魏敏華，李宇虹，張佳蓉，孟靜，孟燕，王浚哲，張成林

(天津科技大學 生物工程學院，天津，300457)

5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid)是生物體內合成葉綠素、血紅素和維生素B12等四氫吡咯化合物的前體物，廣泛存在于微生物及動植物細胞中[1-2]。5-氨基乙酰丙酸因具有很好的安全性、特異性和滲透性，近年來被應用于腫瘤的定位和光動力學診斷[3]。此外，該物質還被用作植物生長促進劑、殺蟲劑、除草劑等[4]。由此可見，5-氨基乙酰丙酸具有廣闊的市場前景。

目前工業(yè)上主要采用化學法合成5-氨基乙酰丙酸，但該方法成本較高且對環(huán)境污染嚴重[5]。近年來，隨著代謝工程和合成生物學的迅猛發(fā)展，生物法合成5-氨基乙酰丙酸倍受關注，底盤細胞主要集中于大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌。目前已發(fā)現C4和C5兩條5-氨基乙酰丙酸途徑[6]。前者以甘氨酸和琥珀酰輔酶A為前體經5-氨基乙酰丙酸合成酶催化合成。利用該途徑合成5-氨基乙酰丙酸的研究較為深入，主要策略為在底盤細胞中過表達5-氨基乙酰丙酸合成酶編碼基因，并在發(fā)酵過程中添加甘氨酸和(或)琥珀酸(或琥珀酰輔酶A)[2,7-8]。但甘氨酸對細胞具有毒害作用，且底物添加增加了發(fā)酵工藝的復雜性和生產成本[2]。C5途徑以L-谷氨酸為前體合成，因此可利用葡萄糖直接發(fā)酵合成(圖1)。谷氨酸棒桿菌因能在天然條件下合成L-谷氨酸，被視為5-氨基乙酰丙酸的理想底盤細胞[9-11]。RAMZI等[10]首次報道了在谷氨酸棒桿菌中過表達來源于沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)的5-氨基乙酰丙酸合成關鍵酶谷氨酰-tRNA還原酶編碼基因hemAM和谷氨酸-1-半醛氨基轉移酶編碼基因hemL，重組菌株可合成457 mg/L 5-氨基乙酰丙酸，實現了利用C5途徑直接發(fā)酵合成5-氨基乙酰丙酸。同時期，YU等[11]在谷氨酸棒桿菌中構建了C5途徑，并發(fā)現Fe2+和溶氧是影響5-氨基乙酰丙酸的關鍵因素，經優(yōu)化可合成1.79 g/L 5-氨基乙酰丙酸。我們在前期研究中，通過強化5-氨基乙酰丙酸合成途徑、增強輔酶合成、動態(tài)調控三羧酸(tricarboxylic acid，TCA)循環(huán)及5-氨基乙酰丙酸輸出等策略，使其產量提高到3.16 g/L[12]。

本研究擬在前期研究基礎上，進一步探索影響5-氨基乙酰丙酸的關鍵因素。包括阻斷L-谷氨酸的輸出、利用脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)腳手架組裝谷氨酰-tRNA還原酶和谷氨酸-1-半醛氨基轉移酶、強化TCA循環(huán)等(圖1)，以期為提升5-氨基乙酰丙酸的合成效率提供依據。

圖1 5-氨基乙酰丙酸合成途徑及本研究主要策略Fig.1 Pathway for synthesis of 5-aminolevulinic acid and the strategies used in this study注：Glc，葡萄糖；PEP，磷酸烯醇式丙酮酸；Pyr，丙酮酸；OAA，草酰乙酸；AcCoA，乙酰輔酶A；CIT，檸檬酸；ICI，異檸檬酸；α-KG，α-酮戊二酸；SUCC，琥珀酸輔酶A；SUC，琥珀酸；Glu，谷氨酸；GlutRNA，谷氨酸酰tRNA；GSA，谷氨酸-1-半醛；5-ALA，5-氨基乙酰丙酸；ADB，人工DNA結合域；B，ADB結合DNA序列

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

無機鹽、葡萄糖等，國藥集團試劑有限公司；5-氨基乙酰丙酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；DNA提取等試劑盒，美國Omega Bio-Tek公司；限制性內切酶、DNA聚合酶等，寶日醫(yī)生物技術(北京)有限公司；一步法克隆試劑盒，南京諾唯贊生物科技有限公司；三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)檢測試劑盒，普洛麥格(北京)生物技術有限公司；NADPH檢測試劑盒，美國博世生物技術有限公司；人工DNA結合域ADB2和ADB3編碼序列由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

PTC-1148型聚合酶鏈式反應PCR儀，美國Bio-Rad公司。

1.2 菌株與質粒

本研究中使用的菌株和質粒見表1。其中E.coliDH5α用于質粒構建和復制，谷氨酸棒桿菌C.glutamicumATCC13032為出發(fā)菌株。

1.3 引物

引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，序列見表2。

表1 菌株和質粒Table 1 Strains and plasmids

1.4 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，pH 7.0～7.5。

BHIS培養(yǎng)基(g/L)：Brain-Heart Infusion 37，山梨醇91，pH 7.0～7.2。

種子培養(yǎng)基(g/L)：Brain-Heart Infusion 37，葡萄糖0.5，自然pH。

CGXII培養(yǎng)基：葡萄糖50 g/L，(NH4)2SO45 g/L，尿素1 g/L，KH2PO40.5 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO40.125 g/L，3-嗎啉丙磺酸42 g/L，ZnSO4·7H2O 10 mg/L，CuSO40.2 mg/L，NiCl2·6H2O 0.02 mg/L，生物素0.2 mg/L，pH 7.0～7.5。

1.5 質粒及菌株的構建

利用引物HemA-1和HemA-2擴增ADB2序列利用一步法克隆試劑盒連接至經PstI酶切的pAL4質粒；獲得的重組質粒經XbaI酶切與利用引物HemL-1和HemL-2擴增的ADB3序列連接，經轉化、篩選、鑒定后將重組質粒命名為pX-AL。分別將合成的ADB2結合位點B2及ADB3結合位點B3以1∶1、2∶1及1∶2比例合成連接至經BamH I酶切的pEC-XK99EΔlacIΔPtrc，經轉化、篩選、鑒定后將重組質粒命名為pE11、pE21和pE12[13-14]。

表2 引物Table 2 Primers

利用基于自殺質粒pK18mobsacB的基因重組方法進行基因敲除和敲入。以敲除NCgl1221為例，分別利用引物NCgl1221-1/NCgl1221-2和NCgl1221-3/NCgl1221-4擴增NCgl1221基因上下游同源臂，再利用引物NCgl1221-1/NCgl1221-4經重疊PCR獲得融合片段ΔNCgl1221，將其連接至經XbaI酶切的pK18mobsacB，獲得pK18mob-ΔNCgl1221。重組質粒pK18 mob-ΔNCgl1221電轉化至C.glutamicumATCC13032，經2輪篩選并鑒定后獲得重組菌株C.glutamicumΔNCgl1221。利用相同的方法獲得菌株ALA-5～ALA-10[15]。

1.6 搖瓶發(fā)酵實驗

將菌株在LB斜面培養(yǎng)基活化后，挑取適量菌體至種子培養(yǎng)基(根據需要添加100 mg/L氨芐青霉素或/和50 mg/L卡那霉素)，32 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)10 h，即為種子培養(yǎng)物。以10%的接種量將上述每個種子培養(yǎng)物分別接種至3個30 mL CGXII培養(yǎng)基(根據需要添加100 mg/L氨芐青霉素或/和50 mg/L卡那霉素)，用氨水維持pH 7.0～7.5，于32 ℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。每個實驗共重復3次。

1.7 檢測與分析方法

菌體生物量以OD600值計。發(fā)酵結束后發(fā)酵液經13 000 r/min離心2 min后取上清液適當稀釋。取 2 mL 上清液，加入0.5 mL乙酰丙酮和1 mL的乙酸鈉緩沖液(1 mol/L，pH 4.6)，沸水浴15 min后冷卻至室溫。取上述反應液2 mL與2 mL對二甲氨基苯甲醛顯色劑混合，反應30 min后于554 nm下測定吸光度[15]。

2 結果與分析

2.1 敲除NCgl1221基因阻斷L-谷氨酸的外排

如前所述，谷氨酸棒桿菌C.glutamicumATCC13032在天然條件下即可積累L-谷氨酸，而L-谷氨酸是5-氨基乙酰丙酸的前體物。NCgl1221編碼的通道蛋白MscCG是L-谷氨酸的輸出載體，可將胞內過量的L-谷氨酸分泌至胞外[16]。研究表明，敲除NCgl1221基因可阻斷胞內L-谷氨酸的分泌[17]。采用重疊PCR擴增NCgl1221基因同源臂同源片段，并連接至自殺質粒pK18mobsacB，獲得重組質粒pK18-ΔNCgl1221。將pK18-ΔNCgl1221轉化至C.glutamicumATCC13032，經2輪重組、篩選后挑取單菌落進行菌落PCR驗證。結果如圖2所示，獲得堿基數約為1 000 bp和2 932 bp的片段，分別與敲除和未敲除的NCgl1221一致(分別為1 009 bp和2 932 bp)。表明該基因成功敲除，將其命名為C.glutamicumΔNCgl1221。

為考察C.glutamicumΔNCgl1221的特性，對其進行搖瓶培養(yǎng)。與C.glutamicumATCC13032相比，C.glutamicumΔNCgl1221的生物量未見明顯差異。但其谷氨酸分泌量減少到痕量(圖3-a)。將克隆有hemAM和hemL(分別編碼5-氨基乙酰丙酸合成關鍵酶谷氨酰-tRNA還原酶和谷氨酸-1-半醛氨基轉移酶)的重組質粒pAL4分別轉化至C.glutamicumATCC13032和C.glutamicumΔNCgl1221(分別獲得菌株ALA-C和ALA-1)，以考察敲除NCgl1221對其合成5-氨基乙酰丙酸的影響。結果如圖3-b所示，二者生長亦無差異，但C.glutamicumΔNCgl1221的5-氨基乙酰丙酸產量達到0.62 g/L，較前者提高26.5%。上述結果表明，敲除NCgl1221基因可有效阻止胞內L-谷氨酸的外排，為5-氨基乙酰丙酸的合成提供更多前體，從而促進其合成。

M-Marker；1-C.glutamicumΔNCgl1221；2-C.glutamicumATCC13032菌圖2 C.glutamicumΔNCgl1221菌落PCR鑒定圖譜Fig.2 Map for PCR identification of C.glutamicumΔNCgl1221

a-菌株合成L-谷氨酸的特性；b-菌株合成5-氨基乙酰丙酸的特性圖3 NCgl1221敲除對工程菌株特性的影響Fig.3 Effect of NCgl1221 deletion on characteristics of engineered strains

2.2 利用DNA腳手架體系調控關鍵酶的表達

在微生物尤其是原核生物細胞內，合成途徑中前一個酶將中間代謝產物傳遞給下一個酶完全依賴于該產物的自由擴散及與酶的碰撞，從而限制了反應效率[18]。此外，對細胞生長和代謝有毒害作用的中間代謝產物不能及時消耗亦會影響其代謝速率[19-20]。DNA腳手架體系可將數種酶有序組裝在DNA腳手架上，減小了酶與酶之間中間代謝產物的傳遞難度并有效緩解其過量積累，從而提高代謝反應效率。其原理是將含有人工DNA結合域(artificial DNA binding domain，ADB)的鋅指蛋白融合于關鍵酶的N端或C端；不同的ADB識別和結合的靶DNA序列B不同；將不同靶DNA序列按需求串聯到質粒上，帶有ADB的關鍵酶則會按順序組裝到靶DNA序列上(圖4-a)，從而縮小了酶與酶中間代謝產物傳遞的空間[21]。LIU等[22]利用該系統在枯草芽孢桿菌中組裝N-乙酰氨基葡萄糖合成關鍵酶氨基葡萄糖-果糖-6-磷酸氨基轉移酶和氨基葡萄糖-磷酸N-乙酰轉移酶，最高使得N-乙酰氨基葡萄糖產量提高2.5倍。

本研究利用DNA腳手架體系組裝5-氨基乙酰丙酸合成關鍵酶谷氨酰-tRNA還原酶和谷氨酸-1-半醛氨基轉移酶，以考察其對5-氨基乙酰丙酸合成效率的影響。如圖4-a所示，本研究構建了3種DNA腳手架，以獲得最佳組合方式。采用搖瓶發(fā)酵實驗考察菌株發(fā)酵特性，結果如圖4-b所示。與對照菌株ALA-1相比，3株菌的生長未見明顯差異。其中ALA-2的5-氨基乙酰丙酸產量與ALA-1接近(0.61 g/L)，ALA-4的產量明顯低于ALA-1，ALA-3產量達到0.84 g/L，較ALA-1提高35.5%。由此可見，以DNA腳手架B2和B3比例為2∶1時效果最佳。

a-DNA腳手架體系應用策略；b-菌株發(fā)酵特性圖4 DNA腳手架體系及其對工程菌5-氨基乙酰丙酸合成的影響Fig.4 DNA scaffold systems and their effects on synthesis of 5-aminolevulinic acid of engineered strains

2.3 強化草酰乙酸供應對5-氨基乙酰丙酸合成的影響

草酰乙酸是TCA循環(huán)的重要前體物。在谷氨酸棒桿菌中，草酰乙酸主要來源于丙酮酸羧化酶(由pyc編碼)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(由ppc編碼)催化的回補途徑(anaplerotic pathway)[23]。研究表明，二者均能增強草酰乙酸的供應并促進細胞生長。此外，有研究表明來源于曼海姆產琥珀酸菌(Mannheiemiasucciniciproducens)的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(由pckA編碼)在催化草酰乙酸合成的同時還可生成ATP[24]。為考察上述3種羧化酶對5-氨基乙酰丙酸合成的影響，分別采用將出發(fā)菌株ALA-3的pyc和ppc的啟動子替換為強啟動子Ptuf、基因組整合Ptuf-pckA的方式強化其表達。

分別將重組質粒pK18mobsacBPpyc::Ptuf、pK18mobsacBPppc::Ptuf和pK18mobsacBPtuf-pckA電轉化至ALA-3，經2輪篩選后挑取單菌落進行菌落PCR驗證。如圖5所示，分別獲得堿基數約為2 000、2 000 、3 000 bp的片段，與實際值一致(分別為2 100、2 040、2 920 bp)，表明啟動子替換成功，分別命名為ALA-5、ALA-6和ALA-7。

M-Marker；1-ALA-3；2-ALA-5、ALA-6或ALA-7a-ALA-5的鑒定圖譜；b-ALA-6的鑒定圖譜；c-ALA-7的鑒定圖譜圖5 菌株ALA-5、ALA-6和ALA-7菌落PCR鑒定圖譜Fig.5 Map for PCR identification of ALA-5, ALA-6 and ALA-7

搖瓶發(fā)酵實驗結果表明，強化丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化的2條回補途徑均有利于5-氨基乙酰丙酸的合成，3株菌的產量分別達到0.96、1.07、1.12 g/L，較對照菌株ALA-3提高14.2%、27.4%和33.3%(圖6-a)，可見過表達pckA效果最佳。推測原因是，5-氨基乙酰丙酸合成途徑中谷氨酸氨酰-tRNA合成酶需要ATP，來源于M.succiniciproducens的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶在催化草酰乙酸合成的同時為其提供ATP。為驗證該推測，測定了菌株的胞內ATP濃度，結果表明ALA-7的胞內ATP濃度顯著高于ALA-3、ALA-5和ALA-6(圖6-b)。由于過表達ppc基因的效果優(yōu)于過表達pyc基因，故為進一步提高草酰乙酸供應，將菌株ALA-7中的ppc基因啟動子替換為Ptuf，獲得菌株ALA-8。發(fā)酵實驗結果表明，該菌株的生長和5-氨基乙酰丙酸產量顯著下降(圖6-a)。推測原因是，過表達pckA后使得磷酸烯醇式丙酮酸向草酰乙酸的代謝流增強，而向丙酮酸的代謝流相對減弱；在此基礎上過表達ppc使得更多的磷酸烯醇式丙酮酸用于草酰乙酸合成，而非用于丙酮酸，從而使得TCA循環(huán)代謝流減弱，影響了細胞生長和5-氨基乙酰丙酸的合成。

a-菌株發(fā)酵特性；b-胞內ATP濃度圖6 增強回補途徑對菌株5-氨基乙酰丙酸發(fā)酵性能的影響Fig.6 Effect of enhancing anaplerotic pathway on 5-aminolevulinic acid production of engineered strains

2.4 增強TCA循環(huán)對5-氨基乙酰丙酸合成的影響

由gltA編碼的檸檬酸合成酶催化草酰乙酸和乙酰輔酶A合成檸檬酸，是TCA循環(huán)的第1個關鍵酶[25]。前期研究發(fā)現過表達該基因可增強TCA循環(huán)代謝流。為考察gltA過表達對5-氨基乙酰丙酸合成的影響，將其啟動子替換為強啟動子Ptuf。將重組質粒pK18-PgltA::Ptuf電轉化至菌株ALA-7，經2輪重組、篩選后挑取單菌落進行菌落PCR驗證。結果如圖7-a所示，獲得堿基數約為1 500 bp，與替換為Ptuf的實際值一致(1 422 bp)，表明啟動子替換成功，命名為ALA-9。搖瓶發(fā)酵實驗結果表明，菌株ALA-9的生物量高于ALA-7；其5-氨基乙酰丙酸的產量為1.26 g/L，提高12.5%，暗示過表達gltA有利于增強TCA循環(huán)代謝流，從而為5-氨基乙酰丙酸的合成提供更多前體物L-谷氨酸。

2.5 增強NADPH供應對5-氨基乙酰丙酸合成的影響

合成L-谷氨酸的谷氨酸脫氫酶以及谷氨酰-tRNA還原酶均需NADPH為輔酶，故推測強化NADPH供應可能有利于5-氨基乙酰丙酸的合成。吡啶核苷酸轉氫酶(由pntAB編碼)能夠催化NAD+生成NADPH，增強NADPH的供應[26]。與大腸桿菌不同，谷氨酸棒桿菌中未發(fā)現pntAB基因。異檸檬酸既可經異檸檬酸脫氫酶催化合成α-酮戊二酸，亦可經異檸檬酸裂解酶(由aceA編碼)裂解為乙醛酸和琥珀酸。前期研究表明，敲除aceA基因可提高α-酮戊二酸的合成。故將來源于大腸桿菌的pntAB基因連同Ptuf整合到菌株ALA-9基因組aceA基因位點，以期增強α-酮戊二酸及NADPH供應。如圖7-b所示，對重組菌株進行菌落PCR鑒定，獲得堿基數約為1 500 bp的片段，與pntAB基因整合菌株的實際值一致(1 612 bp)，表明pntAB基因成功整合，將其命名為ALA-10。

M-Marker；1-ALA-8；2-ALA-9或ALA-10a-ALA-9的鑒定圖譜；b-ALA-10的鑒定圖譜圖7 菌株ALA-9和ALA-10菌落PCR鑒定圖譜Fig.7 Map for PCR identification of ALA-9 andALA-10

搖瓶發(fā)酵實驗結果表明，菌株ALA-10與出發(fā)菌株ALA-9生長無明顯差異，但其5-氨基乙酰丙酸的產量提高至1.47 g/L，提升16.7%(圖8)。檢測了菌株ALA-10胞內NADPH濃度，發(fā)現其水平較ALA-9提高25.9%。上述結果表明，NADPH供應是5-氨基乙酰丙酸合成的瓶頸，過表達pntAB可有效提升NADPH 供應從而提高5-氨基乙酰丙酸合成效率。

圖8 ALA-9和ALA-10的生長和5-氨基乙酰丙酸生產性能Fig.8 The 5-aminolevulinic acid production and growth of ALA-9 and ALA-10

3 結論

本研究首先通過敲除L-谷氨酸轉運蛋白編碼基因阻斷胞內L-谷氨酸的外排，為5-氨基乙酰丙酸的合成提供了前體物質。然后，將5-氨基乙酰丙酸合成關鍵酶谷氨酰-tRNA還原酶和谷氨酸-1-半醛氨基轉移酶按比例組裝至DNA腳手架上，以縮短二者之間中間代謝產物的傳遞空間，使得5-氨基乙酰丙酸產量提高35.3%。在此基礎上，通過過表達gltA、pckA和pntAB強化TCA循環(huán)以及ATP和NADPH的供應。獲得的菌株經搖瓶發(fā)酵48 h，其5-氨基乙酰丙酸產量達到1.47 g/L。上述策略可為進一步提升5-氨基乙酰丙酸的生物合成效率提供依據。