于紅，馬曉琳，劉永峰，張瑞*

1(新疆特殊環(huán)境物種保護(hù)與調(diào)控生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，新疆特殊環(huán)境物種多樣性應(yīng)用與調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，干旱區(qū)植物逆境生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，中亞區(qū)域有害生物聯(lián)合控制國(guó)際研究中心，新疆 烏魯木齊，830054)2(陜西師范大學(xué) 食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安，710062)

當(dāng)動(dòng)物被屠宰取肉時(shí)，肌肉組織不會(huì)立即停止代謝過(guò)程。肌肉作為獨(dú)立結(jié)構(gòu)，缺失了氧氣和外來(lái)營(yíng)養(yǎng)的供給，開(kāi)始發(fā)生相應(yīng)的物理和化學(xué)變化，最終影響死后肉質(zhì)的發(fā)展和成熟。宰后成熟過(guò)程中的能量代謝與肌原纖維蛋白的降解將會(huì)影響肉質(zhì)的嫩化，進(jìn)而直接影響肉質(zhì)的嫩度、色澤等。肌原纖維蛋白也被稱為結(jié)構(gòu)蛋白，主要支撐著肌纖維的形狀，其包括肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白和肌鈣蛋白等[5]。這些肌原纖維蛋白都與肌肉收縮有關(guān)，直接影響宰后肉的嫩度、保水性和肉色等品質(zhì)[6]。有研究表明，肌內(nèi)能量和代謝水平差異會(huì)調(diào)控肌內(nèi)蛋白酶系的活力釋放，進(jìn)而影響宰后的嫩度[7]。但目前關(guān)于宰后成熟過(guò)程中，有哪些差異蛋白在何時(shí)間段如何影響肉質(zhì)的嫩度仍然存在爭(zhēng)議。因此深入研究新疆山羊不同成熟時(shí)間中的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，探討肉質(zhì)成熟的機(jī)理，有助于新疆山羊的開(kāi)發(fā)和利用，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)新疆農(nóng)牧區(qū)的經(jīng)濟(jì)增值。

課題組前期對(duì)陜西橫山羊的背部最長(zhǎng)肌與胸腹肌肉進(jìn)行宰后成熟機(jī)理的相關(guān)研究，在此研究基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)背部最長(zhǎng)肌是山羊肉中較為優(yōu)質(zhì)的部位[8]，且在肌肉轉(zhuǎn)化為肉的過(guò)程中，肌肉在死后48 h內(nèi)的代謝發(fā)生了重大變化，從根本上決定了生肉的大部分重要品質(zhì)(顏色、pH、保水能力和嫩度)。本研究選取新疆特有品質(zhì)絨山羊的背部最長(zhǎng)肌為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究新疆山羊肉成熟過(guò)程中的pH值變化以及相關(guān)差異蛋白的調(diào)節(jié)機(jī)制，探索宰后成熟過(guò)程中的差異蛋白對(duì)新疆山羊肉質(zhì)嫩化的影響，明確肉質(zhì)較好的最適成熟時(shí)間。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)材料：羊肉樣品，新疆烏魯木齊市華凌畜牧屠宰基地。選取6只約8月齡健康的新疆絨山羊(公)的背部最長(zhǎng)肌為研究對(duì)象。

實(shí)驗(yàn)試劑：氯化鉀，烏魯木齊科華偉業(yè)生物科技有限公司；三氯乙酸、KH2PO4、蛋白酶抑制劑、胰蛋白酶、二硫蘇糖醇(分析純)、尿素(分析純)、甲酸、乙腈、三乙基碳酸氫銨(分析純)、三氟乙酸(分析純)、蛋白質(zhì)定量試劑盒(bicinchonininc acid，BCA)、串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)簽(tandem mass tags，TMT)標(biāo)記試劑盒、預(yù)染標(biāo)記物、二甲苯(分析純)、檸檬酸(分析純)、醋酸鈾(分析純)等試劑，艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Testo 205便攜式pH計(jì)，德國(guó)德圖公司；PROTE-ANⅡ型凝膠電泳系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司；IMARK酶標(biāo)儀，上海旦鼎國(guó)際貿(mào)易有限公司；Velocity 18R離心機(jī)，天美儀拓實(shí)驗(yàn)室設(shè)備(上海)有限公司；LC-20AB HPLC型Offline HPLC高校液相色譜，杭州瑞析科技有限公司；Q-Exactive質(zhì)譜儀，百泰派克生物科技；JEM-1011透射電子顯微鏡，日本JEOL公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理

采集6只8月齡的新疆絨山羊(來(lái)自同一養(yǎng)殖場(chǎng)，飼養(yǎng)方式相同)，均由烏魯木齊華凌畜牧基地提供。按照DB 37/T 3878—2020(肉樣屠宰操作規(guī)程)進(jìn)行屠宰，并分割取背部最長(zhǎng)肌10 g用錫紙包好放置于液氮中迅速冷卻，用于0 h樣品，其余肉樣包裝后放置4 ℃冰箱進(jìn)行宰后成熟過(guò)程，用于pH和蛋白組檢測(cè)。

下一步將在引入優(yōu)良谷子品種基礎(chǔ)上，進(jìn)行谷子種業(yè)、谷子規(guī)?；N植、谷子及秸稈飼料化、小米深加工產(chǎn)品開(kāi)發(fā)及產(chǎn)業(yè)化，全面發(fā)展小米“種植、養(yǎng)殖、加工”全產(chǎn)業(yè)鏈，立足保加利亞，形成可復(fù)制的盈利模式，并逐步輻射到歐洲其它國(guó)家，為我國(guó)農(nóng)業(yè)“走出去”做出貢獻(xiàn)。

1.3.2 pH值測(cè)定

按照國(guó)標(biāo)GB/T 5009.237—2016進(jìn)行調(diào)整，分別將羊肉樣品剔除筋膜、剪成碎末，稱取約4 g肌肉樣置于燒杯中，加入40 mL 0.1 mol/L KCl溶液，用玻璃棒攪拌，常溫下放置30 min，使用校正后的pH計(jì)進(jìn)行測(cè)值，每組測(cè)量3次，結(jié)果取平均值。

1.3.3 蛋白質(zhì)提取和肽段酶解

每個(gè)樣品采用SDT[40 g/L十二烷基硫酸鈉，100 mmol/L Tris/HCl pH 7.6，0.1 mol/L二硫蘇糖醇]裂解法提取蛋白質(zhì)，然后采用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。每個(gè)樣品取適量蛋白質(zhì)，采用輔助過(guò)濾樣品制備(filter aided proteome preparation, FASP)方法進(jìn)行胰蛋白酶酶解[9]。

1.3.4 TMT 標(biāo)記

各樣品分別取100 μg肽段，按照Thermo公司TMT標(biāo)記試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記信息如表1所示。該項(xiàng)目設(shè)計(jì)組別4個(gè)，每個(gè)組別含有3個(gè)生物學(xué)重復(fù)樣本，共計(jì)12個(gè)樣本。

表1 肽段標(biāo)記信息Table 1 Peptide labeling information

1.3.5 標(biāo)記肽段的強(qiáng)陽(yáng)離子交換器(strong cation exchanger，SCX)分級(jí)

將每組標(biāo)記后的肽段混合，采用AKTA Purifier 100進(jìn)行分級(jí)。色譜柱以緩沖液A液(10 mmol/L KH2PO4，25% 乙腈，pH 3.0)平衡，樣品由進(jìn)樣器上樣到色譜柱進(jìn)行分離，流速為1 mL/min。洗脫過(guò)程監(jiān)測(cè)214 nm的吸光度值，每隔1 min收集洗脫組分，分別凍干后采用C18 Cartridge脫鹽。

1.3.6 LC-MS/MS數(shù)據(jù)采集

每份樣品采用納升流速的HPLC液相系統(tǒng)進(jìn)行分離。緩沖液A液為0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸水溶液，B液為0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸乙腈水溶液。樣品經(jīng)色譜分離后用Q-Exactive質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。多肽和多肽碎片的質(zhì)量電荷比按照下列方法采集：每次全掃描后采集20個(gè)碎片圖譜，MS2的激活類型是高能碰撞碎裂，二級(jí)質(zhì)譜在200m/z處的分辨率為17 500，破碎能量為30 eV。

1.3.7 蛋白質(zhì)鑒定和定量分析

質(zhì)譜分析原始數(shù)據(jù)采用軟件Mascot 2.2和Proteome Discoverer 1.4進(jìn)行查庫(kù)鑒定及定量分析。相關(guān)參數(shù)和說(shuō)明如表2所示。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

首先對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)集合的定量信息進(jìn)行歸一化處理(歸一化到-1～1區(qū)間)。使用亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)的方法，預(yù)測(cè)待檢索蛋白亞細(xì)胞定位信息。采用Blast2GO對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)集合進(jìn)行基因本體特征(gene ontology，GO)注釋，以及用京都基因和基因組百科全書(shū)(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)自動(dòng)注釋服務(wù)器軟件進(jìn)行KEGG通路注釋。采用Fisher精確檢驗(yàn)對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行GO注釋或KEGG通路富集分析。

表2 蛋白質(zhì)鑒定和定量分析的相關(guān)參數(shù)Table 2 Parameters related to proteins identification and quantitative analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 成熟過(guò)程中pH值的變化

宰后羊肉成熟過(guò)程中的肌肉pH變化的幅度和速度除了影響肌肉色澤、嫩度和多汁性外[10]，同時(shí)也影響宰后山羊肌糖元的酵解速度和強(qiáng)度。由于動(dòng)物體內(nèi)有完善的緩沖體系，pH值基本保持在中性。而屠宰后，動(dòng)物體內(nèi)有氧呼吸停止，供氧途徑被阻斷，體內(nèi)肌肉代謝變成糖酵解為主的無(wú)氧代謝，糖酵解的產(chǎn)物乳酸和ATP降解所產(chǎn)生的無(wú)機(jī)磷酸的累積，使肌肉pH不斷下降[11]。選取宰后不同成熟時(shí)間的新疆山羊背最長(zhǎng)肌進(jìn)行肉品質(zhì)的測(cè)定，如圖1所示，宰后0～24 h內(nèi)的pH顯著下降(P<0.05)，這可能是因山羊成長(zhǎng)過(guò)程中的運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致肌肉中的乳酸沉積和神經(jīng)興奮導(dǎo)致宰后初期的pH較高，此結(jié)果與張利霞等[12]和SEN等[13]的研究結(jié)果一致。而宰后48 h內(nèi)新疆山羊的pH偏低則可能與宰后糖酵解有關(guān)[14]，也可能是成熟過(guò)程中參與H+轉(zhuǎn)換的相關(guān)差異蛋白的活性決定。

圖1 不同宰后成熟時(shí)間對(duì)羊肉的pH變化Fig.1 Changes of mutton pH at post-mortem in different maturation time注：不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2 質(zhì)量控制

本實(shí)驗(yàn)采用具有高質(zhì)量精度、高分辨率的Q Exactive質(zhì)譜儀，在數(shù)據(jù)采集過(guò)程中可以保持良好的質(zhì)量偏差，并最終獲得高質(zhì)量的MS1和MS2圖譜。如圖2所示，所有鑒定肽段的質(zhì)量偏差主要分布在10 ppm以內(nèi)，說(shuō)明鑒定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。圖3是結(jié)合MASCOT的分析工具對(duì)MS圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析所得到的肽段離子得分分布圖，MS2的MASCOT得分較為理想，約50.27%以上的修飾肽段得分在20分以上，肽段得分中位數(shù)為20分。每一套TMT數(shù)據(jù)在定性分析工作中均使用FDR≤0.01作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合所得的優(yōu)秀肽段得分分布情況，進(jìn)一步說(shuō)明MS實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)質(zhì)量較高。圖4表明，等量標(biāo)記的2組樣品中大部分蛋白質(zhì)的豐度比值接近1。肽段進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)后結(jié)果良好，能夠增加蛋白質(zhì)鑒定與分析結(jié)果的可靠性，為探索肌肉向食用肉的轉(zhuǎn)化過(guò)程中參與的重要差異蛋白的鑒定提供科學(xué)依據(jù)。

圖2 肽段離子質(zhì)量偏差分布Fig.2 The mass deviation distribution of peptide ions注：橫坐標(biāo)為肽段離子理論質(zhì)荷比和質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)測(cè)得質(zhì)荷比的質(zhì)量偏差，單位ppm即百萬(wàn)分之一，是一個(gè)相對(duì)單位

圖3 肽段離子得分分布Fig.3 Peptide ion score distribution注：橫坐標(biāo)為肽段得分；主縱坐標(biāo)表示鑒定到的具有對(duì)應(yīng)離子得分的肽段數(shù)量；次縱坐標(biāo)表示不高于對(duì)應(yīng)離子得分的肽段累積百分比

a-12 h/0 h比較組的肽段豐度比分布；b-24 h/0 h比較組的肽段豐度比分布；c-48 h/0 h比較組的肽段豐度比分布圖4 肽段豐度比分布Fig.4 Abundance ratio distribution of peptide segment注：差異倍數(shù)(以2為底的對(duì)數(shù)變換)

2.3 差異表達(dá)蛋白的定量與篩選

采用TMT技術(shù)研究了宰后48 h內(nèi)新疆山羊的背部最長(zhǎng)肌樣品的差異表達(dá)蛋白結(jié)果情況，質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)中共得到級(jí)質(zhì)譜譜圖總數(shù)518 230個(gè)，通過(guò)Mascot軟件進(jìn)行分析后，匹配到的譜圖總數(shù)量為47 666張，其中唯一肽段總數(shù)14 466個(gè)，蛋白質(zhì)總數(shù)2 526個(gè)，鑒定到的顯著差異表達(dá)蛋白155個(gè)。具體3個(gè)比較組的差異蛋白表達(dá)量變化如圖5所示，在宰后不同階段，差異蛋白的表達(dá)有所不同。3個(gè)比較組中，上調(diào)蛋白的數(shù)量均高于下調(diào)蛋白的數(shù)量，說(shuō)明差異蛋白在山羊肉嫩化過(guò)程中更為活躍。且在屠宰12 h后，這些蛋白的表達(dá)差異更為顯著，進(jìn)一步說(shuō)明隨宰后成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，相關(guān)差異表達(dá)蛋白的數(shù)量逐漸增加，對(duì)肉質(zhì)的調(diào)控程度也逐漸增強(qiáng)。細(xì)胞器是細(xì)胞質(zhì)中具有一定形態(tài)和功能的小器官，也是蛋白質(zhì)發(fā)揮不同功能的重要場(chǎng)所。不同的亞細(xì)胞器通常執(zhí)行不同的細(xì)胞功能。因此，分析蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位有助于進(jìn)一步探索蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的功能，結(jié)果如圖6所示。宰后成熟過(guò)程0 h/12 h、0 h/24 h、0 h/48 h 3個(gè)比較組的差異表達(dá)蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，結(jié)果表明，成熟過(guò)程中作用的差異蛋白大多數(shù)來(lái)自于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)，可能為這些參與調(diào)控肉品質(zhì)的差異蛋白的合成及相關(guān)功能表達(dá)，提供了場(chǎng)所保障。

a-0 h/12 h組差異表達(dá)蛋白質(zhì)聚類分析結(jié)果圖；b-0 h/24 h組差異表達(dá)蛋白質(zhì)聚類分析結(jié)果圖；c-0 h/48 h組差異表達(dá)蛋白質(zhì)聚類分析結(jié)果圖圖5 三組差異表達(dá)蛋白質(zhì)聚類分析結(jié)果Fig.5 Clustering analysis of three groups of differentially expressed proteins注：橫坐標(biāo)為樣品信息，縱坐標(biāo)為顯著性差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，紅色代表顯著性上調(diào)的蛋白質(zhì)，藍(lán)色代表顯著性下調(diào)的蛋白質(zhì)，灰色部分代表無(wú)蛋白質(zhì)定量信息

圖6 相關(guān)差異表達(dá)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位Fig.6 Subcellular localization of differentially expressed proteins

2.4 差異表達(dá)蛋白的結(jié)構(gòu)域富集、GO功能注釋與KEGG分析

對(duì)差異表達(dá)蛋白服從Fisher′s exact test進(jìn)行驗(yàn)證，在GO功能項(xiàng)顯著富集分析中對(duì)差異表達(dá)蛋白的認(rèn)識(shí)、功能類別以及它們之間的相關(guān)性，并對(duì)這些差異蛋白質(zhì)的富集GO條目層級(jí)關(guān)系進(jìn)行展示，為深入了解影響山羊肉品質(zhì)的變量進(jìn)行了重要補(bǔ)充。本研究的GO功能注釋結(jié)果主要分為三類：生物過(guò)程(BP)、細(xì)胞成分(CC)和分子功能(MF)[15]。并發(fā)現(xiàn)隨宰后成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，新疆山羊肌肉中的一些差異蛋白主要參與調(diào)節(jié)生物過(guò)程、調(diào)節(jié)細(xì)胞過(guò)程和代謝調(diào)控，并且較為集中的參與催化活性和結(jié)合功能。此外，這些差異蛋白的主要分布在細(xì)胞部分、細(xì)胞和細(xì)胞器部分。對(duì)于細(xì)胞成分組，WEI等[16]觀察到山羊組的差異蛋白主要分布在細(xì)胞器和細(xì)胞外泌體中，與本試驗(yàn)結(jié)果存在少許差別，這可能是因?yàn)椴煌贩N的山羊，差異蛋白的表達(dá)及其分布存在地區(qū)差異。

為了進(jìn)一步分析不同比較組中的關(guān)鍵代謝通路，執(zhí)行KEGG通路富集提取與差異表達(dá)蛋白相關(guān)的生物通路[17]。宰后成熟48 h內(nèi)某些差異表達(dá)蛋白參與糖酵解的代謝通路如圖7所示，結(jié)果顯示大多數(shù)差異表達(dá)在山羊宰后成熟中下調(diào)表達(dá)，其中只有2個(gè)差異蛋白(PGM1，LDHB)上調(diào)表達(dá)。代謝過(guò)程表明，葡萄糖磷酸變位酶-1(phosphoglucomutase 1，PGM1)參與α-D-一磷酸葡萄糖向α-D-六磷酸葡萄糖的轉(zhuǎn)化過(guò)程。因此，PGM1在糖代謝中起著重要的作用，能通過(guò)影響糖原降解、ATP的產(chǎn)生、乳酸的積累調(diào)控宰后肉品質(zhì)的pH值。此外，有研究表明，PGM1是肌間脂肪(intramuscular fat，IMF)合成的還原性輔因子，其基因表達(dá)量高的樣品中IMF含量高，汁液流失率低[18]。由此可知，PGM1可能是改變?cè)缀笕馄焚|(zhì)嫩化的重要因素之一。

圖7 宰后成熟過(guò)程中的糖酵解代謝Fig.7 Glycolytic metabolism during postmortem maturation注：圖中紅底方框表示發(fā)生差異的蛋白質(zhì)為上調(diào)，綠底方框表示發(fā)生差異的蛋白質(zhì)為下調(diào)，黃底方框表示有多個(gè)蛋白；小圓圈表示小分子代謝物，大圓框代表其他通路

LDHB參與三羧酸循環(huán)后期的丙氨酸與L-乳酸相互轉(zhuǎn)化過(guò)程，通過(guò)調(diào)控宰后成熟過(guò)程中的pH值變化改善肉品質(zhì)。也有研究表明，LDHB能夠促進(jìn)肉色的穩(wěn)定性[19-20]。而本研究結(jié)果顯示宰后48 h時(shí)，該酶上調(diào)表達(dá)，可以解釋LDHB在穩(wěn)定正常肉色中的作用。動(dòng)物宰后的糖酵解速率是影響最終肉品質(zhì)的重要因素之一。JIA等[21]利用2-DE蛋白組學(xué)研究了牛背最長(zhǎng)肌從體內(nèi)到宰后早期(宰后1 h)的蛋白質(zhì)變化。鑒定到24個(gè)差異表達(dá)蛋白，其中5個(gè)蛋白(烯醇酶、醛脫氫酶、磷酸甘油酸激酶、ATP特異性琥珀酰輔酶a合成酶和異檸檬酸脫氫酶)為酵解和三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵，這些結(jié)果反映了宰后肌肉中無(wú)氧代謝為機(jī)體提供ATP，同時(shí)應(yīng)激蛋白是肌纖維結(jié)構(gòu)變化潛在的生物指示劑。JIA等[22]研究了宰后1、2、3、6、10、24 h的蛋白質(zhì)組學(xué)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與之前的文獻(xiàn)相比，代謝蛋白(酵解酶和與ATP產(chǎn)生途徑相關(guān)的酶)、應(yīng)激和防御蛋白、蛋白水解酶在豐度上發(fā)生了變化。

2.5 能量代謝相關(guān)差異蛋白對(duì)肉品質(zhì)的影響

在本研究中，在0 h/12 h組中檢測(cè)到的線粒體核糖體蛋白L46(MRPL46)顯著上調(diào)。在0 h/24 h組中，線粒體核糖體蛋白S15(MRPS15)、39S核糖體蛋白L41(MRPL41)、線粒體核糖體蛋白L22(MRPL22)顯著上調(diào)，這些差異蛋白主要參與宰后能量物質(zhì)的運(yùn)輸作用，說(shuō)明宰后成熟早期的能量代謝，促進(jìn)宰后肉質(zhì)嫩化過(guò)程。也有相關(guān)研究表明，核糖體蛋白是調(diào)節(jié)肌肉凍融的關(guān)鍵蛋白，且凍融過(guò)程抑制了蛋白質(zhì)的消化及脂肪分解[23]。在0 h/48 h組中檢測(cè)到的差異蛋白中無(wú)機(jī)焦磷酸酶2(PPA2)顯著上調(diào)。依據(jù)GO注釋和KEGG結(jié)果表明，這些差異表達(dá)蛋白質(zhì)主要與線粒體有關(guān)，并參與氧化代謝過(guò)程，對(duì)山羊肉的嫩化過(guò)程起著重要作用。線粒體是細(xì)胞有氧活動(dòng)的重要位點(diǎn)，并參與三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化反應(yīng)，這些與線粒體相關(guān)差異蛋白在成熟過(guò)程中上調(diào)表達(dá)，生成的ATP與H+有助于調(diào)節(jié)肉質(zhì)的pH和成熟。有研究也表明，由細(xì)胞有氧呼吸產(chǎn)生的NADH(nicotinamide adenine dinucleotide)有助于肉的顏色的穩(wěn)定[24-25]。

本研究中，在分子功能方面主要富集了參與有氧代謝的跨膜運(yùn)輸?shù)鞍住＠?，? h/12 h組中檢測(cè)到的差異蛋白中，跨膜蛋白14C(TMEM14C)顯著下調(diào)。在0 h/24 h組中檢測(cè)到的差異表達(dá)蛋白中，跨膜蛋白205(TMEM205)顯著上調(diào)。在0 h/48 h組中，氧甾醇結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白10(OSBPL10)、雷汀醇結(jié)合蛋白4(RBP4)顯著上調(diào)，糖質(zhì)膜相關(guān)蛋白(SLMAP)顯著下調(diào)。這一結(jié)果表明，與跨膜運(yùn)輸相關(guān)差異蛋白在成熟后期上調(diào)表達(dá)，這些差異蛋白可能與蛋白的初始濃度和宰后成熟過(guò)程中的能量代謝有關(guān)，說(shuō)明有氧代謝在山羊宰后48 h內(nèi)的成熟中發(fā)揮了作用。涉及肌肉結(jié)構(gòu)的差異蛋白的某些分子功能在死后48 h與死后0 h不同，這可能是宰后成熟過(guò)程的嫩度不同導(dǎo)致的。因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)尤其細(xì)胞骨架蛋白的降解是宰后成熟過(guò)程中肌肉嫩化的主要原因[26]。對(duì)比其他2組，0 h/48 h組中該類差異蛋白下調(diào)表達(dá)，說(shuō)明肌肉結(jié)構(gòu)蛋白的變化可能導(dǎo)致48 h山羊肌肉嫩度降低。肌肉結(jié)構(gòu)和能量代謝與影響肉類質(zhì)量的蛋白質(zhì)有關(guān)，由LAMETSCH等[27]和KARLSSON等[28]證實(shí)。

3 結(jié)論

本研究以新疆山羊的背部最長(zhǎng)肌為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，較為深入地探索了影響肉質(zhì)成熟的差異表達(dá)蛋白的作用機(jī)理。采用TMT標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)比較死后不同成熟時(shí)期的蛋白質(zhì)組變化，這一結(jié)果使本研究更好地了解宰后成熟過(guò)程中的蛋白質(zhì)組差異。與糖酵解相關(guān)的差異蛋白在宰后48 h時(shí)仍上調(diào)表達(dá)，這些蛋白可調(diào)控宰后肌肉的pH值變化，且對(duì)pH值的影響結(jié)果與前期pH值的檢測(cè)結(jié)果相一致。這說(shuō)明山羊宰后的糖代謝過(guò)程維持到48 h之后，可以促進(jìn)肉色的穩(wěn)定和肉質(zhì)的嫩化。山羊宰后肌肉轉(zhuǎn)化為肉的過(guò)程中有不同的代謝模式，而線粒體作為能量代謝的關(guān)鍵部位，可能間接地調(diào)節(jié)肉質(zhì)嫩度的變化。本研究結(jié)果顯示，24 h內(nèi)的線粒體相關(guān)差異蛋白均上調(diào)表達(dá)，表明新疆山羊肉的背部最長(zhǎng)肌成熟期間肉質(zhì)逐漸嫩化，且24 h時(shí)嫩化程度最高，進(jìn)一步表明宰后成熟起到嫩度優(yōu)化的作用。通過(guò)生物信息學(xué)分析出了一些差異蛋白質(zhì)和糖酵解途徑為肉品質(zhì)調(diào)控機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。