張琦，劉秀霞，楊艷坤，白仲虎*

1(江南大學(xué),工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫,214122)2(江南大學(xué),糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫,214122)3(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫,214122)

谷氨酸棒桿菌是一種來(lái)源于土壤的革蘭氏陽(yáng)性菌，由于其無(wú)內(nèi)毒素、胞外幾乎無(wú)水解酶活性等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)在被作為工業(yè)生產(chǎn)菌株來(lái)發(fā)酵生產(chǎn)蛋白質(zhì)的應(yīng)用已經(jīng)越來(lái)越廣泛。作為一種被廣泛應(yīng)用于蛋白生產(chǎn)的表達(dá)宿主，對(duì)其蛋白編碼基因的改造具有相當(dāng)高的實(shí)際應(yīng)用前景[1-2]。

在實(shí)驗(yàn)室的前期工作中，我們通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)了NCgl2632可能是影響谷氨酸棒桿菌能量代謝的關(guān)鍵基因之一[3]，NCBI預(yù)測(cè)基因NCgl2632預(yù)測(cè)編碼乙酰輔酶A酰基轉(zhuǎn)移酶[4]，乙酰輔酶A酰基轉(zhuǎn)移酶催化蛋白質(zhì)的?；腿ヵ；殉蔀檎婧松锏鞍踪|(zhì)修飾中最普遍的方式之一[5]。乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶(acetyl CoA acetyltransferase, AACT)也稱為乙酰乙酰輔酶A硫解酶，可以催化2個(gè)乙酰-CoA分子的縮合形成乙酰乙酰-CoA[6]。在原核生物中，AACT催化聚羥基丁酸酯(polyhydroxybutyrate, PHB)是生物合成的第一步。來(lái)自微生物中乙酰-CoA的常見PHB生物合成包括3個(gè)基本酶促步驟：縮合，還原和聚合。乙酰輔酶A酰基轉(zhuǎn)移酶是催化聚羥基丁酸酯合成的第一步。乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶(3-ketothiolase, PhaA)負(fù)責(zé)2個(gè)乙酰-CoA部分縮合成乙酰乙酰-CoA。乙酰乙酰輔酶A還原酶(acetoacetyl-CoA reductase, PhaB)將乙酰乙酰-CoA還原為3-羥基丁酰-CoA，然后PHB合酶(PHA synthase, PhaC)催化3-羥基丁?；?CoA的聚合以合成PHB[7]。目前PHB合成途徑已在多種原核生物中實(shí)現(xiàn)表達(dá)，并且能和其他多種產(chǎn)物共同生產(chǎn)[8-10]。而谷氨酸棒桿菌野生型菌株中由于缺乏PHB合成酶基因，無(wú)法產(chǎn)生PHB[11]。

蛋白human MutT homolog 1(hMTH1)是一種氧化核苷酸三磷酸的水解酶。細(xì)胞中活性氧所產(chǎn)生的氧化性DNA損傷會(huì)導(dǎo)致突變或細(xì)胞死亡，8-氧代鳥嘌呤(8-oxo-dGTP)是一種主要的氧化性DNA 損傷產(chǎn)物，由于其堿基配對(duì)的特性，可引起A∶T到C∶G或G∶C到T∶A的突變[12-13]。hMTH1廣泛分布于線粒體和細(xì)胞核中，可以水解復(fù)制過程中氧化的核苷酸三磷酸，將8-oxodGTP和其他氧化的dNTP水解為單磷酸形式，然后將其排到細(xì)胞外基質(zhì)中，從而防止它們摻入DNA并導(dǎo)致G到T的轉(zhuǎn)化，防止癌細(xì)胞中致命的DNA損傷[14-18]。目前，在人體和動(dòng)物細(xì)胞中開發(fā)hMTH1抗體以研制針對(duì)癌癥和腫瘤細(xì)胞藥物的研究已經(jīng)非常廣泛[19-21]。但是，在原核細(xì)胞中關(guān)于hMTH1的表達(dá)的報(bào)道卻很少，該蛋白作為1個(gè)小分子新型蛋白，同時(shí)也有相當(dāng)?shù)乃幱脻摿?，值得在谷氨酸棒桿菌中嘗試表達(dá)研究。

本研究針對(duì)基因NCgl2632進(jìn)行了過表達(dá)和敲除改造，檢測(cè)了改造菌株中生長(zhǎng)曲線和胞內(nèi)ATP水平的變化，同時(shí)檢測(cè)了表達(dá)不同外源蛋白的差異，在此基礎(chǔ)上敲除基因NCgl0909進(jìn)行共同改造，并選取了新蛋白hMTH1進(jìn)行了表達(dá)驗(yàn)證，最終針對(duì)雙敲除菌株表達(dá)該蛋白進(jìn)行了發(fā)酵培養(yǎng)基配比優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 主要材料

谷氨酸棒桿菌CGMCC1.15647、大腸桿菌DH5α，由本實(shí)驗(yàn)室保存；谷氨酸棒桿菌C.g15647ΔNCgl0909，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；本文中所用的引物全部由蘇州金唯智公司合成，如表1所列；EcoR I、Hind Ⅲ、XbaⅠ、SmaⅠ等本研究所用到的限制性內(nèi)切酶，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司(Thermo Fisher Scientific)；高保真酶PrimerSTAR Max Premix、Ligation連接酶，大連寶生物有限公司(TaKaRa)。

表1 引物序列Table 1 Primers sequence

1.2 敲除菌株的構(gòu)建

利用同源重組的方法對(duì)谷氨酸棒桿菌野生型菌株的目的基因進(jìn)行敲除。以谷氨酸棒桿菌的基因組為模板，用引物Ko-gene-LF，Ko-gene-LR和Ko-gene-RF，Ko-gene-RR分別擴(kuò)增左右同源臂。驗(yàn)證條帶大小正確無(wú)誤后，使用純化試劑盒回收得到左同源臂和右同源臂。再以回收后的左右同源臂為模板PCR擴(kuò)增，回收得到左右同源臂無(wú)縫連接的融合片段。最后雙酶切融合片段和載體pK18得到線性化的載體和具有相同黏性末端的同源修復(fù)片段，連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌。

1.3 敲除菌株的篩選

(1)將平板上長(zhǎng)出的單菌落同時(shí)點(diǎn)在LBB+K和LBB+K+蔗糖的平板上進(jìn)行蔗糖敏感性篩選，在30 ℃培養(yǎng)箱里倒置培養(yǎng)24 h，挑選對(duì)應(yīng)的在LBB+K+蔗糖不長(zhǎng)的但在LBB+K上長(zhǎng)的菌落，接種于LBB液體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)16 h；

(2)將菌液轉(zhuǎn)接到LBB+蔗糖的液體培養(yǎng)基中，在30 ℃培養(yǎng)16 h后劃線到LBB+蔗糖固體平板上；

(3)挑取LBB+蔗糖固體平板上長(zhǎng)出來(lái)的劃線單菌落，分別點(diǎn)到LBB和LBB+K固體平板上，挑選LBB平板上對(duì)應(yīng)在LBB+K上不長(zhǎng)的單菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證；

(4)使用敲除驗(yàn)證引物Ko-gene-LF、Ko-gene-RR作為PCR驗(yàn)證引物，對(duì)照為野生型菌株，通過凝膠電泳驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶大小。

1.4 谷氨酸棒桿菌表達(dá)目的蛋白

在30 ℃，220 r/min搖床中培養(yǎng)種子液14 h，按接種量1%轉(zhuǎn)接后加入誘導(dǎo)劑IPTG(終質(zhì)量濃度為24 g/mL)，培養(yǎng)24 h，收獲菌體和上清液用于后續(xù)的測(cè)定實(shí)驗(yàn)。

1.5 發(fā)酵樣品的SDS-PAGE和Western blot驗(yàn)證

(1)取發(fā)酵全菌，破碎上清液分別與5×的Loading Buffer預(yù)混合完全，放置于100 ℃的沸水浴中保溫5 min，取出后冷卻2 min進(jìn)行電泳，120 V電泳連續(xù)跑90 min。結(jié)束后倒入考馬斯亮藍(lán)染色液進(jìn)行染色15 min，之后加入脫色液重復(fù)脫色直至背景清晰用凝膠成像儀拍照。

(2)根據(jù)蛋白Marker的條帶和目的蛋白大小切下膠條，采用濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，放置順序?yàn)樨?fù)極-濾紙-膠條-聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜-濾紙-正極，切下對(duì)應(yīng)大小的PVDF膜先用甲醇活化5 s，濾紙、膠條、PVDF膜都事先在濕轉(zhuǎn)緩沖液中浸濕，轉(zhuǎn)膜條件為恒流300 mA，90 min。將轉(zhuǎn)好的PVDF膜用TBST洗5 min后加到5%牛奶中置于水平搖床封閉1 h，TBST洗1遍后加到含萬(wàn)分之一抗體的5%牛奶中置于水平搖床孵育1 h，TBST洗3遍，用ECL顯色盒進(jìn)行顯色。

1.6 蛋白hMTH1的酶活性檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)所用人8-羥基鳥嘌呤核苷酸酶(hMTH1)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒購(gòu)于江萊生物。取菌體量為10的新鮮收獲的發(fā)酵液12 000 r/min，離心2 min，棄上清液，菌體用PBS緩沖液洗3次，最后用1 mL的PBS重懸菌體，使用超聲波破碎儀破菌，功率為25%，程序設(shè)定為每破碎1 s停止2 s，總共破碎6 min至破碎液澄清透明后立即放于冰上，4 ℃，12 000 r/min，離心2 min，取上清液作為待檢測(cè)的蛋白樣品。將準(zhǔn)備好的蛋白樣品和標(biāo)準(zhǔn)品各50 μL按順序加入96孔酶標(biāo)板，然后分別加入帶有辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標(biāo)記的檢測(cè)抗體100 μL，并在37 ℃恒溫孵育60 min，棄去液體后用洗滌液重復(fù)5次洗凈酶標(biāo)板，每孔加入底物后在37 ℃避光孵育15 min。最后加入終止液后在450 nm處測(cè)定OD值并繪制曲線，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組有3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因NCgl2632的生物信息學(xué)分析

對(duì)基因NCgl2632進(jìn)行生物信息學(xué)分析，在NCBI的Genbank查詢得知該基因長(zhǎng)度為561 bp，通過CD seach分析發(fā)現(xiàn)沒有類似的保守區(qū)域，也沒有發(fā)現(xiàn)跨膜結(jié)構(gòu)域及糖基化位點(diǎn)。通過疏水性分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白偏向親水。該基因所編碼的蛋白質(zhì)長(zhǎng)度為186個(gè)氨基酸，蛋白大小為21 kDa，正負(fù)電荷殘基總數(shù)都為19，理論等電點(diǎn)PI值為7.06，通過蛋白質(zhì)二維結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)有47個(gè)氨基酸形成α螺旋，占25.27%；12個(gè)氨基酸形成β轉(zhuǎn)角，占6.45%；52個(gè)氨基酸形成延伸鏈，占27.96%；75個(gè)氨基酸形成無(wú)規(guī)則折疊，占40.32%。通過swiss-model對(duì)該蛋白進(jìn)行三維建模，結(jié)果如圖1所示。NCBI對(duì)該蛋白的注釋為乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶。

a-蛋白序列分析；b-蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析；c-蛋白疏水性分析；d-蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)建模圖1 NCgl2632基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析Fig.1 Bioinformatics analysis of the protein encoded by the gene NCgl2632

2.2 基因NCgl2632的過表達(dá)和敲除對(duì)生長(zhǎng)水平和胞內(nèi)ATP水平的影響

分別以質(zhì)粒pECXK99E為過表達(dá)基因的表達(dá)載體，質(zhì)粒pK18 mobsacB為同源重組敲除基因的自殺質(zhì)粒，成功構(gòu)建了基因NCgl2632的過表達(dá)和敲除菌株。將得到的菌株進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，對(duì)48 h內(nèi)菌株生長(zhǎng)的OD600值和胞內(nèi)ATP進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)以谷氨酸棒桿菌野生型和帶有質(zhì)粒pECXK99E的菌株為對(duì)照組，結(jié)果如圖2、圖3所示。

由圖2可知，基因過表達(dá)菌株與加入pECXK99E空載體的野生型對(duì)照相比生長(zhǎng)曲線差異不大，而基因敲除菌株與野生型對(duì)照相比生長(zhǎng)穩(wěn)定期時(shí)的最大菌體濃度略有提升。

由圖3可知，基因過表達(dá)和敲除菌株和對(duì)照相比胞內(nèi)ATP水平都沒有明顯變化。

圖2 NCgl2632基因不同表達(dá)水平的菌株生長(zhǎng)曲線Fig.2 The growth curve of the mutant strains of the gene NCgl2632注：WT：野生型C.g 15647；ΔNCgl2632:C.g 15647ΔNCgl2632;WT+pECXK99E；加入過表達(dá)質(zhì)粒pECXK99E空載體的野生型C.g 15647；Over-NCgl2632：C.g 15647-Over-NCgl2632(下同)

圖3 NCgl2632基因不同表達(dá)水平菌株的胞內(nèi)ATP水平Fig.3 Intracellular ATP level of the mutant strains of the gene NCgl2632

2.3 基因NCgl2632的過表達(dá)和敲除對(duì)蛋白增強(qiáng)綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein, eGFP)和重鏈抗體可變區(qū)(variable domain of heavy chain antibody，VHH)表達(dá)的影響

增強(qiáng)型綠色熒光蛋白eGFP作為最常見的模式蛋白，可以很方便地驗(yàn)證菌株表達(dá)外源蛋白的強(qiáng)弱。圖4為基因NCgl2632的過表達(dá)和敲除菌株表達(dá)胞內(nèi)eGFP得到的熒光強(qiáng)度比較?？梢钥闯鲞^表達(dá)基因NCgl2632和加空載的野生型對(duì)照相比熒光強(qiáng)度有明顯下降，而敲除基因的重組菌株與野生對(duì)照相比差距并不大。

圖4 NCgl2632基因不同表達(dá)水平菌株的胞內(nèi)eGFP熒光強(qiáng)度Fig.4 Intracellular eGFP fluorescence intensity of the mutant strains of the gene NCgl2632

同時(shí)，我們還選取了誘導(dǎo)型VHH蛋白來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證。圖5為基因NCgl2632的過表達(dá)和敲除菌株表達(dá)VHH得到的SDS-PAGE和Western blot結(jié)果圖。

分析結(jié)果可以看出，單獨(dú)敲除基因NCgl2632和野生型相比，表達(dá)分泌VHH的能力有明顯增強(qiáng)，而過表達(dá)基因NCgl2632和加空載的對(duì)照相比表達(dá)能力略有降低。

M-marker；1-表達(dá)VHH蛋白的野生型C.g 15647；2-表達(dá)VHH蛋白的C.g 15647ΔNCgl2632；3-表達(dá)VHH蛋白的加空載pECXK99E的野生型；4-表達(dá)VHH蛋白的C.g 15647-Over-NCgl2632；5-陰性對(duì)照?qǐng)D5 SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)NCgl2632基因不同表達(dá)水平菌株發(fā)酵上清液中VHH的表達(dá)情況Fig.5 SDS-PAGE and Western blot for VHH expression in fermentation supernatant of mutant strains with different expression levels of the gene NCgl2632

綜上，通過檢測(cè)基因NCgl2632改造菌株中外源蛋白表達(dá)能力的變化，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)菌株表達(dá)蛋白的能力并沒有提升，而敲除菌株在表達(dá)分泌VHH蛋白時(shí)表達(dá)量提高。因此，我們推測(cè)敲除該基因會(huì)降低胞內(nèi)乙酰輔酶A酰基轉(zhuǎn)移酶的含量，從而將浪費(fèi)在合成乙酰乙酰輔酶A的乙酰輔酶A釋放到三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循環(huán)中，為合成氨基酸提供更多的底物，從而提升外源蛋白的產(chǎn)量。

2.4 基因NCgl2632和基因NCgl0909的雙敲除對(duì)VHH和hMTH1的表達(dá)影響

在實(shí)驗(yàn)室前期工作中分析NCgl0909可能也是影響外源蛋白表達(dá)的關(guān)鍵基因之一[3]，而后續(xù)的實(shí)驗(yàn)表明基因NCgl0909負(fù)責(zé)編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體，參與谷氨酸棒桿菌中特定底物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，并且發(fā)現(xiàn)基因NCgl0909的敲除表型比較有利于外源蛋白表達(dá)水平的提高[22]。

因此，本實(shí)驗(yàn)中同時(shí)對(duì)基因NCgl2632和基因NCgl0909進(jìn)行了共同改造，選取了NCgl0909的現(xiàn)有敲除菌株作為出發(fā)菌株構(gòu)建了C.g15647NCgl2632ΔNCgl0909雙敲除菌株，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了VHH的表達(dá)菌株。圖6為C.g15647NCgl2632和C.g15647ΔNCgl2632ΔNCgl0909表達(dá)VHH得到的SDS-PAGE和Western blot結(jié)果圖。

通過分析得知，雙敲除菌株表達(dá)分泌VHH的能力比單獨(dú)敲除NCgl2632和單獨(dú)敲除NCgl0909的菌株都強(qiáng)。

M-marker；1-陰性對(duì)照；2-表達(dá)VHH蛋白的野生型C.g 15647；3-表達(dá)VHH蛋白的C.g 15647ΔNCgl2632；4-表達(dá)VHH蛋白的C.g 15647ΔNCgl0909；5-表達(dá)VHH蛋白的C.g 15647ΔNCgl2632ΔNCgl0909圖6 SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)基因NCgl2632和基因NCgl0909雙敲除菌株發(fā)酵上清液中VHH的表達(dá)情況Fig.6 SDS-PAGE and Western blot for VHH expression in fermentation supernatant of C.g 15647ΔNCgl2632ΔNCgl0909

為了進(jìn)一步驗(yàn)證雙敲除菌株對(duì)外源蛋白表達(dá)方面有利影響的普適性，這里選用一種大小為23.5 kDa左右的新蛋白hMTH1進(jìn)行表達(dá)測(cè)試。構(gòu)建了pXMJ19-hMTH1的表達(dá)質(zhì)粒，30 ℃發(fā)酵24 h后取全菌和破碎上清液進(jìn)行了SDS-PAGE和Western blot分析。圖7為C.g15647ΔNCgl2632ΔNCgl0909雙敲除菌株表達(dá)hMTH1得到的SDS-PAGE和Western blot結(jié)果圖。

根據(jù)Western blot結(jié)果可以得知，雙敲除菌株表達(dá)hMTH1的能力比單獨(dú)敲除NCgl2632和單獨(dú)敲除NCgl0909的菌株都強(qiáng)。

2.5 hMTH1蛋白活性的檢測(cè)

使用hMTH1酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒對(duì)改造后谷氨酸棒桿菌中發(fā)酵的hMTH1進(jìn)行活性檢測(cè)，通過捕獲抗體包被微孔板，制成固相抗體，并加入樣品與HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物顯色。底物在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)OD值作縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組包含3個(gè)平行數(shù)據(jù)，以稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)樣品作為空白對(duì)照。如圖8所示，最終測(cè)出野生型谷氨酸棒桿菌中發(fā)酵液的破碎上清液中蛋白hMTH1的活性為32.3 U/L，而雙敲除菌株的破碎上清液中蛋白hMTH1的活性為43.4 U/L。

M-marker；1-陰性對(duì)照的破碎全菌；2-表達(dá)hMTH1蛋白的野生型C.g 15647的破碎全菌；3-表達(dá)hMTH1蛋白的C.g 15647ΔNCgl2632的破碎全菌；4-表達(dá)hMTH1蛋白的C.g 15647ΔNCgl0909的破碎全菌；5-表達(dá)hMTH1蛋白的C.g 15647ΔNCgl2632ΔNCgl0909的破碎全菌;6-陰性對(duì)照的破碎上清液；7-表達(dá)hMTH1蛋白的野生型C.g 15647的破碎上清液；8-表達(dá)hMTH1蛋白的C.g 15647ΔNCgl2632的破碎上清液；9-表達(dá)hMTH1蛋白的C.g 15647ΔNCgl0909的破碎上清液；10-表達(dá)hMTH1蛋白的C.g 15647ΔNCgl2632ΔNCgl0909的破碎上清液圖7 SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)基因NCgl2632和基因NCgl0909雙敲除菌株發(fā)酵全菌和破碎上清液中hMTH1的表達(dá)情況Fig.7 SDS-PAGE and Western blot for hMTH1 expression in fermented bacteria and crushed supernatant of the gene NCgl2632 and gene NCgl0909 co-knockout strain

陰性對(duì)照-稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)樣品；WT+hMTH1-表達(dá)hMTH1的野生型C.g 15647；ΔNCgl2632ΔNCgl0909+hMTH1-表達(dá)hMTH1的C.g 15647ΔNCgl2632ΔNCgl0909圖8 雙敲除菌株的破碎上清液中蛋白hMTH1的活性Fig.8 Enzyme activity of protein hMTH1 in the crushed supernatant of the co-knockout strain

2.6 hMTH1蛋白的發(fā)酵培養(yǎng)基配比優(yōu)化

通過上述實(shí)驗(yàn)可以得到用NCgl2632和NCgl0909雙敲除菌株表達(dá)hMTH1蛋白的產(chǎn)量相比野生型有較大提高，可以在此菌株的基礎(chǔ)上對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，以得到更高的蛋白表達(dá)量。谷氨酸棒桿菌細(xì)胞生長(zhǎng)和外源蛋白的表達(dá)需要合適的培養(yǎng)基碳氮濃度和碳氮比，碳氮比過高可能會(huì)導(dǎo)致代謝不平衡，碳氮比過低容易導(dǎo)致菌體自溶。

通過篩選，確定了葡萄糖、玉米粉作為碳源，硫酸銨、尿素作為氮源，對(duì)選定的4個(gè)因素，設(shè)定了2個(gè)濃度梯度水平，分別是葡萄糖質(zhì)量濃度80、120 g/L，玉米粉質(zhì)量濃度5、10 g/L，硫酸銨質(zhì)量濃度20、30 g/L，尿素質(zhì)量濃度0、10 g/L。使用JMP軟件中的定制設(shè)計(jì)對(duì)4個(gè)因子2個(gè)水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到12組實(shí)驗(yàn)組合，以終生物量OD600值和單位OD值目標(biāo)蛋白hMTH1的相對(duì)蛋白量為響應(yīng)變量。

按照設(shè)計(jì)配制不同營(yíng)養(yǎng)成分配比的培養(yǎng)基，不同培養(yǎng)基中分別接種C.g15647ΔNCgl2632ΔNCgl0909-hMTH1，30 ℃，200 r/min，發(fā)酵48 h后取樣分別測(cè)定菌體OD600值，結(jié)果如表2所示。取菌體量OD值為10的菌液進(jìn)行破碎，取破碎液上清液進(jìn)行Western blot檢測(cè)，使用ImageJ軟件對(duì)Western blot結(jié)果進(jìn)行灰度分析，計(jì)算得到單位OD值的hMTH1蛋白量，結(jié)果如表2所示。第1種模式的情況下菌體的OD600值最高，為12.4，且單位OD值下的hMTH1蛋白量最高為1.875。對(duì)照組為使用基礎(chǔ)LBB培養(yǎng)基在相同的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)的相同改造菌株，對(duì)照組的OD600值為9.68，單位OD值的蛋白表達(dá)量為1，第1種模式下的hMTH1蛋白表達(dá)量是對(duì)照組的1.875倍。

表2 培養(yǎng)基成分優(yōu)化參數(shù)實(shí)驗(yàn)Table 2 Experimental of optimization parameters of medium composition

用JMP軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)最小二乘法擬合模型分析，可得到參數(shù)估計(jì)值如表3所示，概率表征了各因素對(duì)結(jié)果的影響程度，當(dāng)概率<0.05時(shí)為顯著影響，當(dāng)概率<0.01時(shí)為極顯著影響。由表3可知尿素的概率為0.002 7，說(shuō)明影響效果最為顯著，葡萄糖概率為0.150 5，效果第二顯著，玉米粉的t比為負(fù)數(shù)說(shuō)明與結(jié)果負(fù)相關(guān)，同時(shí)概率最大為0.874 7說(shuō)明影響最不顯著。

表3 培養(yǎng)基成分優(yōu)化參數(shù)篩選結(jié)果Table 3 Medium component optimization parameter screening result

由圖9培養(yǎng)基成分優(yōu)化參數(shù)預(yù)測(cè)圖可知，葡萄糖含量增加對(duì)響應(yīng)值有不明顯的增加，而尿素則會(huì)對(duì)2種響應(yīng)值有較強(qiáng)的正向促進(jìn)影響，玉米粉和硫酸銨的濃度增加對(duì)OD值和蛋白量的影響都很微弱。

綜上，培養(yǎng)基的成分配比可以確定為葡萄糖質(zhì)量濃度為120 g/L，玉米粉質(zhì)量濃度5 g/L，硫酸銨質(zhì)量濃度30 g/L，尿素質(zhì)量濃度10 g/L。選用優(yōu)化后的培養(yǎng)基進(jìn)行hMTH1的發(fā)酵，宿主菌為C.g15647ΔNCgl2632ΔNCgl0909，發(fā)酵條件為100 mL培養(yǎng)基在30 ℃、220 r/min下?lián)u瓶培養(yǎng)48 h。使用hMTH1酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒對(duì)菌體的破碎上清液進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)hMTH1的活性為60.2 U/L。

圖9 培養(yǎng)基成分優(yōu)化參數(shù)預(yù)測(cè)刻畫圖Fig.9 Medium composition optimization parameter prediction characterization

3 討論

基因NCgl2632的單獨(dú)改造對(duì)谷氨酸棒桿菌的發(fā)酵過程中生理參數(shù)的影響并不大，但這并不能說(shuō)明該基因?qū)劝彼岚魲U菌基因組的優(yōu)化毫無(wú)作用，該基因編碼的乙酰輔酶A酰基轉(zhuǎn)移酶雖然會(huì)影響胞內(nèi)乙酰輔酶A的含量，進(jìn)而會(huì)使TCA循環(huán)的乙酰輔酶A通量產(chǎn)生變化，但由于細(xì)胞本身的代謝調(diào)控機(jī)制過于復(fù)雜，少量代謝中間物的通量變化可能會(huì)由別的通路代償；而谷氨酸棒桿菌野生型菌株中由于缺乏PHB合成酶基因，無(wú)法產(chǎn)生PHB，所以乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶所催化的PHB合成反應(yīng)在野生型菌株中是被阻斷的，因此該基因改造后的表型的整體生長(zhǎng)狀態(tài)差別不大，但通過幾種不同的外源蛋白表達(dá)來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)，總體來(lái)說(shuō)可以推論敲除基因NCgl2632對(duì)類似大小的外源蛋白產(chǎn)量提升是有有利影響的。

同時(shí)由于實(shí)驗(yàn)室的前期工作中發(fā)現(xiàn)了NCgl0909的敲除表型也是有利于外源蛋白產(chǎn)量提升，因此我們構(gòu)建了2個(gè)基因的共敲除菌株以獲得更優(yōu)蛋白表達(dá)宿主，并選擇了新蛋白hMTH1在多基因改造菌株對(duì)蛋白表達(dá)影響的普適性進(jìn)行了驗(yàn)證，最終對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化得到了最適合雙敲除菌株表達(dá)hMTH1的發(fā)酵培養(yǎng)基配比。

但是本文的研究存在很多不足，例如：雖然我們知道了敲除基因NCgl2632對(duì)蛋白表達(dá)有一些有利影響，但是并沒有深入研究具體的代謝調(diào)控機(jī)制，只能針對(duì)結(jié)果進(jìn)行相應(yīng)的分析。此外，由于實(shí)驗(yàn)條件的限制，本文只是將hMTH1在胞內(nèi)上清液中進(jìn)行了可溶表達(dá)，如何將它分泌出胞外并增大該蛋白的表達(dá)量有待在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中近一步研究。