為了分子質(zhì)量不同的3個組分(F1，<10 kDa；F2，10～30 kDa；F3，>30 kDa)，通過比較不同組分刺激巨噬細胞NO和TNF-α的分泌量，明確了阿膠中具有最強免疫功能的組分為分子質(zhì)量在10～30 kDa的F2組分。進一步通過q-PCR和Western-blot方法明確了F2組分對RAW264.7巨噬細胞的活化作用及其作用機制，即F2組分可以促進RAW264.7細胞分泌NO、ROS、TNF-α和IL-6，分泌量具有顯著的劑量依賴性。并且刺激巨噬細胞相關(guān)基因的表達，增加MAPK信號通路中JNK、ERK和P38蛋白的磷酸化，激活MAPK信號通路，揭示其免疫增強活性與MAPK信號通路有關(guān)。該研究結(jié)果將為優(yōu)化阿膠的生產(chǎn)加工條件以生產(chǎn)高質(zhì)量阿膠產(chǎn)品提供很好的理論依據(jù)和指導(dǎo)，具有重要的實際意義。