楊柳，鄭漢豐，郭全友，楊絮，周國(guó)燕，鄭堯

1(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 東海水產(chǎn)研究所，上海，200090)2(上海理工大學(xué) 健康科學(xué)與工程學(xué)院，上海，200093)

南極磷蝦(Euphausiasuperba)，生物資源量大，約6.5億～10.0億t，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，被譽(yù)為“人類未來(lái)的動(dòng)物蛋白庫(kù)”。20世紀(jì)60年代起，南極磷蝦成為各國(guó)戰(zhàn)略爭(zhēng)奪資源，挪威、中國(guó)、智利、日本等是主要捕撈及加工國(guó)家[1]。目前，南極磷蝦以凍蝦和蝦粉等產(chǎn)品形式為主。南極磷蝦富含內(nèi)源酶，易使蝦體發(fā)生自溶，導(dǎo)致品質(zhì)下降。磷蝦經(jīng)蒸煮、分離和干燥等工藝生產(chǎn)的蝦粉，由于內(nèi)源酶失活和水分含量降低，易于運(yùn)輸和貯存，南極磷蝦粉的船上加工和全效利用成為關(guān)注重點(diǎn)。

南極磷蝦粉富含蛋白質(zhì)、蝦青素、磷脂脂肪酸等成分[2]，多用于磷蝦油提取[3]。提油后的脫脂蝦粉中含有大量?jī)?yōu)質(zhì)蛋白，制備具有抗氧化、降血壓等功能活性的磷蝦肽受到業(yè)內(nèi)關(guān)注[4-5]。蛋白肽制備多用酶解與發(fā)酵法[6]，但酶解所得蛋白肽多含疏水性氨基酸，苦味明顯[7]，而微生物發(fā)酵產(chǎn)生的有機(jī)酸對(duì)苦味有掩蓋作用、外肽酶具有脫苦功效[8]，所得多肽風(fēng)味更佳，適口性更強(qiáng)。同時(shí)，生物酶價(jià)格昂貴，酶解法在工業(yè)應(yīng)用受到限制，因此，微生物發(fā)酵法成為一種天然綠色的多肽制備方法。

枯草芽胞桿菌是發(fā)酵制備多肽的安全菌種之一，具有產(chǎn)酶豐富、生長(zhǎng)迅速等特點(diǎn)，在食品工業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[9]。除選擇合適的菌株以最大限度地提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量外，發(fā)酵時(shí)間、初始接種量等發(fā)酵條件同樣影響發(fā)酵效能[10]?？寡趸堑鞍纂淖钪饕纳锘钚?，自由基清除率、還原力等能有效評(píng)價(jià)蛋白肽的抗氧化活性。目前，以南極磷蝦粉為原料，發(fā)酵制備多肽的研究報(bào)道較少。

本文選擇枯草芽胞桿菌為發(fā)酵菌種，針對(duì)料液比、發(fā)酵時(shí)間、初始接種量等因素進(jìn)行優(yōu)化，并進(jìn)行正交試驗(yàn)。選擇自由基清除率、亞鐵離子螯合力及總抗氧化力對(duì)兩種工藝制備的南極磷蝦粗多肽體外抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。為提高南極磷蝦多肽的發(fā)酵效能和抗氧化活性等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南極磷蝦粉購(gòu)自中國(guó)水產(chǎn)有限公司，運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室后均于-20 ℃冷凍保藏。

枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)CICC 10071購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室活化后采用甘油保藏，于-80 ℃冷凍保藏。

95%乙醇，上海阿拉丁生化科技有限公司；甲醛溶液、氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.05 mol/L)，上海麥克林生化科技有限公司；牛血清蛋白，美國(guó)Sigma公司；LB固體培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基，北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

KDN-103F凱氏定氮儀，上海纖檢儀器有限公司；LRH-250恒溫培養(yǎng)箱、DK-8D恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司；ZHWY-100H/200H恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；UV9100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京萊伯泰科有限公司；SPARK 10M多功能酶標(biāo)儀，奧地利Tecan有限公司；2011-B6236立式滅菌鍋，上海東亞壓力容器制造有限公司；Avanti J-301低溫高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵工藝流程

發(fā)酵工藝流程如下：

原料→脫脂→滅菌→發(fā)酵→離心、抽濾→滅酶→取上清液待測(cè)

脫脂：95%乙醇，1∶10(g∶mL)1 000 r/min攪拌8 h，靜置過(guò)濾，取沉淀，50 ℃烘干24 h，研缽研碎，于-18 ℃冷凍保藏。滅菌：按一定料液比稱取脫脂蝦粉于250 mL錐形瓶中，加入100 mL去離子水，調(diào)節(jié)pH值，于121 ℃滅菌15 min，超凈臺(tái)中冷卻至室溫待用。發(fā)酵：按比例接入一定量的枯草芽胞桿菌于滅菌蝦粉中，采用30 ℃于恒溫培養(yǎng)振蕩器中發(fā)酵一定時(shí)間，設(shè)置轉(zhuǎn)速為180 r/min。離心、抽濾：發(fā)酵結(jié)束后，取發(fā)酵液8 000 r/min離心15 min，取上清抽濾待用。滅酶：將離心、抽濾后的發(fā)酵液于95 ℃滅酶15 min。

1.3.2 菌株復(fù)活與保藏

取LB液體培養(yǎng)基0.5 mL完全溶解凍干菌粉后，轉(zhuǎn)移至裝有5 mL LB液體培養(yǎng)基的試管中混勻，30 ℃靜置培養(yǎng)48 h，連續(xù)接種3代至菌株活力正常。轉(zhuǎn)接至1.5 mL離心管，采用甘油保藏菌株，于-80 ℃保藏備用。

1.3.3 菌株活化及種子液制備

1.3.3.1 菌株活化

取1.5 mL離心管甘油保藏菌株，轉(zhuǎn)接至100 mL LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h，劃線轉(zhuǎn)接于LB固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)48 h備用。

1.3.3.2 種子液制備

稱取3 g脫脂蝦粉于250 mL錐形瓶中，加入100 mL去離子水，于121 ℃滅菌15 min，超凈臺(tái)中冷卻至室溫，挑取單個(gè)菌落接種于滅菌蝦粉中，30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)48 h，測(cè)定菌液濃度，選擇菌液濃度達(dá)109CFU/mL的種子液備用。

1.3.4 發(fā)酵工藝優(yōu)化試驗(yàn)

1.3.4.1 單因素試驗(yàn)

依據(jù)前期預(yù)研結(jié)果，分別探究料液比[1∶100、3∶100、5∶100、7∶100、9∶100(g∶mL)]、發(fā)酵時(shí)間(1、2、3、4、5 d)、初始接種量(1.5×105、1.5×106、1.5×107、1.5×108CFU/mL)、發(fā)酵液初始pH值(6.5、7.0、7.5、8.0、8.5)對(duì)南極磷蝦肽制備效果的影響。發(fā)酵結(jié)束后經(jīng)離心、抽濾、滅酶后，取適量上清液備用，進(jìn)行多肽得率、水解度及蛋白回收率的測(cè)定。

1.3.4.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，對(duì)發(fā)酵時(shí)間、料液比和初始接種量3個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，確定南極磷蝦蛋白肽制備的最佳工藝。正交因素及水平設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L9(34)因素及水平Table 1 Independent variables and their levels chosen for L9 (34) orthogonal array design

1.4 指標(biāo)的測(cè)定

1.4.1 枯草芽胞桿菌活菌數(shù)的測(cè)定

選擇LB固體培養(yǎng)基，使用稀釋涂布平板法，將已涂布的平板倒置，于30 ℃培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)，以對(duì)種子液中枯草芽胞桿菌活菌數(shù)進(jìn)行測(cè)定。

1.4.2 多肽得率的測(cè)定

使用雙縮脲法對(duì)多肽得率進(jìn)行測(cè)定。取0.6 mL發(fā)酵上清液，加入0.6 mL 三氯乙酸溶液(100 g/L)，混勻后靜置10 min后，6 000 r/min離心15 min，取上清液1 mL于試管中，加入4 mL雙縮脲試劑，混勻后靜置60 min，于540 nm處測(cè)定吸光度。以1 mL去離子水代替樣品做參比，牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得多肽質(zhì)量濃度。多肽得率的計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：c為發(fā)酵液多肽質(zhì)量濃度，mg/mL；v為發(fā)酵液體積，mL；m為脫脂蝦粉質(zhì)量，g。

1.4.3 水解度的測(cè)定

水解度是反映蛋白水解過(guò)程中肽鍵的斷裂情況，是衡量蛋白水解程度的重要指標(biāo)。發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮含量使用甲醛電位滴定法測(cè)定[11]；原料中總氮含量參照GB 5009.5—2016，使用凱氏定氮法測(cè)定。水解度的計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

式中：m1為發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮含量，g；m2為脫脂蝦粉中總氮含量，g。

1.4.4 蛋白回收率的測(cè)定

蛋白質(zhì)回收率是指發(fā)酵上清液中可溶性蛋白與原料總蛋白的百分比，用于表征發(fā)酵過(guò)程中菌株分泌蛋白酶對(duì)原料蛋白質(zhì)的利用效率。參照GB 5009.5—2016，使用凱氏定氮法，測(cè)定發(fā)酵上清液與脫脂蝦粉中的總氮含量。蛋白回收率的計(jì)算如公式(3)所示：

(3)

式中：ω1為發(fā)酵上清液總氮含量，g/100g；ω2為脫脂蝦粉總氮含量，g/100g；m1為發(fā)酵上清液質(zhì)量，g；m2為脫脂蝦粉質(zhì)量，g。

1.4.5 體外抗氧化活性

1.4.5.1 自由基清除率

(1)DPPH自由基清除率

參照CHEN等[12]的方法，稍作修改。將發(fā)酵液凍干后，分別配制質(zhì)量濃度為1、2、3、4、5 mg/mL多肽樣液，取1 mL DPPH溶液(0.1 mmol/L，甲醇溶解)，與1 mL樣液混合，室溫下避光靜置30 min，于517 nm處測(cè)得吸光度，以維生素C為陽(yáng)性對(duì)照。DPPH 自由基清除率的計(jì)算如公式(4)所示：

(4)

式中：A1為待發(fā)酵液吸光度；A0為超純水代替發(fā)酵液測(cè)得的吸光度；A2為甲醇代替DPPH溶液測(cè)得的吸光度。

(2)ABTS陽(yáng)離子自由基清除率

參照KETNAWA等[13]的方法，稍作修改。ABTS母液(7 mmol/L ABTS、2.45 mmol/L過(guò)硫酸鉀混合)，于室溫避光反應(yīng)16 h，用甲醇稀釋ABTS母液，使其吸光值在734 nm處為0.7±0.02。將發(fā)酵液凍干后，分別配制質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的多肽樣液。將樣液與ABTS溶液1∶3混合，室溫下避光反應(yīng)6 min，于734 nm處測(cè)定吸光值，以維生素C為陽(yáng)性對(duì)照。ABTS陽(yáng)離子自由基清除率的計(jì)算如公式(5)所示：

(5)

式中：A1為待發(fā)酵液吸光度；A0為超純水代替發(fā)酵液測(cè)得的吸光度；A2為甲醇代替ABTS溶液測(cè)得的吸光度。

(3)羥自由基清除率

參照陳麗花等[14]的方法，將發(fā)酵液凍干后，分別配制質(zhì)量濃度為1、2、3、4、5 mg/mL多肽樣液，取1 mL樣液，加入1 mL硫酸亞鐵溶液(6 mmol/L)、1 mL 過(guò)氧化氫溶液(6 mmol/L)，混勻后靜置反應(yīng)10 min，加入1 mL水楊酸溶液(6 mmol/L)混勻，室溫下靜置30 min，于510 nm處測(cè)定吸光度，以維生素C為陽(yáng)性對(duì)照。羥自由基清除率計(jì)算如公式(6)所示：

(6)

式中：A1為待發(fā)酵液吸光度；A0為超純水代替發(fā)酵液測(cè)得的吸光度；A2為超純水代替水楊酸測(cè)得的吸光度。

1.4.5.2 亞鐵離子螯合力

參照SUN等[15]的方法，將發(fā)酵液凍干后，分別配制質(zhì)量濃度為1、2、3、4、5 mg/mL多肽樣液。取5 mL樣液，再加入0.1 mL氯化亞鐵溶液(2 mmol/L)和0.2 mL菲洛嗪溶液(5 mmol/L)，混勻后反應(yīng)10 min，于562 nm處測(cè)定吸光度，以維生素C為陽(yáng)性對(duì)照。亞鐵離子螯合力的計(jì)算如公式(7)所示：

(7)

式中：A1為待發(fā)酵液吸光度；A0為超純水代替發(fā)酵液測(cè)得的吸光度。

1.4.5.3 總抗氧化能力

將發(fā)酵液凍干后，分別配制質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL多肽樣液，使用總抗氧化能力[鐵離子還原能力(ferric reduction ability plasma assay，F(xiàn)RAP)]試劑盒對(duì)發(fā)酵液的還原力進(jìn)行測(cè)定，以維生素C為陽(yáng)性對(duì)照。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及顯著性分析(P<0.05)，使用GraphPad Prism 7.0作圖，使用minitab進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵條件單因素試驗(yàn)

2.1.1 發(fā)酵時(shí)間的確定

時(shí)間對(duì)微生物生長(zhǎng)代謝有顯著影響。如圖1所示，隨發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)，多肽得率先增后降，水解度和蛋白回收率均呈上升趨勢(shì)。隨發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)，菌株進(jìn)入衰亡期，產(chǎn)酶量下降，同時(shí)發(fā)酵體系中多肽被進(jìn)一步水解為氨基酸，因此發(fā)酵后期多肽得率出現(xiàn)下降[16]。水解度反映肽鍵斷裂的程度，隨發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)，發(fā)酵體系中的蛋白酶總量逐漸增多，因此水解度呈上升趨勢(shì)，這與WANG等[17]的研究結(jié)果一致。水解度高說(shuō)明發(fā)酵體系中小分子物質(zhì)濃度升高，影響蛋白酶對(duì)底物蛋白的利用效率，因此蛋白回收率最終趨于平緩。結(jié)合實(shí)際情況，發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)不利于工業(yè)生產(chǎn)，能耗高成本大，因此選擇1～3 d為后續(xù)正交試驗(yàn)范圍。

A-多肽得率；B-水解度；C-蛋白回收率圖1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)南極磷蝦粉的影響Fig.1 Effect of fermentation time on Antarctic krill powder注：不同字母上標(biāo)表示差異顯著(P<0.05)(圖2～圖4同)

2.1.2 料液比的確定

料液比是限制發(fā)酵效能的關(guān)鍵因素[18]。如圖2所示，隨料液比的升高，發(fā)酵液中多肽得率呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，水解度先快速增長(zhǎng)后趨于平穩(wěn)，蛋白回收率則隨料液比的升高而下降。當(dāng)料液比較低時(shí)，菌株因營(yíng)養(yǎng)不足而生長(zhǎng)緩慢，分泌蛋白酶較少，不利于蛋白水解。隨料液比增高，菌株因營(yíng)養(yǎng)充足而生長(zhǎng)迅速，發(fā)酵體系中蛋白酶豐富，蛋白水解程度增高。但當(dāng)料液比過(guò)高時(shí)，大量蛋白酶使體系中的多肽進(jìn)一步降解為小肽與氨基酸，導(dǎo)致多肽得率下降而水解度仍呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。蛋白回收率呈現(xiàn)完全相反的變化趨勢(shì)，說(shuō)明發(fā)酵過(guò)程中菌株所分泌的蛋白酶對(duì)底物的利用率不高，底物蛋白并未得到完全利用[19]。因此選擇料液比1∶100～5∶100(g∶mL)進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。

A-多肽得率；B-水解度；C-蛋白回收率圖2 料液比對(duì)南極磷蝦粉的影響Fig.2 Effect of material liquid ratio on Antarctic krill powder

2.1.3 初始接種量的確定

適宜的接種量可以提高發(fā)酵速度，有效節(jié)約時(shí)間和成本。如圖3所示，多肽得率隨接種量的增多而先增后減，水解度與蛋白回收率則呈上升趨勢(shì)。當(dāng)接種量較低時(shí)，發(fā)酵體系中微生物濃度過(guò)低，產(chǎn)酶量有限，底物蛋白水解程度低，發(fā)酵液中多肽含量少。當(dāng)接種量過(guò)高時(shí)，底物營(yíng)養(yǎng)不足，微生物生長(zhǎng)受限，發(fā)酵體系中的多肽優(yōu)先用于微生物生長(zhǎng)，多肽得率下降。水解度隨接種量的升高而升高，最終趨于平穩(wěn)，同時(shí)蛋白回收率呈上升趨勢(shì)，說(shuō)明底物蛋白充足，發(fā)酵體系中的蛋白酶含量與底物蛋白濃度達(dá)到平衡狀態(tài)。綜合考慮，選擇接種量1.5×106～1.5×108CFU/mL進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。

2.1.4 初始pH的確定

pH會(huì)影響微生物對(duì)底物的利用及其分泌蛋白酶的活性，從而影響發(fā)酵效率，因此需對(duì)發(fā)酵的初始pH進(jìn)行確定。如圖4所示，隨初始pH的升高，多肽得率與水解度呈先增后減的趨勢(shì)，蛋白回收率緩慢升高。pH的改變使多肽得率有所變化，但各組間并不存在顯著差異?？莶菅堪麠U菌在發(fā)酵過(guò)程中主要分泌的蛋白酶為堿性蛋白酶，因此當(dāng)處于堿性環(huán)境時(shí)水解度與蛋白回收率更高。由圖5可知，pH對(duì)發(fā)酵效能影響不大，且原始pH在7.0～8.0，因此在后續(xù)正交試驗(yàn)中不需對(duì)此因素進(jìn)行優(yōu)化，選擇原始pH即可。

A-多肽得率；B-水解度；C-蛋白回收率圖3 接種量對(duì)南極磷蝦粉的影響Fig.3 Effect of inoculation amount on Antarctic krill powder

A-多肽得率；B-水解度；C-蛋白回收率圖4 初始pH對(duì)南極磷蝦粉的影響Fig.4 Effect of initial pH on Antarctic krill powder

2.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇發(fā)酵時(shí)間(A)、料液比(B)及初始接種量(C)為因素，以多肽得率、水解度、蛋白回收率為指標(biāo)，進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)，優(yōu)化南極磷蝦粉的發(fā)酵工藝，結(jié)果如表2所示。

由極差可知，發(fā)酵條件對(duì)多肽得率的影響主次順序依次為：C>A>B，發(fā)酵條件對(duì)水解度的影響主次順序依次為：A>B>C，發(fā)酵條件對(duì)蛋白回收率的影響主次順序依次為：B>C>A。由k值可知，對(duì)多肽得率和水解度而言，最佳發(fā)酵條件為A3B2C3，即發(fā)酵時(shí)間3 d、料液比3∶100(g∶mL)、初始接種量1.5×108CFU/mL，對(duì)蛋白回收率而言，最佳發(fā)酵條件為A3B1C3，即發(fā)酵時(shí)間3 d、料液比1∶100(g∶mL)、初始接種量1.5×108CFU/mL。對(duì)兩種工藝進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表3和表4所示，多肽得率兩種工藝無(wú)顯著差異，水解度A3B2C3更高，可達(dá)(13.50±0.19)%，蛋白回收率A3B1C3更高，可達(dá)(14.39±0.48)%。

2.3 南極磷蝦粗多肽的體外抗氧化活性分析

2.3.1 自由基清除率

氧化反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生損害細(xì)胞的自由基，主要包括活性氮(reactive nitrogen species，RNS)和活性氧(reactive oxygen species，ROS)兩種[20]。因此，自由基清除實(shí)驗(yàn)是篩選具有高抗氧化活性蛋白質(zhì)水解物的一種有效、簡(jiǎn)便的方法。

DPPH自由基為活性氮自由基，其清除率廣泛用于天然提取物抗氧化活性的評(píng)估中。如圖5-A所示，兩種南極磷蝦粗多肽對(duì)DPPH自由基的清除效果隨樣品質(zhì)量濃度的增加先升高，后逐漸平穩(wěn)。A3B1C3組粗多肽對(duì)DPPH自由基的半數(shù)效應(yīng)濃度值(half clearance concentration，EC50)為1.55 mg/mL，A3B2C3組粗多肽對(duì)DPPH自由基的EC50值為2.24 mg/mL，對(duì)比PARK等[21]的研究結(jié)果，2種南極磷蝦粗多肽對(duì)DPPH自由基的清除能力優(yōu)于多數(shù)南極磷蝦酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除能力，且兩者中前者的清除能力更強(qiáng)，這可能是因?yàn)楦鞣N肽段間存在相互促進(jìn)的作用，且粗多肽中可能含有少量殼聚糖，也會(huì)提高粗多肽對(duì)DPPH 自由基的清除能力，但與維生素C對(duì)照組對(duì)DPPH自由基的清除能力仍存在差異。

表2 枯草芽胞桿菌發(fā)酵制備南極磷蝦肽正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of orthogonal test in preparation of Bacillus subtilis

表3 枯草芽胞桿菌發(fā)酵制備南極磷蝦肽正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Analysis of variance of orthogonal test results of Bacillus subtilis

表4 最佳發(fā)酵條件實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Experimental results of optimal fermentation conditions

ABTS陽(yáng)離子自由基清除率主要用于評(píng)價(jià)親水性和親脂性化合物的抗氧化活性[22]。如圖5-B所示，2種南極磷蝦粗多肽對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除效果與樣品質(zhì)量濃度的關(guān)系與DPPH自由基清除效果趨勢(shì)一致，其對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的EC50值均為0.16 mg/mL，高于對(duì)DPPH自由基的EC50值，說(shuō)明2種南極磷蝦粗多肽對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除能力更強(qiáng)，這與LATORRES等[23]的研究一致，且當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí)與維生素C對(duì)照組對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除效果接近。

羥自由基為活性氧自由基，是最具活性的自由基，可與生物體內(nèi)的大多數(shù)生物分子發(fā)生反應(yīng)，因此羥自由基清除能力在抗氧化活性評(píng)估中至關(guān)重要。如圖5-C所示，兩種南極磷蝦粗多肽的羥自由基清除效果與樣品質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。A3B1C3組粗多肽對(duì)羥自由基的EC50值為3.95 mg/mL，A3B2C3組粗多肽對(duì)羥自由基的EC50值為4.05 mg/mL，說(shuō)明前者的羥自由基清除能力強(qiáng)于后者，推測(cè)前者中含有更多由極性氨基酸組成的肽段[24]，但與維生素C對(duì)照組對(duì)羥自由基的清除能力相比，仍處于較低水平。

A-DPPH自由基清除率；B-ABTS陽(yáng)離子自由基清除率；C-羥自由基清除率圖5 不同南極磷蝦粗多肽的抗氧化分析Fig.5 Antioxidant analysis of different Antarctic krill crude peptides注：A～D不同字母表示同一南極磷蝦粗多肽在不同質(zhì)量濃度下自由基清除率差異顯著(P<0.05)；a～c不同字母表示在相同質(zhì)量濃度下各南極磷蝦粗多肽間自由基清除率差異顯著(P<0.05)(圖6、圖7同)

2.3.2 亞鐵離子螯合力

機(jī)體內(nèi)多數(shù)氧化反應(yīng)都需要過(guò)渡金屬離子的催化，因此亞鐵離子螯合力廣泛用于評(píng)價(jià)多肽的抗氧化能力[25]。結(jié)果表明，兩種南極磷蝦粗多肽的亞鐵離子螯合力均與樣品質(zhì)量濃度具有量效關(guān)系。A3B1C3組粗多肽對(duì)亞鐵離子螯合力的EC50值為0.22 mg/mL，A3B2C3組粗多肽的EC50值為0.23 mg/mL，二者無(wú)顯著差異，但均處于較高水平，說(shuō)明南極磷蝦粗多肽中可能含有較多由中性和酸性氨基酸組成的肽段，其側(cè)鏈中的羥基和氨基易于與亞鐵離子結(jié)合，從而達(dá)到抑制氧化的作用[25]，但仍低于維生素C對(duì)照組的亞鐵離子螯合力。

圖6 不同南極磷蝦粗多肽的亞鐵離子螯合力Fig.6 Fe2+ chelating activity of different Antarctic krill crude polypeptides

2.3.3 總抗氧化能力

FRAP法是測(cè)定產(chǎn)物總抗氧化能力的常用方法，本實(shí)驗(yàn)以Trolox為參考抗氧化劑化合物，南極磷蝦粗多肽的總抗氧化能力以Trolox等效抗氧化能力表示。如圖7所示，隨南極磷蝦粗多肽質(zhì)量濃度的升高，其總抗氧化能力呈增高趨勢(shì)，且A3B1C3組的總抗氧化能力高于A3B2C3組，說(shuō)明前者的組分中含有很好的氫或電子供應(yīng)體，具有更強(qiáng)的還原力[25]，但仍低于維生素C的總抗氧化能力。

A-不同粗多肽總抗氧化能力；B-維生素C的總抗氧化能力圖7 不同南極磷蝦粗多肽的總抗氧化能力Fig.7 Total antioxidant capacity of different Antarctic krill crude peptides

3 結(jié)論

本研究以南極磷蝦粉為原料，脫脂后利用枯草芽胞桿菌發(fā)酵制備南極磷蝦蛋白肽，得到2種最佳發(fā)酵工藝，通過(guò)體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)，兩種南極磷蝦粗多肽均具有良好的抗氧化活性，其中高水解度組粗多肽的總抗氧化能力更強(qiáng)，高蛋白回收率組粗多肽的DPPH自由基清除率、ABTS陽(yáng)離子自由基清除率更強(qiáng)，但2組粗多肽的亞鐵離子螯合力則無(wú)顯著差別。本研究初步證實(shí)通過(guò)微生物發(fā)酵制備具有抗氧化性的南極磷蝦蛋白肽具有可行性，但并未對(duì)此多肽進(jìn)行分離純化，多肽組成及抗氧化機(jī)制尚不明確，后續(xù)可針對(duì)單一肽段進(jìn)行深入研究，以優(yōu)選出抗氧化活性突出的特定肽段，為南極磷蝦粉的全效利用和生物加工提供參考。